Evaluación, validación y determinación de Vitamina A en alimentos infantiles por cromatografía liquida de alto rendimiento

1. VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA PARA LA
DETERMINACIÓN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS
INFANTILES INSTANTÁNEOS POR CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)
Aaron Ku Llerena Arroyo, Gladis Sanchez Culqui, Rosita Riega Mejía.
aaron.llerena@unmsm.edu.pe
INTRODUCCIÓN
La vitaminaA tambiénse conoce comoRetinol ovitamina
Antixeroftálmica,esunasustanciaorgánica,soluble enlas
grasas, que se encuentra en la naturaleza en dos formas:
como vitamina A activa o retinol, y como pigmentos
carotenoides o carotenos. Tiene funciones específicas y
debe estar contenida en la alimentación diaria en
cantidadesadecuadas(1).
Segúnvariosestudios,unacantidadadecuadade vitamina
A reduce la mortalidad en bebés y en niños de ciertas
poblaciones. El suplemento de vitamina A reduce las
muertes en los casos de sarampión. En otras
enfermedades como diarrea e infecciones respiratorias,
sin embargo, no hay pruebas confiables de que la
prevalencia de la morbilidad se reduzca con dosis de
vitaminaA.
Lossistemascromatográficoshansidomuyutilizadospara
la determinación de vitamina A en los alimentos,
permitiendoconseguirresultadosexactosyreproducibles
enla determinaciónde vitaminas.
Una de las técnicas que arroja buenos resultados para la
determinaciónde VitaminaA,eslaCromatografía Líquida
de AltaResolución(HPLC) enfase reversa(1).Estátécnica
consiste en que va a presentar dos fases, una fase
estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La fase
estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl . La
fase móvil actúade portadorde la muestra.
La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los
componentes de la solución emigran de acuerdo a las
interacciones no-covalentes de los compuestos con la
columna. Estas interacciones químicas, determinan la
separaciónde loscontenidosenlamuestra.(2)
Es así, que este estudio busca validar la metodología de
HPLC para la determinación de vitamina A contenida en
alimentosinfantilesinstantáneos.
MATERIALESY MÉTODOS
Se determinó mediante el método de HPLC, para la
determinación de vitamina A contenida en alimentos
infantilesinstantáneos.
Muestra
Alimentoinfantil(papilla)
Reactivos
- Metanol grado HPLC (Merk)
- Estándar all-transRetinol:VitaminaA (Sigma)
- Hexanop.a.(Merck)
- Etanol absolutop.a.(Merk)
- Soluciónde hidróxidode potasioal 50%
- AcidoAscórbico(BHT) (antioxidantes)
- Aguatridestilada(gradoHPLC)
Equipos
- HPLC (marca Shimadzu,modeloLC10A)
Condiciones típicas: sistema isocrático, flujo 1,2 mL/min,
volumen de inyección 20 ml, detección UV 242 nm,
temperatura de horno, ambiente, y tiempo de corrida 7
min. Fase móvil:metanol al 100% grado HPLC .

2. Figura 1. Diagrama deflujo del experimento, adaptado (Pérez, 2000)

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la figura 2 se observa la estructura molecular
del retinol,sus ésteres y algunos isómeros.
Figura 2. Estructura química de la Vitamina A (retinol)
Se evitó colocar la muestra y el extracto
directamente a laluz solar yluz brillante,debido
a que el retinol y sus ésteres son rápidamente
destruidos por esta, asimismo, por el oxígeno y
los ácidos, es por ello que, en este caso, se le
adiciona un antioxidante, el ácido ascórbico,
para retardar la ruptura de la vitamina A y
también se usó nitrógeno para que inhiba o
retarde la acción de los agentes de oxidación
presentes, respectivamente.
En la Figura 3 se muestran los cromatogramas
representativos a 5 ppm y 15 ppm de vitamina
A para la curva de calibración.
Figura 3. Cromatogramas de la curva de calibración
correspondientes a 5 ppm y 15 ppm de vitamina A.
Con los datos de la tabla 1, se observa que quien
eluye primero fue la de concentración mayor 15
ppm, ya que tuvo un tiempo de retención (tR)
menor (3 min), en comparación con el de
concentración menor 5 ppm (7 min), debido al
efecto de la polaridad y el tamaño de la
partícula, ya que una partícula pequeña es
atraída por los sitios polares de la fase
estacionaria. Además, a mayor concentración
de la muestra habrá mayor polaridad, y por
ende, será más rápida la elución.
El tiempo de retención de la vitamina A fue 3,91
± 0,5 min, siendo el tiempo total de análisis para
una muestra de 7 min, mientras que para la
muestra por el método de AOAC para determinar
vitamina A fue de 10 min.
Figura 4. Curva de calibración deVitamina A.
La respuesta de detección fue lineal en el rango
de concentraciones de 5 – 15 mg/g (Figura 4),
obteniéndose un coeficiente de correlación
r=0,99.
El límite de detección del método en base a la
señal / ruido (S/N) fue de 0,06 mg/g y el límite
de cuantificación de 0,58 mg/g.
Los resultados de la precisión del sistema,
basados en la variación del tiempode retención,
área y altura; se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Precisión del Sistema
Obteniéndose que con respecto a los datos de
forma teórica con los obtenidos en las muestras

