El documento resume la investigación sobre la regeneración tisular en endodoncia realizada por estudiantes del postgrado de endodoncia. Explica que las células madre dentales y factores de crecimiento en matrices pueden usarse para regenerar tejidos dentales in vitro e in vivo. También destaca la importancia de conservar el tejido pulpar remanente en dientes permanentes inmaduros para permitir la continuación del desarrollo radicular a través de la aplicación de células madre y factores de crecimiento.
1. POSTGRADO DE ENDODONCIA
Regeneración Tisular en
Endodoncia
Elaborado por: Villegas Andrea, Terán Carlos; Gruber Jorge.
PROFESOR: Dr. Juan Carlos Munévar N
RESIDENTES DEL III SEMESTRE DEL POSTGRADO DE ENDODONCIA.
Bogotá, Noviembre 2010
5. • Odontología
Téjidos Dentoalveolares
Hueso Alveolar Ligamento
Periodontal
Dentina Cemento Nuevo Diente
Theslef I, Tummers M. Stem Cells and Tissue engineering: Prospects for a Regeneration Tissues
in Dental Practice. Med Princ Pract 2003;12(suppl 1):43–50
6. Es necesario tener un amplio conocimiento de
los mecanismos moleculares del desarrollo
embrionario normal para la regeneración de
tejidos y los órganos en pacientes.
Theslef I, Tummers M. Stem Cells and Tissue engineering: Prospects for a Regeneration Tissues
in Dental Practice. Med Princ Pract 2003;12(suppl 1):43–50
7. Mooney y col. (1996) La regeneración pulpar y
periodontal necesita de una apropiada matriz
biodegradable enrriquecida con factores de
crecimiento y moléculas de señalización bioactivas,
que soporte la organización celular y el crecimiento de
los procesos vasculares.
Friedlander L, Cullinan M, Love R. Dental Stem Cells and their potential role in apexogenesis and apexification. International Endodontic Journal,42, 955-962, 2009.
9. Células
Terminales
Amplificación Diferenciadas
de células
Transitorias
Diferenciación
Theslef I, Tummers M. Stem Cells and Tissue engineering: Prospects for a Regeneration Tissues
in Dental Practice. Med PrincPract 2003;12(suppl 1):43–50
10. Theslef I, Tummers M. Stem Cells and Tissue engineering: Prospects for a Regeneration Tissues
in Dental Practice. Med PrincPract 2003;12(suppl 1):43–50
11. Células parecidas a los
odontoblastos.
Formación de dentina
TGF-beta reparativa.
•Reduce inflamación.
IGF-1 •Preserva la vitalidad pulpar.
•Promueve la reparación.
Edwards P, Mason. Gene Enhanced tissue engineering for dental hard tissue regeneration:(2) dentin-pulp and periodontal regeneration. Head &
Face Medicine 2006, 2:16
12. Angiogénesis
Vasos
VEGF Y
Redes.
Estudios in-vivo demostraron que las células endoteliales de los
capilares bovinos proliferan y generan la formación de redes
capilares cuando la (VEGF) es estimulada.
Friedlander L, Cullinan M, Love R. Dental Stem Cells and their potential role in apexogenesis and apexification. International Endodontic Journal,42, 955-962, 2009.
13. DME
Induce la diferenciación en
células parecidas a los
Complejos de odontoblastos.
moléculas bioactivas
DME, y dosis supra-fisiológicas de BMPs recombinante, sialoproteina ósea
o genes de amelogenina , han tenido una formación de dentina mínima o
cantidades excesivas de tejido parecido al hueso en los canales pulpares.
Edwards P, Mason. Gene Enhanced tissue engineering for dental hard tissue regeneration:(2) dentin-pulp and periodontal regeneration. Head & Face Medicine 2006, 2:16
14. Técnica experimental
que utiliza los genes
La más común
para tratar o prevenir
consiste en introducir
alguna enfermedad
un gen normal para
reemplazar un gen
anormal.
