Este documento presenta los fundamentos teóricos y aplicaciones prácticas de la electroforesis y la espectrofotometría. Explica los tipos de electroforesis como la electroforesis en geles de poliacrilamida y agarosa, y cómo se usan para separar moléculas como proteínas y ADN. También describe la ley de Lambert-Beer y cómo se usa la espectrofotometría para determinar concentraciones de solutos.

1. Universidad de Carabobo
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba”
Departamento de Bioquímica y Fisiología
Núcleo Aragua
Electroforesis y Espectrofotometría
 Univ. Wilson Torrealba.
 Univ. Paola Torres.
 Univ. Andrea Torres.
Grupo #08
Técnicas II
Septiembre, 2014.
Profesora: Fabiola Sarco-Lira.

2. Agenda
 Analizar los fundamentos teóricos de la Electroforesis y su utilidad:
 Movimiento iónico en un campo eléctrico, proceso electroforético, cámara
electroforética, materiales de soporte y utilidad de cada una de ellas.
 Electroforesis en geles de Poliacrilamida.
 Electroforesis en geles de Poliacrilamida SDS.
 Electroforesis Bidimensional.
 Electroforesis en geles de Agarosa.
 Aplicar la Ley de Lambert y Beer para determinar la concentración de
un soluto en solución mediante Espectrofotometría:
 Fundamentos Teóricos de la Espectrofotometría.
 Espectro de Absorción. Utilidad.
 Ley de Lambert y Beer. Curvas de Calibración. Problemas.

3. Electroforesis
Es una técnica de separación que consiste en la migración de partículas cargadas
sometidas a la influencia de un campo eléctrico, de tal forma que las moléculas con
carga positiva migran al cátodo (electrodo con carga negativa) y las moléculas con carga
negativa migran al ánodo (electrodo con carga positiva).
 Método Analítico.
 Calcular el peso
molecular de una
proteína.
 Distinguir moléculas por
su carga neta o forma.
 Detectar cambios de
aminoácidos, de restos
polares o no polares y
viceversa.
 Para separar
cuantitativamente
distintas especies
moleculares.
Tomado de: Principios de
Bioquímica Lehninger
μ: Movilidad Electroforética.
E (potencial eléctrico): La fuerza
que mueve la macromolécula.
V: Velocidad que mueve la
partícula.
Z: Carga neta de la molécula.
f: Coeficiente friccional.

4. Tomado de: Electrophoresis in
Practice, Reiner Westermeier.
Electroforesis de Límite Móvil (moving
boundary electrophoresis): Una mezcla de
proteínas por ejemplo, se coloca en una
célula de observación en forma de U llena
con una solución buffer y al final del cual
son introducidos los electrodos
Arne Tiselius (1902 – 1971),
ganador del premio Nobel de
Química en 1948 por eso y por
su trabajo de los análisis de
absorción.

5. Tipos de Electroforesis
 De Frente Móvil: Las macromoléculas de la muestra están presentes en toda la
disolución y su posición se determina en función del tiempo por óptica de Schlieren.
Esta técnica analítica ha sido utilizada principalmente para la determinación de las
movilidades y puntos isoeléctricos de las proteínas.
 Zonal: La muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a
través de un disolvente, utilizando además un medio que soporta a éste (tal como el
papel o ciertos tipos de geles). En este caso no se determina la cuantitativa de la
movilidad, sino que el objetivo de esta técnica se basa en analizar mezclas, la pureza
de una mezcla y la purificación de sustancias, y para detectar cambios de movilidad o
conformación.
 Continua: La muestra se aplica también en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso.

6. Proceso Electroforético

7. Cámara Electroforética
El dispositivo donde tiene lugar la electroforesis propiamente dicha se denomina cubeta
electroforética o cámara electroforética, en él se introducen el medio de soporte de las
muestras en la que se producirá la separación electroforética, y el medio o tampón de
electroforesis, que debe encontrarse en contacto con los electrodos (cátodo y ánodo) y
bañar el sistema.
Unidad Horizontal Unidad Vertical
Unidad de Varios Geles

8. Materiales de Soporte
 Papel y Film: Se suelen utilizar
para polisacáridos de gran peso
molecular y lipopolisacáridos.
 Acetato de Celulosa: Es
principalmente usada para análisis
clínicos de rutina y aplicaciones
relacionadas para el análisis del
suero sanguíneo o de isoenzimas.
 Geles: Los más utilizados suelen
ser el almidón (son preparados
desde la hidrolización de el
almidón de una papa), la agarosa
(análisis de moléculas de unos
10nm de diámetro) y la
poliacrilamida.
Tomado de: Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular, David
Freifelder.
Tomado de:
Electrophore
sis in
Practice,
Reiner
Westermeier
.

