1. ARTÍCULOS TÉCNICOS
Resumen
Caracterización de actinomicetos
con capacidad de biodegradación
El sector petroquímico necesita gran-
des cantidades de agua, para proceso
y refrigeración, que se contaminan
con productos derivados del petróleo.
en plantas depuradoras del sector
Normalmente, en las estaciones depu-
radoras de aguas residuales (EDAR)
de estas empresas se aplica el siste-
petroquímico
ma de fangos activos, que biodegrada
la materia orgánica hasta CO2, NH3 y
H2O y, además, forma nueva biomasa
celular. Para identificar correctamen-
te los actinomicetos en las EDAR, se
debe realizar lo que se denomina taxo-
nomía polifásica, que consiste en ana- Por: lbert Soler1; Gonzalo Cuesta1; José Luis Alonso2; Andrés Zornoza2
A
lizar las secuencias del gen 16S rDNA
y determinar diversos marcadores qui- 1
Universitat Politècnica de València
miotaxonómicos. Posteriormente, se Departamento de Biotecnología, Área de Microbiología
estudia la capacidad de biodegradación Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y Medio Natural
de fenol y naftaleno de cada una de las Camino de Vera, s/n - 46022 Valencia
especies aisladas e identificadas. Tel.: 963 876 000 - www.upv.es
Palabras clave: 2
Universitat Politècnica de València
Fangos activos, bacteria, actinomicetos, Ciudad Politécnica de la Innovación
BLAST, PCR, biodegradación, fenol, Instituto Universitario de Ingeniería del Agua y Medio Ambiental (IIAMA)
naftaleno. Área de Química y Microbiología del Agua
Camino de Vera, s/n - 46022 Valencia
Tel.: 963 876 000 - www.upv.es
E
Abstract
1. Introducción mezcla de microorganismos, en su
Characterization of actinomycetes l agua es fundamental en mu- mayoría bacterias heterótrofas, que
with the ability of biodegradation of chos procesos industriales, transforman la materia orgánica bio-
petrochemical wastewater treatment
plants
entre ellos del sector petro- degradable hasta formas más sim-
químico, ya que puede intervenir ples y estables. La biomasa celular
The petrochemical sector consumes
large amounts of water, either for
como materia de un proceso, como obtenida forma flóculos que se en-
processing or for cooling. This water disolventeo diluyente, como medio cuentran formados por una pobla-
is contaminated with petroleum pro- de transporte de otras materias o ción muy heterogénea de microor-
como sistema auxiliar, ya sea de la- ganismos, partículas orgánicas e
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ducts. The activated sludge system is
the main treatment system worldwi- vado o limpieza general (Asociación inorgánicas (Soddell y Seviour,
de. This system consists of an aerobic Alemana de Saneamiento, 1986). Es 1990; Bitton, 1999).
treatment that oxidizes organic matter por ello que es el sector que más
to CO2, NH3 and H2O and form new
agua gasta y, por tanto, el más sus- 2. Actinomicetos
cell biomass. To identify actinomyce-
tes, polyphasic taxonomy must be done
ceptible de contaminar. Los actinomicetos forman un gru-
which consists in the 16S rDNA gene En la industria petroquímica, los po de microorganismos morfológi-
sequences analysis and to determine contaminantes básicos son la con- camente muy heterogéneo, pertene-
severals chemotaxonomic markers. centración de materia orgánica, acei- cientes al dominio Bacteria,
Then, the ability of phenol and na- tes, fenoles, amoníaco y sulfuros. formado por bacterias generalmente
phthalene biodegradation of each spe- Por tanto, debe disponer de buenos aerobias, Gram-positivas, con alto
cies has been studied. sistemas de tratamiento para elimi- contenido en G+C. Dos de las pro-
Keywords: nar los definidos como contaminan- piedades más significativas de los
tes, molestos o con efectos nocivos actinomicetos son su capacidad para
Activated sludge, bacterium, actino-
mycetes, BLAST, PCR, biodegrada-
para el medio ambiente, y ajustar la desarrollarse sobre sustratos muy
tion, phenol, naphthalene. calidad del agua vertida a las espe- diversos, que no pueden ser usados
cificaciones legales. por otros microorganismos, como la
El sistema más utilizado es el de quitina y celulosa y su aptitud para
76 fangos activos. Este constituye una sintetizar numerosos metabolitos
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2. ARTÍCULOS TÉCNICOS
Tabla 1 tenecientes al sector petroquímico
de la región de Andalucía. De estas
Suborden Familia Género plantas, se eligieron los aislados más
Corynebacteriaceae Corynebacterium representativos, seleccionando aque-
llos que presentaron una mayor di-
Dietziaceae Dietzia versidad morfológica.
