microbiologia

1. ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA
PRÁCTICA Nº 09
Recuento e Identificación de
Staphylococcus aureus
ASIGNATURA :
Microbiología de los Alimentos I
DOCENTE :
Dra. Graciela Albino Cornejo
ALUMNO :
Rómulo Aycachi Inga
CICLO :
2007 - II
Lambayeque, 28 de febrero de 2008.
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2. PRÁCTICA Nº 09
RECUENTO E IDENTIFICACION DE
Staphylococcus aureus
I. Introducción:
La Familia Micrococcaceae comprende cocos Gram positivos, no exigentes, catalasa
positivos, con agrupación en racimos, aerobios o anaerobios facultativos.
De los tres géneros que la integran, Micrococcus, Planococcus y Staphylococcus, este
último es el único de importancia médica. Se caracteriza por ser aerobio - anaerobio
facultativo, capaz de fermentar la glucosa en anaerobiosis; poseer ácidos teicoicos en su
pared, y ser sensible a la enzima lisostafina.
Dentro del género Staphylococcus se conocen más de 20 especies, de las cuales S.
aureus es la más importante. Otras especies como S. epidermidis y S. saprophyticus
son actualmente reconocidas como capaces de actuar como patógenos bajo
determinadas circunstancias.
La infección estafilocóccica es conocida desde la antigüedad. En la actualidad el género
Staphylococcus y, en especial, la especie tipo S. aureus tiene una alta incidencia como
agente de infección, tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. Es la primera
como agente de infecciones, desde superficiales como el forúnculo, a profundas como
osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel nosocomial se destaca como
primer agente de infección de heridas operatorias y de prótesis. Asimismo, S. aureus es
capaz de causar cuadros TÓXICOS por producción de potentes exotoxinas tales como
intoxicación alimentaria, síndrome de piel escaldada y shock tóxico. Además cabe
destacar la gran capacidad de adaptación y supervivencia de esta bacteria, su aumento
progresivo de resistencia a los antimicrobianos, en especial en el medio hospitalario,
que plantea serios problemas epidemiológicos y terapéuticos.
Del punto de vista de sus factores de virulencia, tanto bioquímicos como estructurales,
se lo puede definir como un "patógeno perfecto", magníficamente equipado para
colonizar, invadir, diseminarse y causar enfermedad grave. No obstante, normalmente
convive en armonía con el huésped humano o animal, formando parte de su flora sin
causar daño. Inclusive en algunos casos se encuentran personas sanas pesadamente
colonizadas, definiéndose como "portadores" y pudiendo en ocasiones ser reservorio y
fuente de infección.
II. Objetivos:
- Realizar el recuento de colonias de Staphylococcus aureus de muestras de queso
fresco artesanal.
- Familiarizarse con el método de detección y recuento para S. aureus y conocer
su importancia en los alimentos.
III. Materiales:
- Muestra: Queso fresco artesanal
- Frascos estériles
- Tubos de dilución
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Asas bacteriológicas
- Espátulas de Drigalsky
- Agar Baird Parker
- Huevos criollos
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3. - Diluyente: agua peptonada con
2% de citrato de sodio.
- Plasma sanguíneo (para prueba
de coagulasa)
- Gradillas
- Mechero Bunsen
- Placas de Petri
IV. Procedimiento:
- Preparamos la muestra. En esterilidad pesamos 3 g de la muestra (queso).
- Luego agregamos 27 ml del diluyente (agua peptonada + 2% de citrato de
sodio), ésta será la primera dilución (10-1
).
- Luego, homogenizamos la muestra. Agitamos la muestra hasta que se
desmenuce por si solo (se verá un líquido lechoso).
- Luego preparamos las demás diluciones (10-2
, 10-3
).
- Pasado el tiempo de incubación, leemos las placas. Se buscan colonias
características (colonias negras, medianas, brillantes y con un halo blanco).
- Se hace el conteo de las colonias características.
