Revista: Tecnología del Agua Número de autores: 07 Volumen: 275 Páginas, inicial: 28 final: 40 Año: Agosto 2006 Lugar de publicación: España ISSN: 211/8173 http://www.rbi.es/publicaciones/tecnologia-agua.htm

1. ARTICULOS TECNICOS
Resumen
Las bacterias filamentosas Actinomice-
tos Gram positivos (GALO) y Microth-
Episodios periódicos
rix parvicella son responsables de la es-
pumación en los fangos activos de las
EDAR. La clasificación de estos micro-
de espumación con implicación
de filamentos Gram negativos.
organismos se realiza según Eikelboom
(2000) y Jenkins et al. (2003) por mor-
fotipos, los cuales muestran, a veces,
una alta diversidad de especies usando
sondas específicas.
Un proceso periódico de espumación
en la EDAR del municipio de Torres-
El morfotipo 0581: un desconocido
Torres (Valencia) con dominancia del
morfotipo 0581, ha permitido compro-
bar la identidad, tanto óptica como filo-
Por: Andrés Zornoza(*); Eva Rodríguez(**); Laura Isac(**); José Luis Alonso(***);
genética, de dicho morfotipo. Al con-
Natividad Fernández(**); Francisco Zorrilla(****); Vicente Fajardo(****)
trario de lo que pueda parecer debido a (*)
su similitud morfológica con Microth- EDAR Quart-Benager (Valencia)
rix parvicella, el morfotipo 0581 se en- Entidad Pública de Saneamiento de la Generalidad Valenciana (Epsar)
cuentra filogenéticamente relacionado E-mail: azetazeta@hotmail.com
con el phyllum Chloroflexi y no con el Web: es.geocities.com/mndmicroscopico
(**) Asociación Científica Grupo Bioindicación Sevilla (GBS)
phyllum Actinobacteria, al que perte-
nece Microthrix parvicella. E-mail: g.b.s@lycos.es
Web: www.grupobioindicacionsevilla.com
Palabras clave: (***) Universidad Politécnica de Valencia
Ciudad Politécnica de la Innovación
Instituto del Agua y Medio Ambiente (I.I.M.A.A.)
Grupo de Química y Microbiología
E-mail: jalonso@ihdr.upv.es
(****) General Valenciana del Agua, S.A. (Egevasa)
Edificio Torres del Turia
C/ Santa Amalia, 2 , 2º Entresuelo, Pta. K - 46009 Valencia
Abstract
E-mail: egevasa@egevasa.es - Web: www.egevasa.es
Periodical episodes of foaming
involving gram-negative filaments.
Morphotype 0581: an unknown.
The gram-positive filamentous bacteria
Actinomycetes (GALO) and Microth- 1. Introducción superficie del tanque (Madoni et al.,
rix parvicella are responsible for foa-
L
os microorganismos fila- 2000). Este efecto genera la separa-
ming in active sludge in waste water
treatment plants. According to Eikel-
mentosos son miembros jun- ción de la masa de fango hacia la su-
boom (2000) and Jenkins et al. (2003), to con protozoos y metazoos perficie, dando lugar a un ecosistema
these micro-organisms are classified by de la microfauna de las plantas de que tiende a evolucionar de forma di-
morphotypes, which sometimes show a tratamiento de aguas residuales por ferente al resto, con características
large diversity of species when specific fangos activos, desempeñando un fisicoquímicas distintas.
probes are used. papel esencial en la formación del Estas espumas son generadas por
A study of the periodical foaming pro- flóculo (Madoni et al., 2000). Co- determinadas bacterias filamento-
cess in the waste water treatment plant
múnmente, la proliferación excesiva sas, usualmente Gram positivas con
in the municipality of Torres-Torres, in
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the province of Valencia, Spain, with a de bacterias filamentosas genera alto contenido en Guanina/Citosina
predominance of morphotype 0581, problemas de explotación y causa se- (Seviour, 1999) que, por las caracte-
has made it possible to ascertain both rios problemas de separación en el rísticas de su pared celular, pueden
the optical and phylogenetic identity of clarificador. Estos problemas pue- absorber compuestos de baja solu-
this morphotype. Contrary to what den ser clasificados en dos grandes bilidad (Martins et al., 2004) y fuer-
might have been expected in view of its grupos, que pueden aparecer de for- temente hidrofóbicos. Dentro de las
morphological similarity to Microthrix ma separada o conjunta: esponja- bacterias filamentosas con mayor
parvicella, morphotype 0581 is phylo-
genetically related to the phyllum
miento o bulking y espumación o fo- capacidad para formar espumas es-
Chloroflexi and not to the phyllum Ac- aming. En este último caso, los agre- tán: Microthrix parvicella, GALO,
tinobacteria, to which Microthrix par- gados de bacterias filamentosas se PTLO, T 0092, T 0675, T 0041 y
vicella belongs. unen con burbujas de gas y partículas bacterias cocales (Jenkins et al.,
2 del flóculo, formando espumas en la 2003).
