Dinámica de la ecología microbiana durante la fermentación y secado del cacao: hacia la identificación de marcadores moleculares  

1. UNIVERSIDAD TECNICA ESTATAL DE QUEVEDO
ESCUELA PARA EL DESARROLLO AGROINDUSTRIAL
Carrera de Ingeniería Agroindustrial
TRABAJO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
TEMA:
ARTICULO CIENTIFICO:
Dinámica de la ecología microbiana durante la fermentación y secado del cacao: hacia la
identificación de marcadores moleculares

2. INTRODUCCION
Los pasos en la producción del
cacao, son la fermentación,
secado y tostado.
La fermentación se lleva a
cabo en cajas, montones y
bandejas, de 4 a 6 días de
proceso de fermentación
En la fermentación comienza el
crecimiento de microorganismos,
contribuyen a la degradación del
mucilago pulpa que rodea a los
granos.
Las fases del cacao en el
proceso de fermentación son
fermentación alcohólica por
levaduras conversión de los
azucares en etanol.
La fermentación láctica, que
produce acido láctico a partir
de los azucares, impulsadas por
bacterias del acido láctico y
evitarlo para obtener cacao de
buena calidad.
La ultima fase de la
fermentación, las bacterias del
acido acético transforma al
alcohol en acido acético.
Luego de la fermentación los
granos son secados al sol, con el
fin de reducir el contenido de
humedad de aprox 60% a 7,5%.

3. MATERIALES Y METODOS
MUESTREO
Doscientas vainas de cacao fueron cosechadas y se recolectaron 80 kg de granos rodeadas de mucílago se
fermentaron en caja de madera durante 6 días, mezclado por mano a las 48 y 96 h de la fermentación, y
luego se secó durante 4 días
Se recogieron 800 g de muestra de cacao durante la fermentación en 3 intervalos de tiempo (2, 4 y 6 días).
Estos granos fermentado se secaron al sol durante 4 días.
También se recolectaron 200 g de cacao que fueron muestreados en 3 intervalos de tiempo (2, 3 y 4 días).
Las muestras se recogieron con guantes y colocado en bolsas estériles, y enviados inmediatamente por
avión a Montpellier (Francia) y se analizaron inmediatamente en laboratorios Cirad.

4. LA EXTRACCIÓN TOTAL DE ADN
Extracción de ADN de bacterias y levaduras se basa en el método de Ampe et al, la extracción se realizó por
duplicado.
Diez gramos de cacao en grano se
pusieron en tubos Falcón que
contienen 10 ml de agua de
peptona (Bioerieux m) y se mezcló
a temperatura ambiente durante
30 min en una rotación de rueda.
Dos mililitros de las suspensiones
resultantes se mezclaron con 0,3 g
de 0,5 mm de ácido diámetro
perlas de vidrio lavadas (Sigma-
eAldrich) en tubos Eppendorf.
La mezcla se agitó en vórtex
vigorosamente durante 2 minutos
en un instrumento batidor talón,
luego se centrifuga a 12.000g
durante 10 min.
La fase de capa se transfirió a un
nuevo tubo, y un segundo penol se
realizó la extracción de cloroformo,
600 metroL de cloroformo/iso-
alcohol amílico (24/1) seguido por
un 12.000 g centrifugación durante
10 min.
La fase acuosa se ​​recogió y 0.1
volumen de acetato de sodio (3 M,
pH 5) y un volumen igual de hielo
se añadieron isopropanol frío y se
almacena, cubrir en la noche a
20°C.
El día siguiente, los tubos se
centrifugaron a 12.000 g durante
30 min, a continuación, se
descartó el sobrenadante, pellets
de ADN se lavó con 500 metro L
70% de etanol

5. Después de 5 min de
centrifugación los sedimentos
de ADN se secaron al aire 1-2
h.
La cantidad y pureza del ADN
extraído fueron verificadas por
UV espectrofotómetro y por
electroforesis a través de un gel
de agarosa al 0,8%
Después funcionando a 100 V
durante 30 minutos, los geles se
tiñeron durante 15 min en una
solución de bromuro de etidio
(50 metro g ml-1; Promega).
se enjuagaron durante 5 min en agua
destilada, a continuación, observado y
fotografiado sobre un UV
transiluminador, usando una cámara
CCD en blanco y negro