9. Tintes de Alta Movilidad
Electroforética
 Verde de Bromocresol.
 Pironina.
 Azul de Metileno.
 Azul de Bromofenol.
 Xylenecyanol.
 Naranja G

10. Electroforesis en Geles de
Poliacrilamida (PAGE)
La poliacrilamida es un polímero que se obtiene
por medio de la co-polimerización de los
monómeros de acrilamida con un entrecruzado
reactivo (bisacrilamida o N,N'-
metilenbisacrilamida). Reemplazaron
ampliamente a los geles de almidón por su mejor
efecto como tamiz molecular, por proporcionar el
control del tamaño de sus poros y porque no
presentaba una gran adsorción del material
proteico.
Tomado de: Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular, David
Freifelder.
Raymond, S. y Weintraub, L.
(1959)

11. Tomado de: Electrophoresis in
Practice, Reiner Westermeier.

12. Electroforesis con geles en de
poliacrilamida en placa:
 La polimerización del gel se
lleva a cabo directamente en el
aparato.
 Durante la misma se coloca un
molde de forma adecuada en la
parte superior para conseguir
las hendiduras en donde se
situaran las muestras.
 Después de la electroforesis, se
puede teñir la placa añadiendo
colorante al depósito superior
de la disolución tampón.
Tomado de: Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular, David
Freifelder.

13. Tomado de: Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular, David
Freifelder.
Electroforesis con geles en de
poliacrilamida en columna:
 La polimerización del gel tiene lugar
directamente en la columna y esta se
coloca entre los depósitos de tampón.
 La muestra se suspende en una
disolución concentrada de sacarosa y se
deposita sobre el gel.
 Después de la electroforesis, se saca el
gel de la columna y se somete a una
determinada tinción.

14. Electroforesis en Geles de
Poliacrilamida SDS
Tomado de: Electrophoresis in
Practice, Reiner Westermeier.
 El Dodecilsulfato Sódico (SDS por sus siglas
en inglés, sodium dodecyl sulphate) es un
detergente anionico.
 Separa las proteínas en función de su masa
molecular.
 Puede ser usada para la estimación de la masa
molecular de una proteína.
 Se suele usar en combinación con el
mercaptoetanol.
 Se utiliza con colorantes como el azul de
Coomasie.

15. Tomado de: Principios de
Bioquímica Lehninger
1. Se cargan diferentes muestras en los
pocillos o depresiones en la parte
superior de un gel de poliacrilamida
SDS.
2. Las proteínas se trasladan a través
del gel cuando se aplica un campo
eléctrico.
3. Después de la electroforesis, se
visualizan las proteínas al tratar el
gel con Azul de Coomassie y cada
banda de gel representa una proteína
diferente (o una subunidad
proteica).
Electroforesis PAGE – SDS para la
purificación de la enzima ARN
polimerasa de la bacteria E. coli

16. Tomado de: Principios de
Bioquímica Lehninger
Estimación de la masa molecular de
una proteína por PAGE – SDS:
 Las proteínas patrón de masa
molecular conocida se someten al
proceso de electroforesis y tinción
en el primer carril.
 La proteína de masa molecular
desconocida se somete al proceso
de electroforesis PAGE – SDS y
tinción en el segundo carril.
 Se realiza una gráfica del LogM de
las proteínas marcadoras, lo que
permitirá leer la masa molecular de
la proteína desconocida a través de
ella.