- De las colonias sospechosas (presuntamente S. aureus), se siembra en un tubo
con caldo nutritivo y lo incubamos a 37 ºC por 24 h. El caldo obtenido servirá
para realizar la prueba de coagulasa, confirmativa para S. aureus.
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10-1
10-2
10-3
Diluciones
3 g de muestra
+
27 mL agua pept. con
2% de citrato de Na
9 mL
diluyente
9 mL
diluyente
Agar Baird
Parker
0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL
Incubar a 35 – 37 ºC por 24 h
Sembrar con
espátula de
Drigalsky

4. V. Resultados:
- Después de la siembra en el agar PB se obtuvo lo sgte:
10 -1
A 10 -1
B
10 -2
A 10 -2
B 10 -3
A 10 -3
B
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5. - Se obtuvo el sgte. recuento:
DILUCIONES
10-1
10-2
10-3
A B A B A B
NN NN 1148 1320 572 372
- De las colonias obtenidas se realizó la prueba de la coagulasa, obteniéndose el
sgte. resultado:
- Entonces, las colonias obtenidas son coagulasa positiva, lo que quiere decir que
lo más seguro es que sean S. aureus positiva
VI. Preguntas:
- Fundamentar la prueba de la termonucleasa.
La detección de la desoxirribonucleasa termoestable estafilocócica (termonucleasa) en
los alimentos, se utiliza como una prueba indirecta de la presencia de grandes
cantidades de Staphylococcus aureus en los alimentos, así como de la posible formación
de enterotoxina estafilocócica.
La producción de esta enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia
de oxígeno, requiere iones calcio para su actividad enzimática, posee un pH óptimo de
8,6 y se precipita de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste
temperatura de 130 ºC por 16,6 min.) es la única asociación con el crecimiento de S.
aureus. Esta relación ha motivado el desarrollo de diferentes métodos para detectar esta
enzima en el alimento y utilizarla como pesquisaje en los alimentos susceptibles a la
contaminación de S. aureus. El azul de toluidina (0.1 M) presente en el medio vira a
rosa por acción del pH formado por la enzima endonucleasa.
- ¿Qué otros medios medios se usan para recuento y aislamiento de S. aureus?
o Agar Vogel-Johnson
o Agar yema de huevo azida
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6. o Agar yema de huevo sal
o Agar sangre
o Agar yema de huevo telurito polimixina
- ¿Cómo se obtiene la toxina estafilocócica?
o Las primeras investigaciones comenzaron a principios de la década del
60 y se purificaron diferentes serotipos toxigénicos a partir de cepas
productoras de enterotoxinas, mediante varias combinaciones de
cromatografía de intercambio iónico y filtración sobre gel, las primeras
purificaciones empleaban un largo tiempo, y se hacían en 4 ó 5 etapas,
pero se obtenía un bajo recobrado.
En estudios realizados por Bécquer et al. en la obtención y purificación
de la enterotoxina de serotipo B, se emplearon 3 pasos de purificación
fundamentados en la utilización de Amberlite IRC-50 (H),
carboximetilcelulosa (CM-321) y Sephadex G-75, y se obtuvo un
recobrado total del 15 % y un alto grado de pureza. Resultados más
alentadores se presentaron posteriormente en el aislamiento y
purificación de la enterotoxina E, cuando se obtuvieron 89,72 mg de
enterotoxina y un recobrado total del 17,67 %.
Se ha logrado purificar toxinas estafilocócicas en 1 y 2 pasos. El primer
paso utiliza la cromatografía de afinidad con rojo de triazina para la
purificación de la enterotoxina A, y el segundo consiste en un
intercambio iónico sobre carboximetil celulosa y un enfocamiento
cromático para las enterotoxinas de los serotipos A, B y C donde
demuestran una pureza de 72 a 92 %, según un densitograma de
poliacrilamida.
- ¿Cuál es la composición del agar BP y cual es el fundamento de la formación
característica del halo?
Agar Baird Parker
Extracto de carne 5 g
Peptona de caseína 10 g
Extracto de levadura 1 g
Piruvato sódico 10 g
Glicocola 12 g
Cloruro de litio 5 g
Agar 15 g
Agua destilada 1 000 mL
o En los medios a base de yema de huevo S. aureus utiliza la lipovitelina
(una lipoproteína presente en la yema de huevo) lo que se manifiesta por
la aparición de áreas debajo y alrededor de las colonias. La aparición de
zonas aclaradas o parcialmente aclaradas de un precipitado blanco
procede de la formación de sales de calcio y magnesio de los ácidos
grasos liberados. Estas dos características representa la llamada
“reacción de la yema de huevo”.
VII. Referencias:
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7. - CHANS R., G. (2002). Estafilococos. Obtenido el 22 de febrero de 2008 en
http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2017.pdf
- BECQUER L., A. y otros (1996). Detección de la desoxirribonucleasa
termoestable (termonucleasa) directamente del alimento. Obtenido el 22 de
febrero de 2008 en http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol10_2_96/ali05296.htm
- FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en
Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima.
- L. ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiologia de Alimentos:
Investigación y Recuento de Staphylococcus aureus. Obtenido el 01 de febrero
de 2008 en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_m
icrolimentos.htm
- THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Análisis Microbiológico de los
Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.
RESULTADOS FINALES
- Recuento de colonias:
En el recuento de colonias de las diluciones realizadas nos dio los sgtes. resultados:
Diluciones # de colonias Promedio
10-1
A Incontables
10-1
B Incontables
Incont.
10-2
A 1148
10-2
B 1320
1234
10-3
A 572
10-3
B 372
472
Dividimos los promedios de las diluciones 10-2
y 10-3
y obtenemos los sgtes. resultados:
10-2
→ 1234
10-3
→ 472
= 2.6
El resultado es mayor de 2. Entonces tomamos la menor dilución como el valor para el
conteo de colonias. Entonces, el resultado para el conteo de colonias será:
47.2 x 10-4
ufc/gr
La cantidad de S. aureus (expresado en ufc) en la muestra de queso artesanal recogido
en el Mercado Modelo de Lambayeque es de 47.2 x 10-4
ufc/gr.
- Prueba de termonucleasa:
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8. De las colonias positivas para la prueba de coagulasa, se les pasó a realizar la prueba de
termonucleasa. Para esto se emplea agar DNasa, al cual, después de servir en placas de
Petri y dejar solidificar, se les hace dos agujeros en la parte media y separados uno del
otro.
Luego, de la cepa de S. aureus, a la cual hemos sembrado en caldo nutritivo
previamente, se pone en agua hervida por 5 min. , luego lo ponemos a enfriar en agua.
Después, inoculamos en los orificios hechos en el agar pequeñas cantidades del caldo
con S. aureus de tal manera que quede de forma convexa.
Luego ponemos a incubar la placa a 37 ºC por 2-4 h. Pasado el tiempo leemos las
placas. Una coloración rosada a guinda en la zona de la inoculación es una reacción
positiva para la prueba.
Pasado el tiempo de espera las oquedades en las que sembramos no mostraron ningún
cambio, como se puede mostrar en la fotografía adjunta.
Por lo tanto, la prueba de termonucleasa es negativa. Si la prueba de coagulasa es
positiva y la prueba de termonucleasa es negativa se podría suponer que la cepa aislada
no es S. aureus, pero dado el caso que el medio ADNasa usado es un medio con un
tiempo bastante largo de conservación puede que no estén (sus componentes) en todo su
poder de uso. La literatura señala que la prueba de termonucleasa es confirmativa para
S. aureus patógeno, pero en este caso, ya que el medio usado nos da un resultado
dudoso (ya que además de las cuatro grupos que aislaron S. aureus coagulasa positiva, a
ninguno le dio positivo la prueba de termonucleasa), se puede decir que la cepa aislada
sí es S. aureus y ésta fue aislada de una muestra de queso artesanal colectada en el
Mercado Modelo de Lambayeque.
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