4. de papilla de vitamina A presente, se observa
que cumple con lo indicado con respecto a la
área y tiempo de retención del pico de la
muestra de vitamina A, mientras que presentó
una altura menor a lo indicado por forma
teórica.
Otro ensayo realizado fue sobre la recuperación
de vitamina A presente en la papilla, la cual fue
de 97,98% vs. la obtenida por el método oficial
de la AOAC (de 98,8%) siendo la referencia
teórica.
Figura 4. Cromatograma demuestra con espectro del
analito.
La especificidad del método se muestra en la
Figura 3, donde se observa la ausencia de
interferencias debido a la adecuada extracción
del analito,y además se muestra lacomparación
del espectro del estándar puro vs el espectro del
analito en la muestra.
En 2005, Lopez desarrolló y validó una
metodología para la cuantificación de vitamina A
enleche humanamedianteHPLC,se determinaron
losnivelesen223muestrascorrespondientesalos
meses 5, 6 y 7 posparto. Las muestras (500 µL) se
saponificaronconhidróxidode potasio/etanol,se
extrajeronconhexano,se llevaronasequedadyse
reconstituyeronconmetanol.Se utilizócomofase
móvil metanol /agua (91:9 v/v) y detector de
fluorescencia (l excitación 330 nm y l emisión 470
nm) para la separación y cuantificación de
vitaminaA.Losparámetrosanalíticosde linealidad
(r2
: 0,9995), límites de detección(0,010 µg/mL) y
de cuantificación (0,025 µg/mL), precisión del
método(desvíoestándarrelativo,RSD=9,0% enel
día y RSD = 8,9% entre días) y exactitud
(recuperación = 83,8%) demostraron que el
método desarrollado permite cuantificar la
vitaminaA enforma eficiente (4)
Martinez et al. reportó la utilidad de un método
que determina simultáneamente retinol y α-
tocoferol en leche materna por cromatografía
líquidade alta resolución.
Posterior a la extracción de la leche materna, las
muestras se saponificaron con hidróxido de
potasio-metanol, se extrajeron con éter de
petróleoyse secaronyreconstituyeronconetanol.
Para establecer las condiciones del sistema
cromatográficose utilizócomofasemóvil metanol-
agua (96:4 v/v),longitudde onda325 para retinol.
(5)
En una investigaciónanterior, (1997) de la Revista
Colombiana de química, se valida una técnica de
cromatografía líquida de alta eficiencia para la
determinaciónycuantificaciónde lavitaminaA en
bienestarinacruda(mezclainiciainfantilproducida
por el Institutocolombianode
bienestarfamiliar)
Se lleva a cabo la determinación del método
analítico mediante el uso de patrones de
concentración conocida como palmitato de
vitamina A, la determinación mediante HPLC fue
lineal entre 1,75 y 8.5UI, las mejores condiciones
encontradas son 10 gramos de muestra 0,5% de
hidroquinona.
El autor menciona que la extracción sólido-líquido
es más exacta, rápida, menos tóxica y con mayor
poder de recuperación que el método de
extracción líquido líquido. Se constató que el
método es rápido y reproducible para análisis de
carotenos y de retinol en alimentos compuestos
por matrices sencillas como jugo de frutas y de
algunas matrices a base de almidón como
alimentosinfantiles.
Es necesario poner a punto un método de
extracción que permita obtener la vitamina en
nivel de concentración que esté dentro del Rango
lineal del métodoanalíticoparalocual se estudian
tres diferentespesosde muestrainicial: 5, 10 y 15
gramos, se estudia el uso de hidroquinona como

5. antioxidante al 5 10 y 15% y la adición de Alfa
amilasa con el fin de degradar los polisacáridos
presentesenla muestraque absorbenla vitamina
e impidensuextraccióncuantitativa.
CONCLUSIÓN
El método HPLC es preciso, exacto, lineal y
altamente sensible para ser utilizado en el control
de calidad de alimentos infantiles instantáneos
para la determinaciónde vitaminaA.Asimismo,los
parámetrosevaluadosse encontrarondentrodelos
rangos establecidos.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. FAO. Capítulo 11: Vitaminas.[ internet].[Citado el 19
de septiembre del 2020].
Disponible en:
http://www.fao.org/3/W0073S/w0073s0f.htm.
2. Pérez R. Estudio de validación dela metodología para
la determinación de vitamina A en alimentos
infantiles instantáneos por cromatografía líquida de
alto rendimiento (HPLC). Rev Med Exp. 2000; 17 (1-
4): 26-29.
3. López Laura B, Baroni Andrea V., Rodríguez
Viviana G, Greco Carola B, Costa Sara Macías,
Rodríguez de Pece Silviaetal .Desarrollo y validación
de un método por HPLC para la determinación de
niveles devitamina Aen leche materna. Su aplicación
a una población rural de Argentina. ALAN [Internet].
2005 Jun [citado 2020 Sep 21] ; 55(
2 ): 140-143.
Disponible en:
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttex
t&pid=S0004-06222005000200006&lng=es. 4.
Martínez-Rojano, Hugo & sámano, Reyna &
Tolentino, M. & Hernández, R.M. & Ramirez, Cristina
& Pizano-Zárate, María. (2017). Utilidad de un
método que determina simultáneamente retinol y
α-tocoferol en leche materna por cromatografía
líquida de alta resolución. Perinatología y
Reproducción Humana. 30.
10.1016/j.rprh.2016.11.009.