Mycobacteriaceae Mycobacterium 3.1. Toma de muestras
Nocardia y aislamiento
La toma de muestras se realizó
Gordonia durante el año 2008 por el propio
Corynebacterineae Nocardiaceae Millisia
personal de la planta. Se tomaron
muestras de espumas del reactor bio-
Rhodococcus lógico en recipientes estériles y se
enviaron al laboratorio donde se
Skermania guardaron en refrigeración a 4 ºC y
Williamsia se procesaron dentro de las 48 horas
siguientes. Para realizar el aisla-
Segniliparaceae Segniliparus miento se utilizaron 4 medios de
cultivo diferentes. Las muestras se
Tsukamurellaceae Tsukamurella
procesaron realizando una serie de
Pseudonocardineae Pseudonocardiaceae Pseudonocardia diluciones para rebajar la carga mi-
crobiana.
Micrococcineae Microbacteriaceae Microbacterium
Tabla 1. Clasificación jerárquica del suborden Corynebacterineae, Pseudonocardineae y Micrococcineae 3.2. Caracterización
basada en las secuencias de DNA y RNA ribosómico 16S (Zhi et al., 2009). morfológica
Se realizó una observación ma-
bioactivos. Estas propiedades ponen 1997), compuesta por los actinomi- croscópica y una observación mi-
de manifiesto la riqueza destacable cetos y sus parientes filogenéticos croscópica. La observación macros-
del metabolismo celular de este gru- con un alto contenido en G+C. La cópica se fundamenta en el aspecto
po microbiano (Goodfellow et al., segunda edición del Bergey’s Ma- de las colonias aisladas. En la obser-
1997). nual of Systematic Bacteriology (Bo- vación microscópica se realizó una
El interés por los actinomicetos one et al., 2001) recoge la clasifica- tinción Gram para comprobar que
comenzó a raíz del descubrimiento ción actual, en la que la clase tuvieran una morfología típicamen-
de la capacidad de estos microorga- Actinobacteria se eleva al rango de te nocardioforme. Por último, se
nismos para producir antibióticos. Phylum. Dentro del phylum se reco- realizó la prueba de la catalasa.
Aunque la búsqueda de compuestos noce una única clase, Actinobacte-
bioactivos continúa en auge, el inte- ria, que mantiene la estructura jerár- 3.3. Caracterización 344-345 / NOVIEMBRE-DICIEMBRE / 2012
rés por los actinomicetos se ha di- quica propuesta por Stackebrandt et quimiotaxonómica
versificado y actualmente ocupa al., (1997). Además, están incluidos Para caracterizar quimiotaxonó-
áreas muy variadas. Pueden ser pa- en él 6 órdenes, 39 familias y más micamente las cepas aisladas, se
tógenos de plantas, de animales, de de 130 géneros (Garrity y Holt, estudiaron diferentes parámetros
humanos, descomponer productos 2001). quimiotaxonómicos para poder de-
del caucho, crecer en el combustible Dentro de esta clase se incluye el finir de forma correcta los aislados
de los aviones. En las estaciones de- orden Actinomycetales, el cual en- dentro del grupo mycolata. Los pa-
puradoras de aguas residuales cau- globa los géneros estudiados en el rámetros realizados fueron la pre-
san espumas densas que llegan a presente trabajo. Estos géneros per- sencia de ácidos micólicos, la deter-
obstruir las instalaciones. Por la di- tenecen a los subórdenes Coryne- minación de los isómeros del ácido
versidad de hábitats que pueden co- bacterineae, Pseudonocardineae y diaminopimélico y el análisis de los
lonizar, este grupo de microorganis- Micrococcineae. La Tabla 1 muestra azúcares predominantes de la pared
mos tiene un enorme interés la clasificación de las familias y los celular.
