El documento describe una investigación sobre nuevas tecnologías y la aplicabilidad de antioxidantes en alimentos. Se diseñaron productos cárnicos funcionales con omega-3 y extracto de romero, los cuales se sometieron a pruebas de caracterización, estudios preclínicos en animales y un ensayo clínico con niños diabéticos para evaluar sus efectos antioxidantes y beneficios para la salud. Los resultados mostraron que los compuestos son biodisponibles y capaces de mejorar parámetros relacionados con el estrés oxidativo y el

1. ACTIVIDAD 6: NUEVAS TECNOLOGIAS Y APLICABILIDAD DE ANTIOXIDANTES EN MATRICES ALIMENTARIAS

2. Actividad 6: Nuevas tecnologías y aplicabilidad de antioxidantes en matrices alimentarias Actuaciones realizadas FRIAL - UAM Tarea 3. Formulación de matrices cárnicas con antioxidantes Diseño de productos cárnicos para ensayos clínicos con o sin funcionalidad Producción de matrices con contenido de sodio reducido Producción de matrices con mayor nivel de omega 3 y antioxidantes sobre las anteriores matrices bajas en sodio. Tarea 5. Caracterización de las matrices alimentarias y su capacidad antioxidante Análisis fisico-químicos, microbiologicos y nutricionales de productos para ensayos clínicos Análisis sensorial En curso En curso

3. Actividad 6: Nuevas tecnologías y aplicabilidad de antioxidantes en matrices alimentarias METODOLOGÍA Diseño de formula funcional de productos cárnicos bioactivos Consiste en una mezcla de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 de cadena larga (EPA y DHA) En primer lugar estos aumentan en los productos cárnicos la proporción de grasas insaturadas sobre las saturadas. En segundo lugar añadidos en la proporción necesaria, los ácidos grasos omega-3 equilibran el contenido en ácidos grasos omega-6 que de forma natural contiene la carne de cerdo o la de ave. La formula contiene también extracto supercrítico de romero Aporta estabilidad oxidativa a la matriz funcional Posee una actividad biológica potencial de alto interés, a la vista de los estudios publicados y de los realizados en el propio proyecto. La formulación de los productos cárnicos funcionales está próxima a concluir. Se espera a los resultados de los estudios del segundo ensayo clínico para realizar los últimos ajustes de la misma.

4. Actividad 6: Nuevas tecnologías y aplicabilidad de antioxidantes en matrices alimentarias METODOLOGÍA Diseño de los productos para ensayos clínicos Segundo ensayo clínico en el Hospital Universitario de La Paz de Madrid, Servicio de Cardiología Matrices con CONTENIDO DE SODIO REDUCIDO. REGLAMENTO 1924/2006 matrices con superior nivel de omega 3 y antioxidantes sobre las anteriores matrices bajas en sodio

5. Actividad 6: Nuevas tecnologías y aplicabilidad de antioxidantes en matrices alimentarias RESULTADOS OBTENIDOS Caracterización de matrices alimentarias y su capacidad antioxidante - Perfil de ácidos grasos 0,6 6,4 1,6 13,8 0,7 12,2 1,8 17,7 n-6/n-3 5,1 0,4 9,6 1,6 9,0 0,8 6,8 0,9 n-3 3,2 2,3 15,5 21,8 6,6 9,9 12,2 15,7 n-6 44,7 50,1 37,3 41,1 43,1 43,5 42,5 45,5 monoinsaturados 42,1 42,2 32,6 30,5 36,3 40,7 33,4 32,9 saturados 1,7 0,0 2,8 0,0 2,8 0,0 2,0 0,0 DHA (C22:6) n-3 0,2 0,0 0,4 0,0 0,4 0,0 0,4 0,0 DPA (C22:5) n-3 2,9 0,0 4,9 0,0 4,9 0,0 3,5 0,0 EPA (C20:5) n-3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Estearidonico (C18:4) n-3 1,2 0,2 1,8 0,4 2,1 0,6 1,6 0,5 C20:1 0,3 0,4 1,5 1,6 0,9 0,8 1,0 0,9 Linolenico (C18:3) n-3 3,2 2,3 15,5 21,8 6,6 9,9 12,2 15,7 Linoleico (C18:2) n-6 37,8 44,4 28,8 35,1 35,6 39,9 36,4 41,5 Oleico (C18:1) 12,1 12,4 6,7 6,4 9,4 13,9 8,4 9,3 Estearico (C18:0) 5,7 5,6 6,7 5,7 5,4 2,9 4,6 3,5 palmitoleico (C16:1) 25,8 26,7 22,5 22,9 23,2 25,4 22,0 22,3 Palmítico (C16:0) 4,2 3,1 3,4 1,1 3,7 1,4 2,9 1,3 Mirístico (C14:0) TF T SF S LF L JF J porcentaje molar

6. Actividad 6: Nuevas tecnologías y aplicabilidad de antioxidantes en matrices alimentarias RESULTADOS OBTENIDOS Caracterización de matrices alimentarias y su capacidad antioxidante Actividad Antioxidante Índice de Oxidación 37.41 TF 23.63 Ternera control 37.06 LFV 22.61 Lomo control 53.06 SF 33.30 Salchicha control 64.82 JF 29.86 Jamón control AA% Muestra