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2. ARTICULOS TECNICOS
2. Identificación de de la pared, secuencias e hibrida- de los filamentos con menor grado
bacterias filamentosas ción de ácidos nucleicos (Seviour y de incidencia en los episodios de
Evidentemente, la identificación Blackall, 1999, Lacko et al., 1999), bulking y foaming del estudio pre-
correcta del filamento generador de aplicados al estudio de las bacterias sentado por Jenkins et al., 2003 (Ta-
la alteración es primordial en el pro- filamentosas, están determinando la bla 1) y en la bibliografía, en gene-
ceso de explotación de la EDAR. El verdadera relación evolutiva entre ral, puede generar procesos de espu-
sistema de identificación/denomi- estas bacterias. Dichos estudios per- mación típicos de bacterias Gram
nación para las bacterias filamento- miten situarlas en el árbol filogené- positivas y ser, además, dominante.
sas más frecuentes en fangos acti- tico y conocer su fisiología gracias Por su parte, Microthrix parvice-
vos fue publicado por Eikelboom en al aislamiento de cultivos puros. Sin lla es uno de los organismos con ma-
1975. Posteriormente Eikelboom y embargo, en la actualidad, sólo una yor grado de ocurrencia en fangos
van Buijsen (1983) y Jenkins et al. minoría de filamentos se ha identifi- activos (Jenkins et al., 2003) y está
(1996), desarrollaron unas claves de cado usando estudios filogenéticos. implicado en severos problemas de
identificación dicotómicas en fun- La hibridación in situ con sondas separación sólido/líquido y foaming
ción de una serie de características de ARN ribosómico marcadas con (Rossetti et al., 2005), con la particu-
morfológicas y una reactiva a las fluorocromos (FISH) permite iden- laridad de presentar una gran simili-
tinciones clásicas, quedando la no- tificar, mediante microscopía de tud morfológica con el Tipo 0581. A
menclatura, pues, en forma de un fluorescencia, los microorganismos nivel óptico, la diferencia entre am-
código de cuatro cifras precedido en muestras en su medio natural bos filamentos se reduce a la res-
por la denominación ‘tipo’ y en al- (Bjornssom et al., 2002). Esta técni- puesta ofrecida a la tinción Gram,
gunos casos el género. ca se basa en la hibridación directa positiva para Microthrix parvicella
La versión mas actualizada de es- de la bacteria a identificar con una y negativa para el morfotipo 0581.
ta clave de identificación, Jenkins et sonda complementaria de una re- Todas estas observaciones, uni-
al. (2003), es una modificación de la gión del 16S o 23S ARN ribosómi- das al hecho de que algunos fila-
aportada por Eikelboom y van Buij- co, que previamente se ha diseñado mentos pueden cambiar morfológi-
sen (1983), en la que se recogen las para que sea específica de la bacte- camente según las condiciones am-
23 bacterias filamentosas que con ria que se va identificar. bientales (Martins et al., 2004), nos
mayor frecuencia se encuentran en En la relación de organismos fila- hicieron plantear la posibilidad de
los fangos activos. De hecho, la ma- mentosos recogida en el manual de que el filamento identificado como
yoría de los estudios se realiza con Jenkins et al. (2003) se resumen dife- Tipo 0581 se tratase, en realidad, de
las técnicas convencionales de ca- rentes estudios, detallando el orden Microthrix parvicella. En concreto,
racterización por fenotipos (Se- de aparición y abundancia de los fila- muchos actinomicetos, entre ellos
viour, 1999). No obstante, el uso de mentos en distintas plantas de trata- Microthrix parvicella, se fragmen-
estas claves de identificación no es- miento del mundo. Tal y como se ob- tan en su ciclo vital, lo que hace que
tá exento de riesgo, ya que la morfo- serva en la Tabla 1, a excepción de parezcan otros organismos bajo
logía así como las respuestas a las los hongos, cuya presencia no es condiciones ambientales distintas
diferentes tinciones de estas bacte- muy común en fangos activos, los fi- (Seviour y Blackal, 1999).
rias pueden cambiar en virtud de va- lamentos que ocupan los 10 primeros La revisión taxonómica de ambas
riaciones en factores ambientales. puestos son: GALO, Tipo 1701, Tipo bacterias nos permite comprobar
En sistemas industriales de fangos 021N, Tipo 0041, Thiothrix sp., Sp- que el Tipo 0581 está actualmente en
activos, incluso, pueden encontrar- haerotilus natans, Microthrix parvi- estudio, con ubicación desconocida
se morfotipos de bacterias filamen- cella, Tipo 0092, Haliscomenobac- (Seviour, 1999). Es decir, con la de-
tosas distintos a los habituales (Se- ter hydrossis y Tipo 0675. nominación Tipo 0581 nos encon-
viour, 1999). En la EDAR del municipio de tramos ante un ‘puzzle’ todavía por
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La identificación y el papel Torres-Torres (Valencia) se produ- resolver (Rossetti et al. 2005). En
bioindicador de los microorganis- cen de forma periódica episodios de cuanto a Microthrix parvicella, gra-
mos filamentosos han sido temas de foaming. En el periodo de estudio cias a los estudios con técnicas de se-
estudio durante décadas. Sin embar- (marzo, abril y mayo 2005) se pre- cuenciación, se han aislado e identi-
go, debido a la complejidad de las sentó como filamento dominante el ficado varias cepas como posibles
comunidades microbianas, las téc- morfotipo 0581, el morfotipo 0092 candidatas y se han desarrollado las
nicas de identificación y, en conse- como secundario y Microthrix par- siguientes sondas FISH para su de-
cuencia, la bioindicación, se en- vicella de forma ocasional, tanto en tección e identificación directa en
cuentran limitadas por los métodos las espumas generadas como en el muestras de espumas: MPA60,
clásicos. El empleo en los últimos licor mezcla. Esta situación nos ha MPA223, MPA645, MPA650,
años de técnicas moleculares que permitido comprobar cómo este ti- CompMPA650.1, CompMPA650.2
estudian la composición de lípidos po filamentoso, el Tipo 0581, uno (Erhart et al., 1997). 3
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3. ARTICULOS TECNICOS
Tabla 1
Organismo Filamentoso USAa Países Alemaniac,e Sudáfricad Australiaf Dinamarcag Italiah República
Bajosb,e Checai
Nocardioformes y actinomycetes 1 ? ? 6 3 - 2 6
Tipo 1701 2 5 8 8 12 - 9 13
Tipo 021N 3 2 1 - 1 3 6 7
Tipo 0041 4 6 3 6 2 2 3 5
Thiothrix spp. 5 19 - 9 13 - 7 8
Sphaerotilus natans 6 7 4 - 14 - - -
Microthrix parvicella 7 1 2 2 1 1 1 1
Tipo 0092 8 4 - 1 4 3 4 3
Haliscomenobacter hydrossis 9 3 6 9 5 - - 11
Tipo 0675 10 - - 4 2 - 3 11
Tipo 0803 11 9 10 7 9 - - 4
Nostocoida limicola I, II y III 12 11 7 8 5 - 5 2
Tipo 1851 13 12 - 3 8 6 - -
Tipo 0961 14 10 9 - 10 - 8 9
Tipo 0581 15 8 - 9 - - - -
Beggiatoa spp. 16 18 - - 15 - - -
Hongos 17 15 - - - - - -
Tipo 0914 18 - - 5 7 5 10 10
a Richard et al. (1982) y Strom y Jenkins (1984): 525 muestras de 270 plantas.