6. PCR AMPLIFICACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO
Un fragmento de 160 pb de la región
variable V3 del 16S bacterianas ADNr se
amplificó utilizando gc-338f (5’-GCG CCG
CCG CGC GCG GCG GGC GGG GGG GCA
GCG CGG GGG GCA TCC TAC GGG CAG
AGGCAG-30 , Sigma) y 518r (50-ATT ACC
GCG TCG TCG GG-30, Sigma)
Con el fin de aumentar la especificidad de
la amplificación y para reducir la
formación de espuria subproductos, el
ADN se amplificó en una PCR
"touchdown" de la siguiente manera:
Se añadió al cebador hacia adelante con
el fin de asegurar que el fragmento de
ADN se mantendrá parcialmente de doble
varado y que la región es proyectado en la
fusión más bajo dominio.
94 °C durante 3 min, seguido por 10 ciclos
de desnaturalización a touchdown 94 °C
durante 1 min recocido a 65 °C (1er ciclo)
a 55 °C (10a ciclo) durante 1 min y
extensión a 72 °C durante 1 min, luego 25
ciclos de 94 °C durante 1 min, 55 °C
durante 1 min y 72 °C durante 1 min.

7. LA DESNATURALIZACIÓN GEL DEGRADADO ELECTROFORESIS ANÁLISIS (DGGE)
Los productos de PCR se analizaron por DGGE, mediante el uso de un Bio-Rad Dcode sistema de detección de
mutación universal.
Ampliaciones de PCR se cargaron
en 8% (w / v) geles de
poliacrilamida (acrilamida / N, N0 -
Bisacryla- metileno mide, 37.5 / 1,
Promega) en tampón 1x TAE.
Electroforesis experimentos se
realizaron a 60 °C utilizando una
gradiente desnaturalizante que van
desde 30 a 60% (100% corresponde
a M urea 7 (Promega) y 40% (v / v)
de formamida, Promega).
El gel se sometió a electroforesis a
20 V durante 10 min y después a 80
V durante 12 h.
Después de la electroforesis el gel se tiñó
durante 30 min en una solución de
bromuro de etidio (50 metro g ml -1 en 1
tampón ) y enjuagados durante 20 min en
agua destilada y luego fotografiado

8. PURIFICACIÓN Y LA IDENTIFICACIÓN DE BANDAS DE DGGE
Bandas detectadas se cortaron del gel de DGGE con un estéril bisturí.
El ADN de cada banda se efluyó en 100
metroL Tampón 4 °C Durante la noche
Seguido de una hora a 37 °C 100metro L
de DNA se efluyó de cada banda se
purificó mediante la adición de 300 metro
L de TE, 40 metro L de so acetato de Dium
(3 M, pH 5)
1 ml de etanol absoluto y se inculan a T
de 20 °C durante 30 min, luego se
centrifugó 12.000 g durante 15 min.
El sobrenadante se descartó, sedimentos
de ADN se lavaron con 500 metroL de
etanol 70% y después de 5 min de
centrifugación, el ADN gránulos se
secaron al aire para 1. 2 h.
Por último, se resuspendió el ADN en 50
metro L de agua molecular y se almacenó
a 4 °C. bacterias y levaduras ADN
purificado se amplificaron usando PCR-
338f y NL-1 (sin GC pinza) y 518r y LS-2
primeros respectivamente.
Ampliaciones de PCR fueron enviado para
la secuenciación en GATC Biotech
(Alemania).

9. RESULTADOS
Análisis de las comunidades bacterianas asociadas a los granos de cacao en cajas de madera de la fermentación y
el secado al sol.
Perfiles de DGGE se generaron a partir de ADN bacteriano extraído en diferentes pasos durante la fermentación del
cacao y el secado.
A los 2 días de
fermentación
Se observo 13 especies. La mayoría pertenecen a la familia de
Enterobacteriaceae y 9 especies que estaban presente durante la fermentación
Escherichia fergusonii (L)
Shigella dysenteriae (V)
Escherichia sp (U),
Escherichia albertii (I)Kluyevera cryocrescens (N) Escherichia albertii (I)
vagans Panteoa (t),Enterobacterias sp (R),
ptyseos terrea (O) Budvicia sp (M) Lactobacillus plantarum

10. A los 4 días de
fermentación fermentan Lactobacillus fermentum frijoles, (C),
Weeksella sp (E)
Enterobacter cloacae (F)
Acetobacter lovaniensis (H)
A los 6 días de
fermentación
Durante la etapa de secado (2, 3 y 4 días),
algunas bandas que eran presentes en (6-
día) los granos de cacao fermentados
seguían siendo detectables tales
como L. plantarum (A), K. cryocrescens
(N) y Weeksella sp (E).
En el secado, las bandas detectadas restantes
identificados como AAB, así como dos bandas
(no detectado previamente en fermentada Se
detectaron granos de cacao) y correspondían
a Gluconobacter xylinum (G) y (K) especies de
Clostridium sp.