Intercambio de un gen anormal por uno normal, Reparación de un gen
anormal, La alteración del grado en que un gen es activado o desactivado.
Edwards P, Mason. Gene Enhanced tissue engineering for dental hard tissueregeneration:(1)overview and practical considerations. Head & Face Medicine 2006, 2:12.
15. Totipotenciales
Pluripotenciales
Multipotenciales
Unipotenciales
MUNEVAR NINO, Juan Carlos, BECERRA CALIXTO, Andrea del Pilar, HERNANDEZ DIAZ, AngelicaMaria. Nova, enero-junio, año/vol 3, numero 003 , 2005.
16. DPSCs SHED
Gronthos y col 2000 Miura y col 2003
SCAP
PDLSCs Sonoyama y col
Seo y col 2004 2008
DFPSCs
Morzseck y col 2005
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
17. Potencial de
Osteo-odontogénico.
multidiferenciación
Dental
Mesenchymal
Stem Cells
(DMSCs)
Adipogénico. Neurogénico
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
18. Diferenciación en
odontoblastos/
Potencial
odontogénico.
Transplantados de DPSCs
mezclados con hidroxiapatita
Diferenciación adipogénica y
formaron complejos parecidos al
neurogénica.
tejido pulpar. (Gronthos y col
2000).
Diferenciación osteogénica
condrogénica y miogenica in-
vitro. (Laino y col 2005; Zhang
y col 2006; d´Aquino y col
2007).
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
19. SHED>DPSCs>BMMSCs.
SHED=DPSCs inmaduras (IDPSCs)
(Kerkis y col 2006).
Marcadores Antígenos embrionarios
específicos (SSEA/3, SSEA/4).
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
20. Antígenos de Estimulación en
reconocimiento de medios
tumores (TRA-1-60 y neurogénicos se
TRA-1-81). expresan βIII tubulin.
Potencial
Morfología
condrogénico y
GAD y NeuN. fibroblastica (Miura
miogénico (Kerkis y
y col 2003).
col 2006).
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
21. La caracterización in-vivo de SHED - producción de
estructuras similares a la pulpa sin formación
complejo dentino-pulpar.
Trasplante ex-vivo a ratones
inmunocomprometidos.
Producción de céulas similares a odontoblastos
asociados a estructuras similar a dentina y
expresion del DSPP.
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
22. Ex-vivo las SCAP pueden
Similares a las DPSCs y las
tener diferenciación
SHED.
odontogénica in-vitro.
Menores niveles de DSP, receptores para el factor TGFβII,
FGFR3, FGFR1 y la glicoproteína asociada al melanoma
(MUC18) en comparación con las DPSCs.
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
23. Expresan CD24.
Capacidad de
diferenciación
Expresan marcadores neurales sin
adipogenica in-vitro
estimulación neurogénica.
(Sonoyama y col 2006; AB
y col 2007)
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
24. •Huang G, Sonoyama W, Liu Y, Liu H, Wang S Shi S. The Hidden Treasure in Apical Papilla: The Potential
Role in Pulp/Dentin Regeneration and BioRoot Engineering J Endod. 2008 June ; 34(6): 645–651
25. •Huang G, Sonoyama W, Liu Y, Liu H, Wang S Shi S. The Hidden Treasure in Apical Papilla: The Potential Role
in Pulp/Dentin Regeneration and BioRootEngineering J Endod. 2008 June ; 34(6): 645–651
26. Diferenciación en
Formación de
Odontoblastos
SCAP Tejidos
productores de
Radiculares
Dentina Coronal
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
28. • Tipo I
COLAGENOS
NATURALES
• Tipo III
• Acido Hialuranico
GAG • Chitosan
Fibrina • Esponjas
Murray P, Garcia-Godoy F, Hargreaves K. RegenerativeEndodontics: A review of Courrent Status and a Call for Action.
