Este documento describe los métodos y técnicas básicas para el cultivo celular, incluyendo el equipo necesario, los tipos de cultivos (primarios y líneas estables), la preparación del medio de cultivo, y los procedimientos para el mantenimiento y almacenamiento de líneas celulares. Explica conceptos como la asepsia, subcultivos, curvas de crecimiento celular, y los requisitos físico-químicos del medio de cultivo para diferentes tipos de células.

1. Cultivos Celulares Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular

2. Objetivos -Equipo básico de un laboratorio de cultivo celular -Cultivos primarios y líneas estables -Preparación del medio de cultivo -Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad -Rutina en el mantenimiento de la línea celular estable -Congelación y almacenamiento de las líneas celulares Puntos que deben ser asimilados

3. Microscopio Invertido Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación, contaminación. Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.

4. Botellas y Placas de Cultivo

5. Puntos Importantes Esterilidad Asepsia Hábito de trabajo

6. Cultivos Primarios (El principio de la historia.....) A- Aislamiento del tejido B- Disección/disgregación C- Cultivo celular en recipiente (Placa Petri) (Cultivo primario) Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.

7. Preparación cultivos

8. Cultivos secundarios y líneas estables Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinará qué células se desarrollarán. Las líneas estables son las que se obtienen por sub-cultivo y selección de cultivos secundarios. También se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.

9. Selección de la línea estable

10. Líneas celulares estables Control del entorno celular Homogeneidad celular Conocimiento del tipo celular Economía Ventajas Desventajas Falta de diferenciación Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA)

11. Medios de Cultivo: Medios Base Medios base: Eagle’s Basal Medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI1640, etc. Contienen: Hidratos de Carbono, ácidos grasos esenciales y otros lípidos, aminoácidos, sales minerales, oligoelementos. *Cada línea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio

12. Medios de Cultivo: Aditivos Antibióticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos) Tampón pH: Hepes, bicarbonato, etc. Indicador pH. Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2-50%). Aditivos específicos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc.

13. Propiedades físico-químicos del Medio CO 2 : Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO 3 - ] pH .............................................................(7.0-7.7) Osmolaridad .............................................(290-320) mOsm/Kg Viscosidad ................................................ Suero Temperatura ............................................. 37ºC (mamífero) (aves: 38,5ºC; epitelio de ratón: 33ºC; insectos: 28ºC)

14. Test de medio completo con suero Previamente a la realización de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles. Posible Contaminación Niveles de Proliferación Celular (eficiencia)

15. Elección del medio de cultivo adecuado a cada línea celular Se deben realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la elección del medio más adecuado a las características de nuestra línea. Las pruebas consisten en la realización de diferentes curvas de crecimiento

16. Conceptos básicos en el mantenimiento de una línea estable Subcultivo Confluencia Tiempo de duplicación Criogenización Ciclo celular: Fases G 1 ,S,G 2 ,M y G 0

17. ¿Qué son y cómo se realizan los subcultivos? Objetivos: Propagación de la línea celular Producción de células para la experimentación Usualmente se realizan al llegar a c onfluencia. Evitar que el medio de cultivo esté agotado.

18. Curva de Crecimiento (líneas estables): Fases del cultivo Fase de latencia (período lag). Fijación al sustrato e inicio del ciclo celular. Fase de crecimiento exponencial . El número de células se duplica aproximadamente cada 24 horas. Fase de confluencia . Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio). Fase de muerte . Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.