b Eikelboom (1977): 1100 muestras de 200 plantas.
c Wagner (1982): 3500 muestras de 315 plantas.
d Blackbeard et al. (1986a y 1986b): 111 plantas que incluyen 26 plantas de eliminación biológica de nutrientes (BNR); licor mezcla con bulking y sin bulking.
e No se incluyen las nocardioformes.
f Seviour et al. (1994): 38 plantas de eliminación biológica de fósforo (EBPR).
g Kristenesen et al. (1994): 40 plantas.
h Rossetti et al. (1994): 40 plantas.
i Wanner et al. (1998): 86 muestras de 86 plantas.
Tabla 1. Abundancia de organismos filamentosos. Fuente: Jenkins et al., 2003.
Por lo tanto, partimos de la base como Tipo 0581, para lo que se ha por la Empresa General Valenciana
que el nombre vernáculo de Mi- realizado un análisis de la decanta- del Agua (Egevasa) desde el año
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crothrix parvicella, probablemente, bilidad del fango, un estudio con 1992.
se pueda dividir taxonómicamente microscopía óptica y la caracteriza- Esta planta está diseñada para
mediante el empleo de sondas espe- ción filogenética con FISH de dicha tratar 625 m 3/día de caudal medio
cíficas, las cuales permitirán discer- bacteria dominante. con una carga de 300 mg/l de sóli-
nir claramente si nos encontramos dos en suspensión totales y una
con especies distintas o variedades 3. Material y métodos DBO 5 de 300 mg O 2/l. La línea de
de la misma. De hecho, Seviour El muestreo se ha realizado en la agua consta de un pretratamiento
(1999) define este grupo como filo- EDAR situada en el municipio de que comprende un desbaste y un ta-
genéticamente diverso. Torres-Torres, titularidad de la En- mizado, un reactor biológico circu-
En resumen, el objetivo de este tidad Pública de Saneamiento de lar de mezcla completa (650 m 3)
estudio es dilucidar la auténtica Aguas Residuales de la Generali- con dos aireadores sumergidos y un
4 identidad del filamento identificado dad Valenciana (Epsar) y explotada decantador secundario. La línea de
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4. ARTICULOS TECNICOS
fangos consta de un secado de fan- recogieron en la superficie del de- Debido a la abundancia de fila-
gos realizado en eras de secado. cantador secundario. Simultánea- mentos presentes en el reactor hu-
Con el fin de determinar el inter- mente se realizaron mediciones ho- bo que practicar una V30 diluida en
valo de carga másica a la cual opera rarias del oxígeno disuelto en distin- la proporción 1:3 (Stöbbe et al.,
la planta depuradora, se estableció tas partes del reactor. 1964; Jenkins et al., 2003). Es por
un periodo de muestreo comprendi- El tratamiento preliminar de las ello que el índice volumétrico de
do entre los días 19-24 de abril muestras del reactor para la obser- fangos se expresa en su forma di-
2005, encontrándose la temperatura vación microscópica y su conserva- luida (IVFD).
ambiental en torno a 25 °C. Para ello ción se realizaron según el protoco- Con la técnica FISH se han utili-
se habilitó un equipo tomamuestras lo establecido en Rodríguez et al. zado sondas específicas marcadas
automático después del pretrata- (2004). El estudio de las muestras con fluorocromos, para la detección
miento y justo antes de la entrada del reactor y de las espumas se ha de bacterias filamentosas en las
del influente al reactor biológico. realizado siguiendo el protocolo de muestras del reactor y de las espu-
La toma de agua se programó para la GBS (Rodríguez et al., 2004). La mas (Tabla 2). Esta técnica es más
recogida de muestras cada 30 minu- identificación de bacterias filamen- fiable para la identificación de bac-
tos con las que se confeccionó una tosas se hizo según a los manuales terias filamentosas que las técnicas
muestra compuesta a partes iguales. de Jenkins et al. (1996, 2003) y Se- convencionales, al basarse en se-
Los análisis físico-químicos se rea- viour y Blackall (1999). cuencias de nucleótidos específicas
lizaron según los Métodos Normali- La observación óptica se ha reali- de las bacterias o grupos de bacte-
zados (APHA, AWWA, WPCF). zado con un microscopio Zeiss mo- rias que se quieren identificar. Las
Las muestras de licor mezcla se delo Axiostar con objetivos de hibridaciones se han realizado a
tomaron justo a la salida del reactor 100x, 200x, 400x y 1.000x, dotado 46 °C durante 1,5-3 h según el pro-
biológico y las de emulsión (nata) se de equipo para microfotografía. tocolo de Manz et al. (1992).