11. Análisis de las comunidades de la levadura de los granos de cacao durante madera cajas de fermentación y secado al sol.
Una sola banda fue aislada en los
a Hanseniaspora opuntiae (A), que fue la
dominante especies a través de toda la
etapa de fermentación granos de cacao
frescos que correspondiente
Cuatro bandas fueron detectados e
identificados como Candida insectorum
(C), Pichia kudriavezii (D), galeiformis
Pichia (F) y grupo de especies Pichia 1 (E)
después de 2 días de fermentación.
Después de 4 días de fermentación, las
principales bandas (A), (C) y (D)
permaneció detectable, y 3 bandas
aparecieron correspondiente a Candida
sp (B), levadura grupo de especies 2 (H)
y Manshurica Pichia (G
A los 6 días las levaduras asociadas a los
granos de cacao fermentados
eran H. opun-
Tiae (A), C. insectorum (C), P. kudriavezii
(D), P. galeiformis (F), P. manshurica (G)
y las especies de levadura grupo 2 (H) se
mantuvo presente durante 3 días de
secado al sol.
En el último día de secado (4 días), sólo la mitad de Se detectaron el número de bandas que se
encuentra en 3 días (3 bandas) como H. opuntiae (A), P. manshurica (G) y las especies de levadura
grupo 2 H.

13. DISCUSION
Los análisis de las ecologías bacterias y levaduras de cacao mostraron que los pasos posteriores a la cosecha de
los procesos de cacao están asociados a una grande variación en la ecología microbiana en términos de
número de especies que se pudo detectar en el nivel molecular.
En nuestro estudio, hemos demostrado que AAB
dominado en las últimas etapas de fermentación y
todas las etapas de secado. El predominio de esta
especie durante las últimas etapas de fermentación
y secado podría ser explicado por su resistencia a la
acidez y el calor.
Estas especies potencialmente podrían ser utilizados
como buenos marcadores de la fermentación de cacao
completa y secado. G. xylinum y Clostridium sp solamente
se detectaron durante el sol etapa de secado, lo que
podría indicar que podrían estar presentes en medio
ambiente (suelos, materiales) como especies de
Clostridium generalmente son considerado como
contaminante del suelo

14. Durante el procesamiento posterior a la cosecha
entera de cacao, incluyendo fermentación y el
secado, se detectaron 23 especies bacterianas
entre los cuales 21 fueron identificados. Se
encontró que todas las especies bacterianas
durante toda la etapa de fermentación y 18
especies bacterianas durante la etapa de
secado.
Observamos 14 especies comunes entre
fermentación y secado. (Entre las siete especies de
seis Enterprise obacteriaceae) solamente se
detectaron durante la etapa de fermentación y
podría ser potenciales marcadores específicos de
etapa
fermentación (Escherichia sp, E. fergusonii, E. albert
ii, Enterobacter sp, P. vagans, S. disfunciónenteriae)
Durante el secado al sol, se detectaron 2
especies que fueron G. xylinum y Clostridium
sp y podrían ser marcadores específicos de la
etapa de secado. H. opuntiae fue la especie de
levadura únicas detectado en el cacao fresco
frijoles, lo que confirma la calidad de las vainas
de cacao y la esterilidad relativa de los granos
dentro de la vaina.
Se detectaron ocho especies de levadura en todo el
proceso, todas estas especies estuvieron presentes
durante la etapa de fermentación y de siete durante
el secado al sol. Una especie (Candida sp) sólo se
detectó en un paso específico durante la
fermentación (4 días) antes de la terminación.
Estas especies podría ser marcador específico para la fermentación incompleta. Tanto la levadura y
bacterias sufrieron cambios dramáticos tanto la fermentación de cacao y en el secado.