Journal of Endodontics, 2008, 33 (4) 377- 390
29. SINTÉTICAS
•ALGINATO
•HIDROGEL
• PGA (ACIDO POLIGLICOLICO) •CERAMICA POROSA
• PLLA (ACIDO POLILACTICO) •TITANIUM
• PCL (POLICAPROLACTONA)
Edwards P, Mason. Gene Enhanced tissue engineering for dental hard tissue regeneration:(1)overview and practical
considerations. Head & Face Medicine 2006, 2:12.
30. Contiene nutrientes que permitan la viabilidad de las células y
su crecimiento.
PROPIEDADES
Antibióticos para prevenir crecimientos bacterianos
Ejercer funciones mecánicas y biológicas necesarias para el
reemplazo de los tejidos
Porosidad
Biodegradable
Murray P, Garcia-Godoy F, Hargreaves K. RegenerativeEndodontics: A review of Courren Status and a Call for Action. Jornal of
Endodntics, 33 (4) 377- 390
31. Ventajas y Desventajas
Efectos Adversos en Periodos Largos de Colágeno tipo I
recuperación de heridas cultivo Ex-vivo Biocompatible (Débiles)
Edwards P, Mason. Gene Enhanced tissue engineering for dental hard tissue regeneration:(1)overview and practical considerations. Head & Face Medicine 2006,
2:12.
32. Coagulo Guiado (Otsby, 1961, Myers y Fountain, 1974)
Celulas pulpares en PGA in vitro e in vivo (Gu y col 1996, Mooney y col
1996, Buurna y col 1999).
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
33. La regeneración del tejido en el ápice de un diente permanente inmaduro puede
venir de las Células Stem que ya pueden estar en el tejido pulpar vital.
Células Stem y factores de crecimiento enriquecidos en matrices pueden ser
usadas para regenerar tejidos tanto in-vitro como in-vivo.
En pacientes jóvenes, donde exista la posibilidad de que quede tejido pulpar
remanente y permita que continúe el desarrollo de la raíz. Es necesario tener un
enfoque conservador.
Friedlander L, Cullinan M, Love R. Dental Stem Cells and their potential role in apexogenesis and apexification. International Endodontic Journal,42, 955-962, 2009.
34.
35. La revascularización se ha estudiado in-vitro en muestras de
ratones y se demostró que la aplicación de factores
angiogénicos cambiaban marcadamente el comportamiento
vascular. Comprobando su importancia en la regeneración
de los tejidos apicales.
Los dientes permanentes inmaduros tienen una
rica provisión de tanto de DPSC como de SCAP
que pueden sobrevivir a la infección.
Friedlander L, Cullinan M, Love R. Dental Stem Cells and their potential role in apexogenesis and apexification. International Endodontic Journal,42, 955-962, 2009.
36. •Huang G, Sonoyama W, Liu Y, Liu H, Wang S Shi S. The Hidden Treasure in Apical Papilla: The Potential
Role in Pulp/Dentin Regeneration and BioRoot Engineering J Endod. 2008 June ; 34(6): 645–651
37. • Células implantadas en matrices en los canales
radiculares solo tienen suministro sanguíneo en la
región apical pudiendo haber un compromiso de la
vascularización, siendo este un paso esencial en la
regeneración pulpar si se desea llevar a la
clínica(Huang et col,2008).
•Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
38. Propuestas Futuras
Ciertos tejidos requieren de una producción especializada de matriz extracelular. La
producción desde la matriz extracelular y su maduración en tejidos especializado
envuelve la activación secuencial de cascadas de señalización. Si se proveen y
controlan estas señales artificialmente en un paso particular pueden facilitar la
regeneración de los tejidos.
(Kolfet al., 2007).