Tabla 2
Sonda Secuencia (5´-3´) Especificidad % F1 Referencia
EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Bacteria 20 Amann (1990)
EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Planctomycetes 20 Daims et al. (1999)
EUB 338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Verrucomicrobia 20 Daims et al. (1999)
ALF1b CGTTCG(C/T)TCTGAGCCAG α Proteobacteria 20 Manz et al. (1992)
BET42a GCCTTCCCACTTCGTTT β Proteobacteria 35 Manz et al. (1992)
GAM42a GCCTTCCCACATCGTTT γ Proteobacteria 35 Manz et al. (1992)
HGC69a TATAGTTACCACCGCCGT Actinobacteria 25 Roller et al. (1994)
LGC354A TGGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)
LGC354B CGGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)
LGC354C CCGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)
CF319 TGGTCCGTGTCTCAGTAC Bacteroidetes 35 Manz et al. (1992)
GNSB941 AAACCACACGCTCCGCT Chloroflexi 35 Gich et al. (2001)
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CFX1223 CCATTGTAGCGTGTGTGTMG Chloroflexi 35 Björnsson et al. (2002)
TM7905 CCGTCAATTCCTTTATGTTTTA TM7 20 Hugenholz et al. (2000)
MPA645 CCGGACTCTAGTCAGAGC Microthrix parvicella2 20 Erhart et al. (1997)
MPA223 GCCGCGAGACCCTCCTAG Microthrix parvicella 20 Erhart et al. (1997)
MPA60 GGATGGCCGCGTTCGACT Microthrix parvicella 20 Erhart et al. (1997)
1 Concentración óptima de formamida.
2 Microthrix parvicella.
Tabla 2. Sondas utilizadas para identificar el Tipo 0581. 5
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5. ARTICULOS TECNICOS
A B
C
Figura 1. Ensayos correspondientes a la muestra de estudio. A: Ensayo de la V30 sin diluir y diluido (a la derecha). B: Levantamiento de la manta de fango, generando
la típica “Probeta partida”. C: Capa emulsionada en superficie.
3.1. Antecedentes pudieran tratarse de distintas formas ciones ambientales, algunas de las
bibliográficos: descripción de crecimiento de la misma especie. cuales cambian en el curso del año
del morfotipo 0581 a nivel Microthrix parvicella, descrita (Margalef, 1998). Esta última cir-
óptico por primera vez por Pasveer en cunstancia nos hizo pensar que Mi-
Jenkins et al. (2003): Filamento 1969, se incluye en el phyllum Acti- crothrix parvicella y T 0581 podrí-
curvado y enrollado situado dentro nobacteria (Rossetti et al., 2005), an pertenecer al mismo grupo filo-
del flóculo o libre en el espacio in- con características especiales, sien- genético y que ambas podrían en-
terflocular. La longitud del tricoma do uno de los filamentos más polé- contrarse íntimamente ligadas al Ti-
se encuentra típicamente entre 100 micos de la lista de Eikelboom. La po 0092 en función de sus caracte-
y 200 µm de longitud y 0,5-0,8 µm distinta morfología presentada por rísticas ecológicas.
de ancho. No se aprecian las células esta bacteria, según los sustratos
a lo largo del filamento. No presenta utilizados, hace pensar que existen 4. Resultados y discusión
ni septos visibles, ni vaina, ni creci- variantes, definidas por Eikelboom Para poder determinar las carac-
miento adherido. No presenta ni ra- como “distintos ecotipos” que en re- terísticas de las bacterias es necesa-
mificaciones ni movilidad. alidad se corresponden con la mis- rio establecer la decantabilidad del
Reactiva a tinciones: Gram nega- ma especie. En muchos casos, este fango, conocer los parámetros ope-
tivo y Neisser negativo. polimorfismo guarda relación con racionales de la EDAR, proceder al
Clave de identificación: Locali- la adaptabilidad de la especie (Mar- análisis óptico del fango y realizar
zación dentro del flóculo y reacción galef, 1998). su estudio filogenético.
Gram negativa. El filamento puede Por otra parte, algunos autores
ser confundido con Microthrix par- encuentran codominancia entre Mi- 4.1. Análisis de
vicella, pero la reacción fuertemen- crothrix parvicella y el Tipo 0092 decantabilidad
te positiva de este otro filamento lo (Madoni et al., 2000), así como dis- Debido a la longitud y forma de
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diferencia de la reacción Gram ne- tintos ecotipos de Microthrix parvi- crecimiento similares en Microthrix
gativa, propia del morfotipo 0581. cella en función de la temperatura. parvicella y el Tipo 0581, es lógico
Eikelboom (2000): No modifica Esta última presenta un óptimo de pensar que el análisis macroscópico
sustancialmente las claves identifi- crecimiento a 25 °C (Seviour y realizado sobre el conocido ensayo
cativas de este filamento respecto a Blackal, 1999), con crecimiento en de la V30 sea también muy parecido
su primera edición (1983), salvo el forma alargada (200-500 µm) que, en cuanto a la velocidad de decanta-
diámetro celular que lo sitúa entre durante el verano, se fragmenta y ción, aspecto algodonoso del licor,
los rangos de 0,3-0,4 µm y la longi- queda en forma de filamentos cortos emulsión en superficie y elevación
tud del filamento, que presenta va- (20-200 µ m) (Hawany y Tanakoo, de la masa de fango. Ambas formas
lores inferiores a 200 µm. Esta cir- 1998; Rossetti et al., 2005). La fre- de crecimiento filamentoso produ-
cunstancia sugiere la posibilidad de cuencia de las distintas formas fila- cen valores de IVF elevados y emul-
6 que Microthrix parvicella y T 0581 mentosas es función de las condi- siones (natas), por lo que podría con-
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6. ARTICULOS TECNICOS
todo cuando se practica una dilu-
ción para realizar el ensayo de la
V30 o cuando el nivel de sólidos en
suspensión del licor mezcla
(SSLM) es bajo. Este aspecto es co-
nocido como “probeta partida”. No
obstante, los efectos del foaming se
dejan ver en la parte superior de la
probeta en forma de una capa emul-
sionada con aspecto céreo que, a
simple vista, aparece como una
A B multitud de burbujas de aire junto
con fango.
Figura 2. Aspecto del tratamiento secundario en la planta estudiada. A: Primeros estadios de formación de En la Figura 2A se muestra la si-
natas en el clarificador. B: Acumulación de natas en el reactor biológico.
tuación del clarificador en los mo-
mentos en los que se están forman-
siderarse un doble efecto bulking- de licor mezcla se elevan debido a la do las primeras “natas”, las cuales
foaming. En la Figura 1A se mues- acumulación de microburbujas en inicialmente tienen forma de “esca-
tra en la probeta de la izquierda el dicha “estructura”, aspecto que pue- mas”, con multitud de burbujas, que
ensayo de la V30 sin diluir y en la de de apreciarse visualmente en la su- salen de la zona central del decanta-
la derecha diluido (correspondiendo perficie del clarificador secundario dor para ocupar toda la superficie.
un IVFD 1:3) (Stobbe et al., 1964). y que en el lenguaje de la explota- En este tipo de episodios, según el
La forma curva del filamento, ción de estaciones depuradoras se grado de avance del foaming, puede
con gran tendencia a enrollarse, denomina como “trozos de fango llegarse a colapsar toda la superficie
produce el entrelazado de los flócu- elevado”, sin tratarse de la emulsión del reactor biológico (Figura 2B)
los y por tanto una velocidad de de- propiamente dicha. Este hecho se con el aspecto típico de “chocolate
cantación lenta. Grandes porciones puede apreciar en la Figura 1, sobre espeso”.
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Figura 3. Reacciones a las tinciones de los filamentos encontrados en las muestras estudiadas (1.000x). A. T 0581: 1. Muestra en vivo. 2. Neisser negativa. 3.
Respuesta Gram negativa de T0581, junto con reactiva Gram positiva de Microthrix parvicella; B. Microthrix parvicella: 1. Muestra en vivo. 2. Reacción gránulo
Neisser positiva. 3. Tinción Gram positiva; C. Tipo 0092: 1. Muestra en vivo. 2. Clásica tinción Neisser positiva, color púrpura. 3. Tinción Gram con reactiva negativa. 7
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7. ARTICULOS TECNICOS
A B
Figura 4. Disgregación flocular por dos bacterias de características morfológicas similares (100x). A: Tipo Figura 6. Diámetros celulares de Microthrix
0581 (muestra estudiada); B: Microthrix .parvicella. parvicella (introducida artificialmente) y el Tipo
0581 (1.000x) en muestra in vivo.
En la Figura 7 se pueden obser-
A B var espacios vacíos en el tricoma, tí-
picos de Microthrix parvicella que,
sin embargo, han podido observarse
también en el Tipo 0581. Estos hue-
cos parecen estar asociados a condi-
ciones de estrés ambiental, ya que
en cultivos puros no aparecen. A ba-
ja concentración de oxígeno (0,4
mg/L) presentan morfología irregu-
Figura 5. Forma en bucles típica de Microthrix parvicella, presente en ambas bacterias (400x). A: Tipo 0581 lar y alargada sin células deforma-
( muestra de estudio); B: Microthrix parvicella. das o vacías (Rossetti et al., 2005).
La Figura 8 nos permite compa-
4.2. Análisis óptico misma muestra y resaltar las dife- rar la reactiva a Gram (método
En el análisis microbiológico re- rencias, se introdujo de manera arti- Hücker modificado). Ambos mor-
alizado a las muestras aparecen, en- ficial Microthrix parvicella (Figura fotipos tienen reacciones clara-
tre otros, tres tipos bacterianos: Ti- 6). mente distintas, lo que haría supo-
po 0581 (dominante), Tipo 0092 El ancho celular de ambos mor- ner que esta tinción es clave para su
(secundario) y Microthrix parvice- fotipos es distinto (Figura 6). Gene- distinción. Sin embargo, de manera
lla (ocasional) (Figura 3). ralmente, el Tipo 0581 es algo más ocasional, se observan algunos fi-
El análisis detallado de las mues- fino que Microthrix parvicella, aun- lamentos con una reacción clara-
tras indica que, tal como se puede que nos podemos encontrar con diá- mente positiva a dicha tinción que
apreciar en la Figura 4, la presencia metros similares, siendo Microthrix los convierten en “candidatos” a
del Tipo 0581 a niveles altos de po- parvicella más fina que la mostrada Microthrix parvicella en la muestra
blación puede producir una estruc- en dicha figura. Por esta razón, el estudiada, en la que el filamento
tura flocular abierta, de forma simi- diámetro celular no sería una carac- dominante es el morfotipo 0581.
lar a Microthrix parvicella. terística distintiva entre ambas. En relación con esto último, existe
La semejanza óptica de ambos fi-
lamentos en el estudio de una mues-
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tra in vivo es notable, siendo impo-
sible discernir entre ellos sin reali- A B
zar tinciones. El análisis métrico no
es, pues, una característica distinti-
va, sino simplemente orientativa.
La forma curva y enrollada típica y
que estamos acostumbrados a ob-
servar en Microthrix parvicella,
aparece en ambos morfotipos (Fi-
gura 5).
Con el fin de contrastar la morfo- Figura 7. Presencia de huecos en los filamentos estudiados. A: Tipo 0581 (muestra de estudio); B: Microthrix
8 logía de estas dos bacterias en la parvicella (.1000x).
TECNOLOGIA DEL AGUA

8. ARTICULOS TECNICOS
A B
Para identificar
el Tipo 0581 se
realizan análisis
de decantabilidad
del fango
Figura 8. Comparativa de la reacción Gram en los filamentos estudiados. A: Tipo 0581 (muestra de estudio);
B: Microthrix parvicella y Tipo 0581 (1.000x).
A B C
Figura 9. Reacción a la tinción de Neisser de los dos filamentos (1.000x). A: Microthrix parvicella con gránulos fuertemente positivos y Tipo 0581 con gránulos Neisser
débilmente positivos. B: Tipo 0581 con reacción gránulo-negativo. C: Muestra control de Microthrix parvicella procedente de otra muestra distinta a la de estudio en la
que se observa la típica reacción gránulo-positiva.
la hipótesis de que se pueden gene- tas con capacidad de convivir en el buidos desigualmente y de forma
rar cambios en la superficie celular mismo nicho ecológico. espaciada por todo el filamento,
de algunas bacterias filamentosas En cuanto a la tinción Neisser, en asignados a “variantes” del Tipo
frente a vertidos químicos (Rosset- función de la actividad de los gránu- 0581.
ti et al, 2005), lo que se traduciría los Neisser, hemos dividido los fila- – Filamentos con gránulos fuerte-
en reacciones a tinciones anómalas mentos de morfologías similares en mente Neisser positivos, que se
y añadiría más dificultad a la iden- tres grupos: han identificado como Microth-
tificación de morfotipos visual- – Filamentos del Tipo 0581, abun- rix parvicella.
mente idénticos. En estas mues- dantes, que no presentan reac- En la Figura 9C se puede obser-
tras, la determinación filogenética ción gránulo-Neisser positiva. var un filamento con una reacción
aporta la clave necesaria para com- – Filamentos que presentan reac- Neisser clásica de Microthrix parvi-
probar si se tratan de distintos mor- ción gránulo-Neisser positiva, cella, mientras que la Figura 9A
fotipos, ecotipos o especies distin- aunque no muy marcados, distri- permite observar una reacción va-
riable del morfotipo 0581 a dicha
tinción que contrasta con la de Mi-
275 / AGOSTO / 2006
crothrix parvicella. La bibliografía,
A B sin embargo, indica que el Tipo
0581 es gránulo-Neisser negativo
(Figura 9B).
El resto de tinciones, tinción de
vainas y PHB, muestran resultados
negativos en todas las ocasiones re-
alizadas (Figura 10), si bien Ros-
setti et al. (2005) indican que estas
reacciones pueden presentar varia-
Figura 10. Tinción de vainas y tinción PHB. A: Reacción negativa a la tinción de vainas del Tipo 0581. bilidad según la riqueza del medio
B: Reacción negativa a la tinción de PHB del Tipo 0581 (1.000x). Ambas procedentes de la muestra de estudio. en nutrientes y lípidos. 9
TECNOLOGIA DEL AGUA

9. ARTICULOS TECNICOS
la estabilización del sistema en tres
A B fases: aire-agua-células microbia-
nas. La estabilización de la nata bio-
lógica es el resultado de la produc-
ción de materiales lipídicos, lipo-
péptidos, proteínas y carbohidratos,
los cuales tienen propiedades de
agentes tensioactivos. Por añadidu-
ra, las paredes celulares de los mi-
croorganismos formadores de foa-
ming son fuertemente hidrofóbicas.
C D El mecanismo de estabilización
de la nata podría explicarse aplican-
do un modelo sencillo de “monoca-
pa”. La mayoría de sustancias de
fuerte carácter hidrófobo antes
mencionadas presentan, al menos,
una parte compuesta por ácidos gra-
sos (saturados o insaturados) que
están formados por un grupo polar
(carboxilo) y una parte apolar (ca-
Figura 11. Aspecto típico de situaciones de foaming. A: Sustancias de carácter hidrófobo; sistema estable dena hidrocarbonada) con un núme-
aire-agua-células. B: Presencia material hidrófobo cercano al núcleo del flóculo. C: Material hidrofóbico ro elevado de átomos de carbono.
en las zonas de mayor densidad bacteriana. D: Población filamentosa en el espacio interflocular del frotis
de la muestra de nata (100x). De manera visual se observa que su
presencia comienza apreciándose
en las zonas centrales de los flócu-
Es típico observar como después de la muestra de nata, aparece una los que se presentan bien compactos
de un aumento brusco de la pobla- gran población de bacterias fila- (Figura 11B), y con una microes-
ción de Actinomicetos, los cuales mentosas (Tipo 0581) siempre ma- tructura rica en formas filamentosas
contienen ácidos micólicos (Myco- yor que en el licor mezcla. Esta si- susceptibles de albergar o sintetizar
lata), junto con una subida brusca de tuación ocurre de forma similar en estos compuestos (Figura 11C).
los niveles de oxígeno en el reactor, Microthrix parvicella, estando des- Una vez que los niveles aumentan,
puede generarse en escaso tiempo crita como LAO (acumuladora de se llega a un contacto directo molé-
una gruesa capa de emulsión pro- lípidos) (Rossetti et al., 2005). culas-licor mezcla, produciéndose
ducto del incremento de microbur- La formación de foaming produ- un efecto similar al adicionar un
bujas (Figura 11). cida por microorganismos filamen- agente tensioactivo a una disolución
En la Figura 11D se puede obser- tosos es un complejo proceso que acuosa. Es decir, las moléculas tien-
var claramente como en el espacio engloba reacciones físico-químicas den a concentrarse en la superficie
interflocular, en el frotis procedente y biológicas. El proceso termina con (interfase líquido-gas) formando
Tabla 3
DIA CAUDAL DBO5 SSLM SSVLM V30 IVFD CARGA
ENTRADA ENTRADA REACTOR REACTOR (1:3) (1:3) MÁSICA
275 / AGOSTO / 2006
m3 mg O2/l mg/l mg/l ml/l ml/g kg DBO/kg
SSVLM.d
19-04-05 400 300 2890 2250 200 551 0,082
20-04-05 480 240 2840 2190 220 620 0,081
21-04-05 440 200 2770 2130 180 520 0,064
22-04-05 405 380 2830 2210 170 480 0,12
23-04-05 450 420 2900 2290 160 441 0,13
24-04-05 450 500 2920 2300 150 411 0,15
10 Tabla 3. Valores de carga másica obtenidos en el periodo de muestreo.
TECNOLOGIA DEL AGUA

10. ARTICULOS TECNICOS
muchos de ellos en la situación an-
tes descrita y a los que se les va a fa-
cilitar una interfase líquido/gas don-
de las moléculas se podrán disponer
en monocapa. La situación final es
que los flóculos con este tipo de ma-
terial atrapan microburbujas (Figu-
ra 11A), por lo que tienden a flotar y
acumularse en la superficie. Cuando
las cantidades son importantes aca-
ba formándose una nata espesa en la
superficie del reactor y/o del clarifi-
cador secundario.
4.3. Parámetros
operacionales
Esquema reactor biológico
Las cargas másicas (CM) obteni-
das se mantienen bajas durante el
periodo de estudio (0,06-0,08 kg.
DBO/kg. MLVSS d.) y se ven incre-
mentadas a lo largo del fin de sema-
na debido, fundamentalmente, al
aumento de la carga orgánica en el
influente por el desplazamiento po-
blacional que sufre el municipio.
A continuación se presentan los
rangos de carga másica en los que
suele ser frecuente encontrar los
morfotipos principales de la mues-
0
0
0
0
0
0
0
00
30
00
.0
.3
.3
.3
.0
.3
.0
0
0
30
00
00
30
.0
.3
15
16
22
13
18
19
21
0.
1.
3.
tra de estudio (Jenkins et al., 2003):
4.
12
9.
10
6.
7.
Tipo 0581: 0,1-0,05 kg. DBO/kg
SSVLM d.
Tipo 0092: 0,15-0,05 kg DBO/kg
SSVLM d.
Microthrix parvicella: 0,2-0,05 kg
DBO/kg SSVLM d.
En la Tabla 3 podemos compro-
bar en que rango de carga másica ha
operado la EDAR durante el perio-
do de estudio y como coincide con
los rangos típicos que aparecen en la
bibliografía. No se detectó ninguna
275 / AGOSTO / 2006
variación importante de los distin-
tos microorganismos presentes en
función de la CM.
Un parámetro que afecta de forma
Figura 12. Distribución de oxígeno en el reactor estudiado.
importante a los distintos organis-
mos filamentosos es el nivel de oxí-
geno disuelto. El sistema de oxigena-
una monocapa con los grupos pola- lógico tenemos que añadir además ción ocasiona zonas y momentos con
res interaccionando con las molécu- un factor muy importante, el siste- escasos niveles de oxígeno, como es
las de agua y los apolares dirigidos ma de aireación, con millones de el caso de las zonas desde donde los
hacia la fase gas (disposición ener- microburbujas de aire colisionando aireadores impulsan el aire (posición
gética favorable). En el reactor bio- continuamente con los flóculos, 1) frente a otras zonas con niveles 11
TECNOLOGIA DEL AGUA

11. ARTICULOS TECNICOS
A B
C D
Figura 13. Hibridación con distintas sondas. A: Células de color rojo hibridadas con la sonda EUB338I marcada con TAMRA. B: Mismo campo que en A pero
la hibridación se ha realizado con las sondas GNSB941 y CFX1223 (marcadas con FAM), utilizadas para identificar bacterias del phyllum Chloroflexi, la flecha
de color blanco señala un filamento que ha hibridado con las dos sondas del phyllum Chloroflexi y no ha hibridado con la sonda EUB338I. C y D: representan
diferentes campos en los que se pueden observar células de color verde del morfotipo 0581 (flechas de color rojo).
mas elevados (posición 2), tal y co- de la depuradora de Torres-Torres sondas GNSB941 y CFX1223 (Fi-
mo puede apreciarse en la Figura 12. con la técnica FISH se han utilizado gura 13B). Se ha obtenido una señal
La posición 3 corresponde al punto sondas de diferentes phyllum para positiva en las células que constitu-
de muestreo del licor mezcla. poder ubicar filogenéticamente el yen este morfotipo con las sondas
Esta situación de intermitencia morfotipo 0581, dominante en estas del phyllum Chloroflexi (Figuras
en el oxígeno podría ser similar a la muestras. El morfotipo 0581 no ha 13B, C y D). Bacterias filamentosas
que se produce en el régimen de hibridado con las siguientes sondas del phyllum Chloroflexi se han des-
puestas en marcha y paradas en los que se utilizan para caracterizar crito como abundantes en procesos
sistemas de aireación por turbinas y bacterias a nivel de phyllum: Prote- de tratamiento de aguas residuales
en los que es muy común el creci- obacteria, Actinobacteria, Firmicu- con eliminación de nutrientes
275 / AGOSTO / 2006
miento de las formas de Microthrix tes, Planctomycetes, Verrumicro- (Björnsson et al., 2002).
parvicella, más competitiva en es- bia, Bacteroidetes y TM7. Björns- Con la técnica FISH en las mues-
tas situaciones de alternancia, y en son et al. (2002) encuentran también tras de Torres-Torres se ha detecta-
las cuales también podría serlo la algunos filamentos que hibridan do señal de hibridación en algunas
forma Tipo 0581. con la sondas del phyllum Chloro- células/filamentos del morfotipo
flexi y que no dan señal con las son- Microthrix parvicella. Las células
4.3. Estudio filogenético das EUB338 mix (I, II y III). En las hibridadas daban una señal débil
El morfotipo 0581 se ha encon- muestras de Torres-Torres se han (Figuras 14A y 14B). Este resulta-
trado como dominante en el 10% de detectado morfotipos filamentosos do correspondería a un bajo conte-
depuradoras con problemas de es- que no hibridan con las sondas nido en ribosomas en las células que
pumas en Alemania (Lemmer et al., EUB338 I, II y III (Figura 13A) y constituyen el filamento de Mi-
12 2004). En las muestras analizadas que, sin embargo, hibridan con las crothrix parvicella.
TECNOLOGIA DEL AGUA

12. ARTICULOS TECNICOS
A B
Figura 14. Microthrix parvicella hibridado con sondas MPA645, MPA223 y MPA60, utilizadas para identificar este morfotipo. Las figuras A y B representan diferentes
campos en los que se pueden observar células de Microthrix parvicella de color rojo (flechas de color blanco) (fluorocromo TAMRA utilizado para marcar las tres sondas).
5. Conclusiones con los Actinomicetos, clásicos for- asociado a bajas cargas másicas y a
Es evidente la necesidad de utili- madores de natas, que se incluyen alternancia de oxígeno, lo que pare-
zar técnicas moleculares para avan- en el phyllum Actinobacteria. ce indicar que comparten estas mis-
zar en la identificación de los distin- Corroboramos que tanto la tin- mas necesidades y pueden competir
tos morfotipos descritos por Eikel- ción de Neisser como PHB no son en el mismo nicho. Fluctuaciones en
boom. El FISH se plantea como una diferenciadoras de ambas bacterias, las condiciones ambientales, no de-
opción muy interesante al no nece- aunque sí que se ha podido compro- tectables por el operador, permitiría
sitar cultivos puros, aunque sí domi- bar que el Tipo 0581 puede presen- el desarrollo aventajado de una de
nancia del organismo en el fango ac- tar respuesta negativa y respuesta estas bacterias, sin que las otras lle-
tivo. Tiene, además, la ventaja de débilmente positiva a gránulos garan a desaparecer.
utilizar la propia muestra y ser repe- Neisser, distinta a la de Microthrix
titivo. Sin embargo, para poder apli- parvicella que es mucho más inten- 6. Agradecimientos
car esta técnica es necesario que la sa. Algunas formas filamentosas de Queremos dejar constancia de
célula esté activa, porque en situa- este morfotipo pueden presentar re- nuestro agradecimiento a cada una
ciones de estrés el contenido en ri- acciones anómalas a ambas tincio- de las empresas y centros a los que
bosomas de la célula podría situarse nes debido a deficiencias nutricio- pertenecemos, especialmente a
por debajo del límite de detección nales o vertidos, que no permitirían Egevasa, Epsar y Emasesa, por su
de la señal de hibridación. tomar una decisión clara en su iden- apoyo y respaldo a nuestro trabajo.
Los futuros estudios deben ir en- tificación. Por el contrario, la tin- También agradecemos su colabora-
caminados, por una parte, a desen- ción Gram sí permite diferenciar al ción a Rebeca Castresana de Mi-
trañar la filogenia de las distintas Tipo 0581. guel, durante la toma de muestras y
bacterias implicadas en las altera- Sería conveniente realizar un es- en la obtención de parámetros fisi-
ciones de fangos activos, ya que este tudio a nivel nacional y un segui- coquímicos.
dato es fundamental para conocer el miento de esta bacteria para compro-
porqué del fenómeno. Por otra parte, bar si su grado de influencia es real-
se necesita obtener sistemas de apli- mente tan bajo o si por el contrario ha 7. Bibliografía
cación FISH en planta, de forma que pasado desapercibida al ser confun- 1. Amann, R.I.; Binder, B.J.; Ol-
275 / AGOSTO / 2006
los operadores puedan realizar iden- dida con Microthrix parvicella. son, R.J.; Chisholm, S.W.; De-
tificaciones certeras y por lo tanto A pesar de las escasas citas bi- vereux, R.; Stahl, D.A. (1990).
obtener información de la ecología bliográficas, este filamento hemos Combination of 16S rRNA-tar-
de una determinada bacteria, así co- podido comprobar que es capaz de geted oligonucleotide probes
mo tomar las decisiones oportunas. generar situaciones con doble efec- with flow cytometry for analy-
A pesar de las características to bulking-foaming, por lo que debe sing mixed microbial popula-
morfológicas de este organismo, si- presentar capacidades competitivas tions. Appl. Environ. Micro-
milares a Microthrix parvicella, la respecto al resto de bacterias que biol. 56,1919-1925.
técnica de FISH ha podido poner de comparten el mismo ecosistema. 2. APHA, AWWA, WPCF (1989).
manifiesto que el morfotipo 0581 En este episodio, coincidiendo Standard Methods for the Exa-
estaría incluido dentro del phyllum con la bibliografía, el trinomio Tipo mination of Water and Waste-
Chloroflexi, no guardando relación 0581, M.p y Tipo 0092 ha estado water. 17 Edition. 13
TECNOLOGIA DEL AGUA

13. ARTICULOS TECNICOS
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TECNOLOGIA DEL AGUA