ecológico (June et al., 1999). géneros estudiados en el estudio. Estas tres pruebas se basan en
una digestión de células en diferen-
2.1. Clasificación actual 3. Material y métodos tes reactivos para, posteriormente,
En 1997 se propuso la clase Acti- En el presente trabajo se estudian realizar una cromatografía en capa
nobacteria (Stackebrandt et al., cuatro estaciones depuradoras per- fina. 77
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3. ARTÍCULOS TÉCNICOS
rados generados con los iniciadores
27f y 1492r que amplifican el seg-
mento 16S en sentidos opuestos. Los
segmentos inicial y final (alrededor
de 25 nucleótidos de longitud) de
cada secuencia parcial, debido a que
suelen presentar una baja fiabilidad,
fueron eliminados antes de ensam-
blar la secuencia completa. Las se-
Figura 2. Rhodococcus ruber (54B). cuencias parcialmente alineadas se
unieron para generar una secuencia
guiendo las instrucciones del fabri- completa del gen del 16S rDNA.
Figura 1. Placa de recuento donde se aisló cante. El DNA extraído de las mues- La probable identidad de cada
la cepa PA3. tras fue amplificado mediante PCR una de las cepas secuenciadas se de-
(reacción en cadena de la polimera- terminó mediante la herramienta
sa) utilizando los iniciadores especí- informática BLAST (Basic Local
ficos (Lane, 1991) 27f y 1492 r. Fi- Alignment Search Tool), disponible
nalmente, los productos obtenidos de en Internet a partir del NCBI (Natio-
la PCR se purificaron y secuencia- nal Center for Biotechnology Infor-
ron, para posteriormente analizar la mation) (Jones, 2006).
secuencia e identificar cada cepa a Para caracterizar a nivel de espe-
nivel de especie. cie cada cepa se realizaron los árbo-
La secuencia de bases de cada les filogenéticos y las matrices de
fragmento, con una longitud aproxi- similaridad de cada género utilizan-
mada de 600 a 700 nucleótidos, se do los programas informáticos
Figura 3. Gordonia paraffinivorans (C2.2). obtuvo en un archivo de texto elec- Phydit y Treconw.
trónico desde el electroferograma
3.4. Caracterización mediante la aplicación científica 3.5. Biodegradación
genotípica Chromas (versión 1.43). Las secuen- En estos ensayos se utilizaron tres
A partir de un cultivo puro de cada cias del 16S rDNA fueron ensambla- medios de cultivo, suplementados
una de las cepas, se procedió a la das manualmente, utilizando el pro- inicialmente con glucosa al 0,1%
extracción del DNA utilizando un kit grama informático Phydit, a partir de para, así, conseguir una aclimatación
de extracción comercial (Sigma) si- la combinación de fragmentos sepa- previa que mejore la siembra poste-
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78 Figura 4. Cromatoplaca de ácidos micólicos.
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4. ARTÍCULOS TÉCNICOS
rior en los medios suplementados
con los productos tóxicos.
Los compuestos tóxicos elegidos
fueron el fenol y el naftaleno. Los
medios elegidos se suplementaron
con ellos al 0,1%. Se incubaron en
estufa a 28 ºC durante 14 y 21 días.
Como control positivo se utilizaron
los medios suplementados con glu-
cosa al 0,1%.
4. Resultados y discusión
Figura 5. Cromatoplaca de isómeros del DAP.
4.1. Aislamiento
Se realizaron 13 muestreos, obte-
niéndose un total de 35 aislados, de
los cuales se eligieron 23 por pre-
sentar una mayor variabilidad mor-
fológica. En la Figura 1 se observa
una placa de recuento de donde se
realizó algún aislamiento.