17. Enfoque Isoeléctrico
Técnica variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente
de pH fijado en su estructura y es utilizado para determinar el punto isoeléctrico de una
proteína. Además, al utilizarse en una muestra con distintas proteínas, las separa según
su pI y no su masa molecular como otras técnicas.
http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

18. Electroforesis Bidimensional
Método electroforético que se
utiliza para separar proteínas
de masa molecular idéntica
que difieren en su punto
isoeléctrico o proteínas con
puntos isoeléctricos similares,
pero diferentes masas
moleculares.
Enfoque Isoeléctrico
http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm
+
Electroforesis con
SDS

19. Electroforesis en Geles de
Agarosa
Tomado de: Electrophoresis in
Practice, Reiner Westermeier.
 La agarosa es un polisacárido obtenido de las
algas rojas.
 Se utiliza para grandes moléculas de ADN y
ARN, previamente fragmentadas.
 Se conoce como “Electroforesis Horizontal
Submarina”.
 Separa los fragmentos de ADN o ARN de
acuerdo con su longitud en pb (número de
pares de base).
 Se requieren colorantes como Azul de
Bromofenol y Xileno Cianol.

20. 1. Se añade el tampón
electroforético en
conjunto con el gel de
agarosa a la cámara
electroforética.
2. Luego, se añade la
muestra preparada en
conjunto con el tinte y
se comienza el proceso
de electroforesis.
3. Se visualizan los
fragmentos de ADN
mediante luz UV.
http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

21. ESPECTROFOTOMETRÍA

22. Es Importante hablar de
algunos términos primero
Luz

23. Es Importante hablar de algunos
términos primero
Color

24. Es Importante hablar de
algunos términos primero
Reflexión

25. Es Importante hablar de
algunos términos primero
Dispersión

26. -
Ley de Lambert y Beer
La cantidad de luz que sale de una muestra es disminuida
por tres fenómenos físicos:
1._La cantidad de material de absorción en su trayectoria
(concentración)
2._La distancia que la luz debe atravesar a través de la
muestra (distancia de la trayectoria óptica)
3._La probabilidad de que el fotón de esa amplitud
particular de onda sea absorbido por el material
(coeficiente de extinción molar)

27. Instrumentos para
la Medición de la Absorbancia
de Luz Visible y Ultravioleta

28. Factores que afectan las
propiedades de Absorción de un
Cromóforo
Efectos del pH
Efectos de la Polaridad
Efectos de la Orientación

29. Máximos de Absorción (λmáx.) y coeficientes de extinción
molar (ε) a pH neutro de varias sustancias, frecuentes en
los estudios biológicos.
Tomado de Serie de Biología Fundamental – Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. D. Freifelder

30. Problemas
1) Curva de Calibración:
Se realizaron dos diluciones iguales a partir de una muestra problema, al medir
la Absorbancia de estas soluciones problema se obtuvo 0,180 y 0,195, lo que
promedia 0,188.
Este valor será el utilizado para calcular la concentración de la solución.

31. Absorbancia
Concentración
Interpolando el Gráfico
O
con la Ecuación de la
Recta
Tomando dos puntos:
A (1,5 – 0,05)
B (7 – 0,237)
Calcular la concentración del soluto
A
B

32. 2) El porcentaje de Tramitancia de una solución
intensamente coloreada es 8,4%
¿Cuál es su Absorbancia?
3) Una solución colocada en una cubeta de 1 cm
transmite 50% de la luz de una cierta longitud
de onda.
¿Qué porcentaje se transmitiría (a) en una
cubeta de 4 cm, (b) en una cubeta de 0,5 cm?

33. Referencias Bibliográficas
Libros:
 Freifelder, David. Técnicas de bioquímica y biología molecular. 2ª ed.
Barcelona: Reverté, 2003.
 Nelson, David; Cox, Michael. Lehninger: Principios de bioquímica. 5ª ed.
Barcelona: Omega, 2007.
 Roca, Pilar; Oliver, Jordi; Rodríguez, Ana. Bioquímica. Técnicas y métodos.
Madrid: Helice, 2003.
 Westermeier, Reiner. Electrophoresis in Practice. 4ª ed. Alemania: Wiley-VCH,
2005.
Páginas Web:
 Herráez, Ángel. Electroforesis de proteínas y de ácidos nucleicos [en línea].
Madrid, 2009. [Consulta: 14 de Septiembre 2014]. Disponible en:
http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm