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Dx HIV.ppt
- 1. METODOS DE DIAGNOSTICO PARA VIH Q.F.B.MARICELA GORDILLO MARIN
- 2. A1 A1 + A1- ESTRATEGIA 1 Transfusión-Transplante A1 A1 + A1 - ESTRATEGIA 2 Vigilancia A1 + A2 + A2 A1 + A2- Repetir A1 y A2 A1 + A2 + A1 + A2- A1 - A2- ESTRATEGIA 3 Diagnóstico A1 A1 + A1 - A2 A1 + A2 + A1 + A2- Repetir A1 y A2 A1 + A2 + A1 + A2- A1 - A2- A1 + A2 + A3+ A1 + A2 - A3- A3 A1 + A2 + A3- A1 + A2 - A3+ Alto riesgo Bajo riesgo Estrategias OMS/UNAIDS
- 3. Estrategias OMS/UNAIDS Objetivo dela prueba Prevalencia Estrategia Transfusión/Transplante Todas I Vigilancia Epidem. > 10% I < 10 % II Sintomático > 30% I Diagnóstico < 30% II Asintomático > 10% II < 10% III
- 4. METODOS DE LABORATORIO Pruebaspresuntivas: ELISA Aglutinación Dot ELISA Ac’s + Ag p24 (Duales) Pruebas Confirmatorias: Western blot Inmunofluorescencia RIPA LIA Pruebas Especiales: Carga Viral Linfotipificación Inmuno-PCR Diagnóstico Perinatal: PCR Western blot para IgA Investigación: Determinación de subtipos: ELISA, HMA Resistencia a antirretrovirales: Genómica e In vitro PCR HIV-2, ELISA HIV-2,
- 5. PRUEBAS PRESUNTIVAS EQUIPO SensEspec Abbott 3ª Generación Plus 100 99.8 IMX System III Plus 100 99.2 Serodia 99.2 100 Vidas HIV Duo 100 99.2 Scan Plus HIV 100 100 ImmunoComb HIV 100 99.2 Vironostika HIV Uniform 100 100 Ortho Ab-Capture ELISA 100 99.7 Genelavia Mixt 100 99.4 Multispot 100 99.7 GENIE II 100 100 DIA HIV 100 99.5
- 6. PRUEBAS PRESUNTIVAS EQUIPO SensEspec Abbott AxSym System 100 97.8 TestPack HIV-1/HIV-2 97.6 99.4 Retrocell 84.2 99.4 HIV-Check 100 98.7 Rapid Elavia 100 98.8 Dipstick 89.1 100 Peptide HIV ELISA Test 75.8 99.7
- 7. E E E E E E ELISA SANDWICH 1.- ANTICUERPOADSORBIDO A LA PLACA LAVADO 2.- ADICIONAR LA MUESTRA LAVADO LAVADO 3.- ADICIONAR UN ANTICUERPO ESPECIFICO MARCADO CON UNA ENZIMA 4.- AGREGAR EL SUSTRATO DE LA ENZIMA Sustrato degradado Sustrato sin degradar
- 8. E E E E E E ELISAINDIRECTA 1.- ANTIGENO ADSORBIDO A LA PLACA 2.- UNION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS LAVADO LAVADO LAVADO 3.- ADICION DE ANTI-Ig MARCADA CON ENZIMA 4.- ADICION DE SUSTRATO Sustrato degradado Sustrato sin degradar
- 9. ELISA COMPETITIVA ANTICUERPOS EN LAMUESTRA CONJUGADO ANTIGENO Poco o ningún color producido RESULTADO POSITIVO Color producido RESULTADO NEGATIVO
- 10. ELISA DE CAPTURA 1.-AC’S MONOCLONALES 2.- ANTIGENO 3.- MUESTRA 4.- CONJUGADO 5.- SUSTRATO
- 11. PRUEBAS RAPIDAS 1) Aglutinaciónde partículas 2) Inmunodot 3) Inmunofiltración (flujo a través de un dispositivo) 4) Inmunocromatografía (flujo lateral)
- 12. PRUEBAS RAPIDAS Zona deaplicación y contacto Flujo lateral mezcla Ag*oc-Acp+ Ag*oc-Acc Zona detección y control
- 13. CARACTERISTICAS COMPARATIVAS ELISA vsPRUEBA RAPIDA Tipo de prueba Muestra Ventajas Limitaciones Complejidad ELISA Suero > 100 muestras Formato poco Equipo y Plasma simultáneas flexible personal Sangre Automatizada Requiere personal altamente Orina Baratas capacitado y equipo entrenado Saliva Control externo 2 hrs para su Sangre seca Identifica sero- realización conversión Refrigeración de temprana reactivos Pruebas Suero 1- 100 muestras Poco útiles para Inmunocromat Rápidas Plasma Requiere equipo procesar >100 no requiere Sangre mínimo pruebas simultáneas equipo extra Saliva Se puede realizar Requiere mayor “in situ” control externo Inmunodot e Resultados fáciles Menos baratas Inmunoflitra. de interpretar Elección de la requiere Los reactivos se estrategia puede preparación de almacenan a TA requerir múltiples reactivos y/o muestras pasos múltiples Las aglutiaciones pueden ser difíciles Aglutinación de interpretar requiere personal capacitado
- 14. Causas de ResultadosFalsos-Positivos para HIV en EIA • Enfermedad maligna Hematologica • Infecciones DNA viral • Enf. Autoinmunes • Mieloma Multiple • Cirrosis biliar Primaria • Hepatitis Alcoholica • Vacunacion para Influenza • Vacunacion Hepatitis B • Transferencia Pasiva de anticuerpos • Anticuerpos anti leucocitos clase II • Transplante Renal • Falla renal Cronica • Sindrome de Stevens-Johnson Cordes RJ, Ryan ME: Pitfalls in HIV testing: application and limitations of current tests. Postgrad Med 98:177, 1995.