7. Actividad 6: Nuevas tecnologías y aplicabilidad de antioxidantes en matrices alimentarias RESULTADOS OBTENIDOS Caracterización de matrices alimentarias y su capacidad antioxidante Análisis Sensorial 4,1 4,1 4,3 4,1 4,2 4,1 Producto envasado Salchicha pavo 4,8 4,6 4,7 4,7 4,6 4,7 Producto envasado Pechuga pavo 4,7 4,9 4,8 4,6 4,5 4,8 Producto envasado jamón 4,8 4,6 4,1 4,9 4,9 4,9 Producto envasado Ternera 2 2,2 2,2 2,3 2,5 2,1 Control salmuera/masaje L-8 L-7 L-6 L-5 L-4 L-3

8. Actividad 6: Nuevas tecnologías y aplicabilidad de antioxidantes en matrices alimentarias CONCLUSIONES Los extractos de romero y los PUFA omega-3, así como la combinación de ambos, tienen capacidad potencial de regular la liberación de citoquinas proinflamatorias además y la producción del NO por la iNOS y por tanto de prevenir la aparición de enfermedades crónicas con base inflamatoria y atenuar sus complicaciones. Se pueden considerar satisfactoriamente alcanzados los objetivos relativos al DISEÑO DEL PRODUCTO FUNCIONAL , elección y caracterización de los ingredientes, validación de la composición de los productos funcionales. Transcurridas las dos tres primeras anualidades del desarrollo del proyecto, el grado de avance es superior al previsto. AVANCE 2009/2010 La formulación de los productos cárnicos funcionales está próxima a concluir. Se espera a los resultados de los estudios clínicos para realizar los últimos ajustes de la misma. En 2010 se CONCLUIRÁ el segundo estudio clínico y el estudio de metabolómica. Con los resultados obtenidos se realizará el ajuste de la fórmula funcional.

9. ACTIVIDAD 7: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE NUEVOS INGREDIENTES Y MATRICES ALIMENTARIAS

10. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias Actuaciones realizadas FRIAL - UAM Tarea 1: Biodisponibilidad de ingredientes funcionales solos o incorporados a matrices alimentarias Tarea 2: Estudio de la actividad biológica en animales de experimentación Tarea 3: Ensayos clínicos

11. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias METODOLOGIA Biodisponibilidad de ingredientes funcionales solos o incorporados a matrices alimentarias Se ha evaluado el efecto de la digestión in vitro sobre un extracto enriquecido en antioxidantes obtenido por extracción con fluidos supercríticos. El extracto contiene grandes niveles de diterpenos fenólicos. También se ha estudiado su absorción in vitro usando monocapas de células Caco-2. El objetivo era hacer un seguimiento del efecto de ambos procesos en los niveles de diterpenos fenólicos y en su capacidad antioxidante para dar recomendaciones a la hora de formular alimentos funcionales que contienen este tipo de extractos para mejorar o potenciar su biodisponibilidad.

12. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias METODOLOGIA Estudio de la actividad biológica en animales de experimentación Se planteó el estudio preclínico sobre ratas Wistar geriátricas de 20 meses de edad, al objeto de evaluar la capacidad reductora de parámetros de estrés oxidativo de los cárnicos funcionales Se suministró a los animales durante 8 semanas una cantidad de producto cárnico funcional que representaba el 20% de su dieta. Tras el sacrificio, se determinaron los niveles de radicales libres y enzimas antioxidantes en tejido cardíaco y cerebral (corteza e hipocampo). Se emplearon dos lotes de productos: el estándar (relación omega-6/omega-3 menor que 4 y 0,02% de extracto supercrítico de romero) y un lote enriquecido 10 veces en extracto de romero (relación omega-6/omega-3 menor que 4 y 0,2% de extracto supercrítico de romero).

13. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias METODOLOGIA Ensayos clínicos Diseño del ensayo clínico : Ensayo clínico prospectivo, randomizado, doble-ciego, llevado a cabo en el Hospital Infantil La Paz de Madrid. El estudio tendrá una duración total de 20 meses, siendo 12 meses el tiempo de la fase de seguimiento de cada individuo Procedimiento del ensayo clínico : El planteamiento del estudio del efecto de estos alimentos en una población de niños diabéticos se basa en la posibilidad de prevenir la aparición de enfermedades asociadas a situaciones de estrés oxidativo que suelen aparecer en una edad adulta (polineuropatías, enfermedades cardiovasculares, etc.). Tamaño de la muestra : En total, participan 45 individuos (30 con diabetes mellitus tipo 1 y 15 individuos sanos) divididos en tres grupos de tratamiento. La totalidad de la muestra será reclutada en el Hospital Infantil La Paz de Madrid.

14. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias METODOLOGIA Ensayos clínicos Variables a estudiar : 1. Generales: Edad cronológica, Edad Ósea, Estadío de Tanner, Sexo. 2. Historia de diabetes mellitus tipo 1 (edad de diagnóstico, complicaciones asociadas…),Tensión Arterial. 3. Perfil bioquímico básico: Fórmula y recuento sanguíneo completo. Homeostasis de la glucosa: glucosa en sangre y HbA1c. Perfil lipoproteico en sangre: colesterol total, HDL-colesterol, triglicéridos. Función Renal: Creatinina y urea. Estado Nutricional: proteínas totales 4. Perfil metabólico: Glucosuria, Microalbuminuria, Cetonuria 5. Perfil de estrés oxidativo: Tocoferol, Glutation reducido y oxidado, nitrosamina, Ácido Tiobarbitúrico (TBARs), Isoprostanos, Ácidos orgánicos de cadena corta (Ácido láctico, acetoacético…), Hidroperóxidos.

15. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias RESULTADOS OBTENIDOS Bioaccesibilidad de los diterpenos fenólicos Concentraciones iniciales antes de la digestión y fracción oleosa residual El 46.7% de la concentración inicial total de diterpenos es bioaccesible . El resto, el 28.6 % (de media) de la concentración inicial que no fue micelado sufrirá degradación química espontánea o será tal vez transformado por la flora intestinal o excretado en las heces.

16. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias RESULTADOS OBTENIDOS Efecto de la digestión in vitro en las propiedades antioxidantes del romero Después de la digestión gástrica se perdió un 55% de la actividad inicial. El 50% de la actividad antioxidante inicial fue bioaccessible

17. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias RESULTADOS OBTENIDOS Biodisponibilidad. Absorción de micelas mixtas por monocapas de Caco-2 El 45% de la actividad antioxidante detectada inicialmente no se absorbía pero el 31% (de media) era biodisponible . Biodisponibilidad de los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 de cadena larga: se ha observado que más del 30% del total presente en el aceite inicial están presentes en la fase micelar resultante de la digestión y por tanto es biodisponible . Las fracciones micelares resultantes de las digestiones in vitro se adicionaron a cultivos de células Caco-2 para evaluar si esos 46.7% de diterpenos fenólicos que habían sobrevivido a la digestión eran capaces de atravesar la monocapa celular.

18. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias RESULTADOS OBTENIDOS Estudios de actividad biológica in vivo en animales de experimentación El extracto supercrítico de romero a ciertas dosis es capaz de mejorar el perfil lipídico plasmático en animales de experimentación, con el consiguiente efecto potencial de reducción del riesgo cardiovascular. En los órganos estudiados se pudo detectar un efecto antioxidante significativo con los dos lotes de productos. Los resultados más favorables se obtienen con los productos estandar (0,02% de extracto de romero) y suponen evidencias sobre posible funciones cardioprotectora y antioxidante en tejido cerebral, aunque la base fisiológica de estos efectos aun no ha podido ser determinada.

19. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias CONCLUSIONES Los resultados de biodisponibilidad deben entenderse como una confirmación de mínimos de que tanto la actividad antioxidante como los omega-3 son biodisponibles y por tanto capaces de producir efecto saludable en el cuerpo humano Los % de biodisponibilidad deben tenerse en cuenta a la hora de dosificar el extracto a añadir al producto funcional, pero considerando que es previsible que la digestión y absorción intestinales fisiológicas en humanos conduzcan a una biodisponibilidad real mayor que la estimada in vitro en el laboratorio. El extracto supercrítico de romero a ciertas dosis es capaz de mejorar el perfil lipídico plasmático en animales de experimentación , con el consiguiente efecto potencial de reducción del riesgo cardiovascular. Se ha realizado también la evaluación, VALORACIÓN IN VITRO de su estabilidad, actividad antioxidante y reguladora de la producción de mediadores de la inflamación, de la BIOACCESIBILIDAD y BIODISPONIBILIDAD de los ingredientes bioactivos. Se ha realizado la evaluación de la BIOACTIVIDAD EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN . Se ha concluido la fase experimental de un estudio clínico y se han planificado los estudios de metabolómica.

20. Actividad 7: Estudio de la actividad biológica de nuevos ingredientes y matrices alimentarias AVANCE 2009 El estudio clínico descrito constituye el marco idóneo para la realización de un estudio en el que se determinen los cambios metabólicos que potencialmente se produzcan debidos a la intervención dietética. En el momento de emitir este informe ya se ha realizado la toma de muestras y en las próximas semanas se comenzará el análisis de metabolitos mediante técnicas analíticas avanzadas. En 2009 se concluirá el PRIMER ESTUDIO CLÍNICO completando los análisis de los múltiples biomarcadores previstos. Se inciará un SEGUNDO ESTUDIO CLINICO para profundizar en el efecto de lo productos cárnicos funcionales en la reducción del riesgo cardiovascular. Se continuará el estudio de metabolómica. En 2010 se CONCLUIRÁ el segundo estudio clínico y el estudio de metabolómica. Con los resultados obtenidos se realizará el ajuste de la fórmula funcional.