Otro objetivo es la manipulación in-vitro de las células stem es el mantenimiento de su
potencial de diferenciación, estudios recientes han demostrado que la diferenciación
de las células somáticas hacia células parecidas a las stem introduciendo solo de 3 a 4
factores podemos manipularlas y convertirlas en pluripotenciales para una mayor
variedad mas amplia de aplicaciones.
(Takahashiet al., 2007;Yu et al., 2007; Nakagawaet al., 2008).
Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
39. Propuestas Futuras
Entendiendo el mecanismo de auto renovación permitirá regular el
crecimiento de las células stem para generar un número de células
necesarias para diferentes aplicaciones
Una de las alternativas son la células stem embrionarias (ESCs), utilizando
tecnologías de transferencia nuclear. Sin embargo este proceso involucra el
uso de óvulos sin fecundar y embriones descartados.
Huang G, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Tissues vs. Those from Other
Sources: Their Biology in Regenarative Medicine. Journal Dental Research, 88(9) 2009.
40. El objetivo de este estudio es examinar la adhesión de las SHED con las
matrices porosas puede ser utilizada para crear un tejido pulpar.
43. El objetivo de este estudio es medir la efectividad de DPSCs, una matriz de colágeno y el la
DMP1 en la generación in-vivo de tejido similar a la pulpa después de su trasplantación
subcutánea en ratones.
45. Describir la creación de un diente totalmente funcional mediante bioingeniería
Implantando un germen dental en el alveolo de un diente previamente
extraído en un ratón adulto.
46.
47.
48. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
POSTGRADO DE ENDODONCIA
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN
UNIVERSIDAD EL BOSQUE
GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
49. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA 1era
POSTGRADO DE ENDODONCIA Fase
2005
ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA PARA LA
DETERMINACIÓN DE LOS MARCADORES CD117 Y
FGFR-3 EN MUESTRAS DE PULPA DENTAL SANA
ADULTA HUMANA POR INMUNOHISTOQUÍMICA.
Juan Carlos Munévar,Gloria Lafaurie, Jorge Forero,Cristina Duque, Luz Galindo e
Indira Lopez.
GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
50. RESULTADOS
Dentro de los resultados obtenidos durante la estandarización se observo
inmunomarcaje más intenso y con mayor distribución a nivel celular con FGFR-3 a
una concentración de 5ug/ ml y con CD 117a una dilución de 1:100.
Controles positivos cordón umbilical y controles negativos pulpa dental.
Teniendo la técnica de inmunohistoquímica estandarizada para la detección de
los marcadores FGFR-3 y CD117, se puede continuar con las siguientes fases de la
investigación.
51. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA 2da
POSTGRADO DE ENDODONCIA Fase
2007
ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA
DE FLUJO PARA DETERMINAR LA EXPRESIÓN DE LOS
MARCADORES CD 73 Y CD 105 EN MUESTRAS DE
PULPA DENTAL SANA ADULTA HUMANA.
Juan Carlos Munévar,Gloria Lafaurie, Jorge Forero,Isthar Castillo, Dayana
Goméz, Aixa Torres.
GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
52. RESULTADOS
Los cultivos primarios obtenidos consistieron en células de la
pulpa dental con morfología similar a fibroblastos .
En este estudio además se caracterizo una población de células
residentes en cultivos de pulpa dental adulta humana sana que
expresan CD 73+ y CD105 +, que han sido identificados como antígenos
específicos para progenitores celulares no hematopoyético, y fueron
negativas para CD 34 y CD45, marcadores comunes para células
hematopoyéticas y endoteliales
53. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA 3era
POSTGRADO DE ENDODONCIA Fase
2009
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS
MESENQUIMALES DE TEJIDO PULPAR HUMANO-
PROCESO DE ESTANDARIZACIÓN.
Juan Carlos Munévar,Martha Tamayo, Jorge Forero Martha Agudelo, Eduardo
Chacín, Silvia Ceron, Andrea Correa, Carmen Sanchesz
GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
54. RESULTADOS
Resultados, se observo que ni la edad ni el tipo de diente mostraron una
asociación estadística con la cantidad de células pulpares CD 105 positivo.