- 15. Causas de ResultadosFalsos-Negativos para HIV en EIA Periodo ventana • Terapia Inmunosupresora • Transfusion de Reemplazo • Enfermedades Malignas • Disfunsion de celulas B • Transplante de medula osea • Kits que detectan principalmente anticuerpos contra p24 • Polvo de almidon de los guantes de laboratorio Cordes RJ, Ryan ME: Pitfalls in HIV testing: application and limitations of current tests. Postgrad Med 98:177, 1995.
- 16. PRUEBAS CONFIRMATORIAS Western Blot SanofiOrganon Cambridge
- 17. Env Pol Gag PRUEBAS CONFIRMATORIAS Western Blot ANTICUERPOSEN LA MUESTRA CONJUGADO gp 160 gp 120 gp 41 p 66 p 55 p 51 p 31 p 24 p 17
- 18. Causas de ResultadosFalsos-Positivos e Indeterminados en Western Blot HIV-1 • Ribonucleoproteinas humanas Normales • Otros retrovirus humanos • Anticuerpos contra antigenos mitocondriales, nucleares, y celulasT • Globulinas producidas durante gammopatia policlonal • Proteinas en papel filtro • AnticuerposAnticarbohidratos • Suero inactivado por calor • Alta concentracion de bilirubinas en suero • Anticuerpos adquiridos Pasivamente • Cordes RI, Ryan ME: Pitfalls in HIV testing: application and limitations of current tests. Postgrad Med 98:177, 1995.
- 19. Células infectadas Portaobjetos (Soportesólido) Conjugado (anticuerpo anti-humano unido a un compuesto fluorescente) PRUEBAS CONFIRMATORIAS Imnunofluorescencia Anticuerpos del paciente
- 20. PRUEBAS CONFIRMATORIAS Radioinmunoprecipitación (RIPA) Cultivocelular con HIV Adicionar aminoácido marcado (F o S) Lisis de la particula viral Adicionar muestra del paceinte Proteina A sepharosa Electroforesis Autoradiografía
- 21. PRUEBAS CONFIRMATORIAS Inmunoensayo enlinea (LIA)
- 22. ALGORITMO PARA ELDIAGNOSTICO DE LA INFECCION POR EL VIH Suero/Plasma Prueba presuntiva 1 (ELISA, Aglutinación, Dot ELISA) No reactiva Reactiva Reportar como Negativo Prueba presuntiva 2 (ELISA, Aglutinación, Dot ELISA) No reactiva Reactiva Prueba Confirmatoria (WB, IFI, RIPA) Repetir por duplicado Negativa Indeterminada Positiva Hacer seguimiento cada 3 meses hasta definir estado serológico
- 23. Algoritmo para elDiagnostico Serologico de la infeccion por HIV-1/HIV-2
- 24. Diagnostico Pediatrico HIV-1 •Neonatos/niños pueden tener anticuerpos maternos contra HIV-1 por > 1 año • La Infeccion ocurre intraparto >> in utero • La carga viral en Plasma de HIV es mas sensible que el PCR para DNA en celulas de sangre periferica • Infeccion In utero : las pruebas son positivas al nacimiento • Infeccion Intraparto: Estas pruebas son positivas hasta 1 mes de edad
- 25. DIAGNOSTICO PERINATAL CULTIVO Ag p24 Westernblot para IgA PCR
- 26. DIAGNOSTICO PERINATAL Western Blotpara IgA 2557 2924 2993 2922 2921 2881 2858 2857 2803 2681 2680 2679 2678 2677 2610 2609 2608 HPC-IgA NC HPC gp20/160 p66 p55/51 gp41 p32 p24 p17
- 27. DIAGNOSTICO PERINATAL PCR No. deNo. Copias Ciclos del Blanco 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 Carga viral: RT-PCR AMPLICOR NUCLISENS