4.2. Caracterización
morfológica
En la caracterización morfológica
se realizó una observación macros-
cópica directa en placa (Figuras 2 y Figura 6. Gel de PCR con los productos de amplificación del 16S rDNA.
3) y, posteriormente, una observa-
ción microscópica mediante tinción en este trabajo poseían la forma ción de las reacciones de secuencia-
Gram, además de la prueba de la meso-DAP, a excepción de uno de ción se utilizó el kit ABbi Prism Big
catalasa. Se pudo observar cómo to- ellos. Dye Terminator Cycle Sequencing
dos los aislados estudiados eran ca- Por último, se determinaron los Reaction (versión 3.1).
talasa positivos y Gram-positivos. azúcares predominantes de la pared Las secuencias completas, obte-
Generalmente las colonias con as- celular. En nuestro caso se debe ob- nidas con ayuda de los programas
pecto mucoso suelen presentar mor- tener una tipo de pared celular IV, informáticos Chromas y Phydit, se
fologías cocoides y las colonias ru- siendo los constituyentes distintivos analizaron mediante el programa
gosas o sin brillo suelen ser bacilos mayoritarios arabinosa y galactosa. BLAST (NCBI). Con estos resulta-
de tamaño variable en ocasiones con Se observó que todos los aislados, dos se obtiene una identificación a 344-345 / NOVIEMBRE-DICIEMBRE / 2012
ramificaciones en ángulo recto bien menos uno, poseían esta forma. nivel de género al 100% y una posi-
desarrolladas. ble identificación a nivel de especie.
4.4. Caracterización De las 23 aislados seleccionados se
4.3. Caracterización genotípica obtuvieron cinco géneros distintos
quimiotaxonómica Una vez realizada la extracción (Gordonia, Mycobacterium, Micro-
En primer lugar se realizó la ex- de DNA, se comprobó la cantidad y bacterium, Rhodococcus y Pseudo-
tracción y análisis de los ácidos mi- calidad del mismo antes de llevar a nocardia). En la Tabla 2 se puede
cólicos de la pared celular. Se obser- cabo la PCR mediante electroforesis ver el resultado del BLAST con el
vó (Figura 4) que todos los aislados en gel de agarosa al 1,2%. La detec- porcentaje de identificación de cada
estudiados poseían ácidos micólicos, ción de los fragmentos amplificados aislado.
a excepción de 5 de ellos. obtenidos tras la PCR se realizó tam-
La segunda prueba realizada (Fi- bién mediante electroforesis (Figura 4.5. Biodegradación
gura 5) consistió en determinar los 6) en gel de agarosa. Los productos Para realizar las pruebas de bio-
isómeros del ácido diaminopimélico de la PCR se purificaron y se envia- degradación se sembraron las espe-
(DAP). El suborden Corynebacteri- ron a secuenciar al Servicio de Se- cies halladas anteriormente en tres
neae se caracteriza porque todas sus cuenciación del Instituto de Biología medios de cultivo conteniendo cada
especies contienen la forma meso- Molecular y Celular de Plantas uno de ellos fenol, naftaleno y glu-
DAP. Todos los aislados estudiados (IBMCP) de la UPV. Para la realiza- cosa, siendo este último el control 79
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5. ARTÍCULOS TÉCNICOS
positivo. Todas las cepas se incuba- mo a los 14 y 21 días en los medios un crecimiento máximo en dos de
ron a una temperatura constante de suplementados con naftaleno. Para los medios suplementados con fenol.
28 ºC. el fenol el crecimiento fue medio a A los 21 días el crecimiento fue
Las cepas que se escogieron para los 21 días en un solo medio, en los máximo en los tres medios de culti-
realizar las pruebas de biodegrada- otros dos fue muy bajo o nulo. vo. Para el naftaleno, el crecimiento
ción fueron las siguientes: PC4, Se observó que para las cepas fue nulo.