Se observo una asociación inversa, moderada y estadísticamente significativa
entre los tiempos de obtención y procesamiento de la muestra con el número
de células aisladas con Medimachine (P=0.06 y 0.09 respectivamente )
Aunque algunos resultados no son concluyentes debido al tamaño de muestra
reducido, si muestran tendencias importantes que pueden dilucidar los
protocolos que se deben llevar a cabo para un aislamiento y caracterización de
células Stem pulpares efectivos.
55. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
POSTGRADO DE ENDODONCIA 4ta Fase
2010
EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS PARA LA
CRIOPRESERVACIÓN DE
CELULAS STEM MESENQUIMALES DE PULPA
DENTAL RESULTADOS DESCRIPTIVOS
Juan Carlos Munévar, Martha Tamayo, Jorge Forero, Astrid Gómez, Diana Dorta,
Liliana Rodríguez , Carolina Velandia.
GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
56. RESULTADOS
Resultados Porcentaje De Viabilidad De Células DPSCs Posterior Al
Análisis Por Citometría De Flujo Del Método De Criopreservación De
Papaccio Et Al, 2006 Y Kamath 2007
57. RESULTADOS
FENOTIPO POST CRIOPRESERVACIÓN FENOTIPO POST CRIOPRESERVACIÓN
PAPACCIO KAMATH
100.0%
100.0%
90.0%
90.0%
PORCENTAJE EXPRESIÓN
80.0%
PORCENTAJE EXPRESIÓN
80.0%
70.0%
70.0%
60.0%
60.0%
50.0%
50.0%
40.0%
24 HORAS 40.0% 24 HORAS
30.0%
30.0%
20.0% 7 DIAS 7 DIAS
20.0%
10.0% 1 MES 1 MES
10.0%
0.0%
0.0%
MARCADORES CELULAS STEM MESENQUIMALES PULPA
DENTAL MARCADORES CELULAS STEM MESENQUIMALES PULPA DENTAL
Promedio De La Expresión De Marcadores Que Evalúan El Fenotipo
En Células DPSCs Por Citometría De Flujo Del Método De
Criopreservación De Papaccio Y Col/2006 Y Kamath A.
58. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
POSTGRADO DE ENDODONCIA 5 ta Fase
2011
Evaluación de dos métodos de criopreservación de
células stem mesenquimales en dientes temporales
y permanentes humanos.
Juan Carlos Munévar, Martha Tamayo, Jorge Forero, Andrea Villegas, Carlos
Terán, Jorge Gruber.
GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
59. Objetivo General
Evaluar el efecto de dos métodos de criopreservacion a tres
tiempos diferentes sobre la viabilidad y el fenotipo de
células STEM mesenquimales en dientes temporales y
permanentes humanos
60. Objetivos Específicos
Comparar el porcentaje de viabilidad
Comparar el porcentaje de luego de criopreservar las células STEM
preservación del fenotipo de células
mesenquimales en dientes temporales
stem mesenquimales entre dientes
temporales y permanentes después de y permanentes con dos métodos
3 tiempos (1, 3 y 6 meses) de diferentes de criopreservación a tres
criopreservación. tiempos diferentes
Comparar el porcentaje de
preservación del fenotipo celular luego Comparar el porcentaje de viabilidad
de criopreservar las células STEM de célula stem mesenquimales entre
mesenquimales en dientes temporales dientes temporales y permanentes
y permanentes con los dos métodos después de los 3 tiempos (1, 3 y 6
diferentes de criopreservacion a los meses) de criopreservación.
tres tiempos diferentes.