- 28. I-PCR with Real-timeProbe Detection Avidin Real-time PCR to Detect Label Biotinylated DNA Reporter Capture Antibody Solid Support Biotinylated Detector Antibody Captured Antigen Probe Quencher Fluorescent dye I-PCR with Real-time Probe Detection Avidin Real-time PCR to Detect Label Biotinylated DNA Reporter Capture Antibody Solid Support Biotinylated Detector Antibody Captured Antigen Probe Quencher Fluorescent dye I-PCR with Real-time Probe Detection Avidin Real-time PCR to Detect Label Biotinylated DNA Reporter Capture Antibody Solid Support Biotinylated Detector Antibody Captured Antigen Captured Antigen Probe Quencher Fluorescent dye Fluorescent dye p24 PRUEBA CONFIRMATORIA EN DESARROLLO Inmuno- PCR (I-PCR)
- 29. IPCR Standard Curve 108107 104 103 (HIV-1 p24 Ag molecules= 40 ag/mL) 0 HIV-1 p24 Ag molecules IPCR Standard Curve IPCR Standard Curve IPCR Standard Curve 108 107 104 103 (HIV-1 p24 Ag molecules= 40 ag/mL) 0 HIV-1 p24 Ag molecules
- 30. MARCADORES DE PROGRESION Carga viral Subpoblacionesde Linfocitos (CD3, CD4 y CD8)
- 31. UTILIDAD DE LOSMARCADORES • INICIO DETRATAMIENTO • RESPUESTA O FALLA DELTRATAMIENTO • PRONOSTICO DE PROGRESION • RIESGO DETRANSMISION PERINATAL • CLASIFICACION CLINICA (CDC)
- 32. CARGAVIRAL LA CARGAVIRAL ESLA MEDIDA DE LA CANTIDAD CIRCULANTE DEVIHY SE ENCUENTRA EN RELACION DIRECTA CON LA PRODUCCION VIRAL LA CV SE EXPRESA COMO NUMERO DE COPIAS DE RNA (MATERIAL GENETICOVIRAL)POR ML DE PLASMA LASVARIACIONES DE LA CV SE EXPRESAN EN FORMA LOGARITMICA (BASE 10)
- 33. ANALISIS DE CARGAVIRAL CVAños de (copias / mL) evolución < 500 > 10 500 - 3,000 > 10 3,000 - 10,000 > 10 10,000 - 30,000 7.5 > 30,000 4.4
- 34. Progresion de laenfermedad con relacion a el nivel en Plasma de RNA HIV-1 y el conteo de celulas CD4 CargaViral 1,000 10,000 100,000 100 No de CD4 + 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 +
- 35. CORRELACION DE COMPLICACIONES CONCD4 Cuenta INFECCION de CD4 >500 / mm3 Infección aguda, vaginitis/candida 200 - 500 / mm3 Pneumonía bacteriana,TB, Herpes zóster Cryptosporidiosis, Sarcoma de Kaposi <200 / mm3 Esofagitis/candida, Pneumonía (P. carinii) Toxoplasmosis,TB extrapulmonar, Herpes simple diseminado, Sx desgaste <50 / mm3 CMV, M. avium diseminado
- 36. 150 100 50 0 -50 -100 -150 -200 CD4 + Cel/mm 3 HIV-1 RNA en plasma log 10 /ml 1987 1988 19891990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 Monoterapia Combinaciones Dobles Inhibidores de laTR Terapia Antirretroviral Altamente Actival Years -1 -2 -3 -4 0 Impacto delTratamiento : Conteo de celulas CD4 y Nivel de HIV-1 RNA en Plasma
- 37. Definiciones de Resistenciaa Antirretrovirales • Resistencia Genotipica : Cambios en el genoma que aparecen como consecuencia de exposicion al medicamento • Resistencia Fenotipica : El virus crece en cultivo a pesar de la presencia del medicamento • Resistencia Clinica : Falta de beneficio del agente antirretroviral
- 38. Secuencias deletadas del Genomadel HIV-1 Secuencias obtenidas del paciente Recombinacion Homologa VirusViable Reporte del Fenotipo Secuenciacion automatizada Reporte del Genotipo Analisis por computadora Principios de los Ensayos de Resistencia C G A T G T
- 39. ¡GRACIAS POR SUATENCIÓN!