C5.1a, C2.3, PA2, PB6, C4.5, 54B, 54B (Figura 8) y C5.5a el creci-
RG.4a, C5.5a, R5, PB1, C2.2, LR4, miento en los medios suplementados 5. Conclusiones
RG.4b, C5.6, RG3 y CQG5.a. Todas con fenol fue máximo a los 14 y 21 De todos los cultivos aislados es-
ellas comprenden los géneros y las días, para los tres medios de cultivo. tudiados en el presente trabajo, el
especies que se han caracterizado e Para el naftaleno el crecimiento fue 39,1% pertenece al género Myco-
identificado anteriormente. bajo a los 21 días. bacterium; el 30,4%, al género Gor-
Para las cepas PB1 (Figura 7) y A los 14 días de incubación, para donia; el 17,4%, al género Pseudo-
PC4 se obtuvo un crecimiento máxi- la cepa RG3 (Figura 9) se observó nocardia; el 8,7%, al género
Rhodococcus; y, finalmente, el 4,3%,
al género Microbacterium.
Tabla 2
Las cepas más abundantes en el
Cepas Identificación % recuento en placa pertenecen al gé-
C5.1a Mycobacterium smegmatis 100% nero Pseudonocardia, cuyas espe-
cies degradan ambos compuestos
C5.1b Mycobacterium smegmatis 100% tóxicos, y al género Microbacterium,
C2.3 Mycobacterium smegmatis 100% cuya única especie no degrada nin-
guno de los dos compuestos tóxicos.
C4.5 Mycobacterium smegmatis 100% La especie Pseudonocardia asac-
charolytica degrada principalmente
PA2 Mycobacterium smegmatis 100% el naftaleno y en menor medida el
PB6 Mycobacterium smegmatis 100% fenol. Los filamentos de esta especie
no son hidrofóbicos por lo tanto los
PB7 Mycobacterium smegmatis 100% problemas de espumas que puedan
causar este especie quedan descar-
RG4.a Mycobacterium vaccae 99,48%
tados. Además, hay que destacar
RG4.b Mycobacterium vaccae 99,25% que, pese a que las especies de Pseu-
donocardia asaccharolytica son or-
54B Rhodococcus ruber 100% ganismos filamentosos, ocasionarían
C5.5a Rhodococcus ruber 100% muy pocos problemas de bulking
debido a que sus filamentos no pre-
PA3 Pseudonocardia asaccharolytica 97,48% sentan ramificaciones muy comple-
jas. Es por ello que para estudios
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PB 1 Pseudonocardia asaccharolytica 97,47%
posteriores en plantas piloto sería la
PB3 Pseudonocardia asaccharolytica 97,47% especie idónea.
Los porcentajes de las especies
PC4 Pseudonocardia asaccharolytica 97,47% Mycobacterium y Pseudonocardia
R1 Gordonia paraffinivorans 99,78% se consideran especialmente altos en
comparación con resultados obteni-
R5 Gordonia paraffinivorans 99,78% dos en plantas depuradoras de aguas
residuales domésticas, ya que en es-
C2.1 Gordonia paraffinivorans 99,78%
tas últimas no se suelen encontrar.
C2.2 Gordonia paraffinivorans 99,78% Se obtiene un porcentaje total de
cepas degradadoras del 29,4%, sien-
C5.6 Gordonia paraffinivorans 99,18% do las especies que degradan los dos
LR4 Gordonia paraffinivorans 99,78% compuestos tóxicos Rhodococcus
ruber y Pseudonocardia asaccharo-
RG3 Gordonia amicalis 100% lytica. La Gordonia amicalis solo
degrada el fenol.
CQG5.a Microbacterium flavum 98,43%
La técnica del análisis del 16S
80 Tabla 2. Identificación obtenida mediante BLAST de la secuencia del 16S rDNA. rDNA, que incluye la elaboración de
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6. ARTÍCULOS TÉCNICOS
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ración de CEPSA por el envío de las and the deeply branching and 589-608. 81
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