Debido al auje y el desarrollo de la ingenieria tisular aplicada a procesos de regeneración endodontica, la Universidad el bosque especificamente el postgrado de endodoncia, se ha encargado de desarrollar una linea de investigaciñon dedicada al estudio del componente más importante para la regeneración del tejido pulpar como son las células stem
Constituye la primera fase de la investigación donde se estandarizo la técnica para la determinación de los marcadores CD117 y FGFR-3 en muestras de pulpa dental humana sana por inmunohistoquímica. Previo consentimiento informado aprobado por el comité de ética de la Universidad El Bosque.Se tomaron muestras de tejido pulpar sano de 30 dientes, indicados para exodoncia, sin patología pulpar ni periapical y cierre apical completo de pacientes de un rango de edades comprendidas entre 14 y 30 años. Solo se tomaron muestra del tejido pulpar de 15de estos dientes para estandarizar la técnica y determinar por inmunohistoquímica la presencia de los marcadores CD 117 y FGFR-3 como posibles candidatos de células primordiales multipotenciales presentes en pulpa dental sana humana.Se realizaron variaciones enla técnica de inmunohistoquímica a diferentes concentraciones de FGFR-3 así como distintas dilusiones de CD 117
Las células Stem pueden identificarse y aislarse de una población mixta de células mediante la técnica de citometría de flujo para la detección de los marcadores CD 73 y CD 105 positivos y la ausencia de CD34 y CD45 en pulpa dental humana. El objetivo es estandarizar la técnica de Citometría de flujo para la determinación de los marcadores CD73 y CD 105 positivos en muestras de pulpa dental humana sana.Previo consentimiento informado aprobado por el comité de ética de la Universidad El Bosque. Se realizaron 4 cultivos primarios a partir de muestras de pulpa dental humana sana.Los cultivos primarios obtenidos consistieron en células de la pulpa dental con morfología similar a fibroblastos .Los resultados preliminares sugirieron que hay un pequeño porcentaje de células CD 34-, CD45 -, CD73 + y CD 105 + en el tejido pulpar sano.
El propósito de este estudio fue estandarizar los procesos para el aislamiento y caracterización de células Stem de pulpa dental humana y determinar si los factores como la edad , tipo de diente, tiempo de obtención de la muestra y tiempo de procesamiento de la muestra pueden influir en la calidad y cantidad de las células Stem.Estudio experimental in vitrode caracter exploratorio donde se usaron, 10 pool de muestras de tejido pulpar extraído de 10 pacientes de 18 a 31 años, de 23 dientes, premolares, terceros molares incluidos y erupcionados. La muestra de pulpa fue fragmentada a en el Medimachine, posteriormente se marcaron con el anticuerpo CD 105, se aislaron mediante el Miltenyi que emplea la tecnología de separación magnética (MACS) y se verifico su fenotipo mediante la Citometría de flujo.Para la confirmación de que las células pulpares obtenidas fueran de tipo Stem, se realizaron cultivos de células Stem de cordón umbilical como control positivo y cultivo de fibroblastos pulpares como control positivoLos factores evaluados, edad, tipo de diente, tiempo de obtención y procesamiento d ela muestra se asociaron con el coeficiente de correlación de Pearson con los resultados esperados, número de células pulpares CD 105 positivo, número de células aisladas con Medimachine y Miltenyi, y número de pozos logrados por pool de muestras.Resultados, se observo que ni la edad ni el tipo de diente mostraron una asociación estadistica con la cantidad de células pulpares CD 105 positivo.
Al evaluar el fenotipo se obtuvo que los marcadores CD105+ CD34- tiene mayor exprsión a las 24 horas y 7 días en el método 1 pero no para el mes en el método 2, para el marcador CD105+ CD45- tiene mayor expresión en los tres tiempos de criopreservación del método 1, Para el marcador CD45- CD34- tiene mayor exppresión en los tres tiempos d crioreservación en el método 2 y para el marcador CD73 arrojo el mejores resultados a las 24 horas y 7 días en el método 1 pero no al mes comparado con el método 2.