Seminario de artículo de investigación, Biología Molecular 2014.

1. Histone acetylation may suppress
human glioma cell proliferation
when P21waf/Cip1 and gelsolin are
induced
Presentado por:
• María Gabriela Novoa
• Christian Ramírez Rodríguez

3. Introduction
• The histone deacetylase inhibitors
(HDACs) have been widely
studied as anti-cancer drugs.
• The most studied drugs have been
NABT and Trichostatin A.
• 5 glioma cell lines, T98G, A172, U-
87 MG, U-118 MG and U-373 MG
were studied.

4. Introduction
• After treatment with NABT and trichostatin
A, the cells developed a fundamental
process to block cell proliferation in glioma.
• In some cell lines the apoptosis process
was essential, while in others it was more
significant expression of p21 and gelsolin
important in cell cycle control proteins.
• HDAC inhibitors suppress cell proliferation.
Stimulating apoptosis and decreasing the
synthesis of DNA.

5. Histone
• Simple, basic, small proteins.
(11000-21000 Da).
• Positively charged (rich in Arg
and Lys).
• Histones are five types: H1,
H2A, H2B, H3, H4.

6. Histone
• DNA and Histone: Nucleosome.
• Some post-translational modifications: acetylation,
methylation, phosphorylation, ribosylation.

7. Histone
Functions:
• Chromatin structural
organization.
• Phosphate groups
neutralized.
• Packing of DNA.
• Controlling replication and
transcription.

8. Glioma
• These tumors grow on
nerve tissue
(intraparenchymal).
• Diffusely, are not
delimited from the rest of
the parenchyma
(invasive).

9. Glioma
• Astrocytoma, Ependymoma, Oligodendroglioma.
• Are classified into 4 grades according to aggressiveness
and malignancy (Kernohan classification).

10. Glioma
Characteristic:
• Brain edema.
• Blood-brain barrier damage.
• Necrosis.
• Epilepsy.
• Decreased intellectual capacity.
• Loss of strength and sensitivity.
• Loss of memory, vision, speech.

11. Gelsolin
• Globular protein of 82 KDa. Protease activity.
• Six subdomains: S1-S5 each with five beta-sheets
and two alpha helices.
• Belongs to the superfamily of villin.
• Gelsolin fixed PIP, gelsolin is stimulated by an
increase in cytosolic calcium.

12. Gelsolin
Functions:
• Cap protein and can prevent
the loss and addition of G actin
molecules.
• In the presence of calcium,
promotes fragmentation of actin
filaments and prevents further
growth and disrupts the
cytoskeleton.

13. p21WAF/Cip1
• Is a protein that in humans is encoded by the CDKN1A
gene located on chromosome 6 (6p21.2).
• p21 is a potent cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI).
• Regulator of cell cycle progression at G1 and S phase.
• p21 can mediate cellular senescence.
• The expression of this gene is tightly controlled by the
tumor suppressor protein p53.

14. p21WAF/Cip1

16. General AIM
• The general aim of the
research is to evaluate the
antiproliferative activity of
HDAC inhibitors (NaBT and
Trichostatin A) on 5 glioma cell
lines, T98G, A172, U-87 MG,
U-118 MG and U-373 MG.
With the examination of the
altered expressions in p21 and
gelsolin genes.

17. Materiales y métodos
Cultivo celular
• Las células son puestas en
medios de cultivo con varios
aditivos con el fin de
garantizar un buen crecimiento
y desarrollo de las células.
• Se añadieron inhibidores de la
HDCA.

18. Materiales y métodos
Cultivo celular
En esta investigación se utilizó para que las 5 líneas de
células de glioma maligno humano tengan un buen
medio para proliferar.

19. Materiales y métodos
Ensayo de proliferación celular
• En pocillos se siembran
cierta cantidad de células a
condiciones especificas
(tiempo, temperatura, entre
otros) para incubarlas, luego
se miden con
espectrofotometría.

20. Materiales y métodos
Ensayo de proliferación celular
• Se utilizó en esta investigación para comparar el
crecimiento de las células en un medio que contenía
inhibidores de la HDAC Vs las que estaban en SFB.

21. Materiales y métodos
Ensayo de fragmentación del DNA
• Se recolectan y sedimentan
las células, se lavan y se
resuspenden, luego se tratan
con un tampón de lisis
celular y luego se incuban.
• ADN se precipitó con etanol
y se resuspendió en agua
destilada.

22. Materiales y métodos
Ensayo de fragmentación del DNA
• Las células se sometieron a electroforesis en gel de
agarosa.
• El gel se tiñó con bromuro de etidio, y el DNA se visualizó
usando un Transilluminater UV.

23. Materiales y métodos
Ensayo de fragmentación del DNA
Se utilizó para separar el DNA
de las otras proteínas que
también son objeto en el
estudio.

24. Materiales y métodos
Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo
• Basada en la utilización
de luz laser.
• En este procedimiento las
células se tratan y se
fijan. Luego se analizan
para detectar una
población celular entre
otras presentes en la
misma muestra.

25. Materiales y métodos
Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo
Se utilizó para detectar líneas celulares específicas y
evaluar el ciclo celular.

26. Materiales y métodos
Aislamiento y fraccionamiento de histona
• Las histonas se precipitaron
con acetona.
• Se centrifugaron, secaron y
resuspendieron en agua
destilada.

27. Materiales y métodos
Aislamiento y fraccionamiento de histona
• Acetilación de histonas se
evaluó por histonas de
fraccionamiento en geles de
ácido / urea / poliacrilamida.
• Y luego se tiñeron los geles.

28. Materiales y métodos
SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia
• Las proteínas se separan por electroforesis por la
técnica SDS-PAGE, en una solución con SDS cargada
(-). Las proteínas se transfieren a un filtro y se incuban
con anticuerpos que reaccionan con la proteína de
interés.

29. Materiales y métodos
SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia
• Se utilizó para identificar
las diferentes proteínas
que son objeto de
estudio en esta
investigación .

30. Results
HDA, alteran las fases
del ciclo celular

31. Results
• Las células T98G, A172
y U118, indican que
sufrieron apoptosis.
• U-87 MG y U-373 MG, la
apoptosis fue menor.

32. Results
• Acetilación de Histonas Fracción en 4 H4

33. Results
Regulación en alta de p21
y gelsolin
Análisis inmunoblot

34. Results
Expresión temporal del gen p21 y gelsolin en T98G

35. Discussion
Author Phrase Agree Desagree
Gibson et al., 1999 “ paradoxical effect of butyrate”
“The growth inhibition was apparent
in glioma cells by treatment with
both NaBT and TSA, but a
paradoxical effect was observed by
treatment with NaBT”
Hargreaves et al.,
1989, Stockhammer
et al., 1995,
Engelhard et al.,
1998
“ NaBT, phenyl acetate and phenyl
butyrate were not recognized as
HDAC inhibitors”

36. Discussion
Author Phrase Agree Desagree
Harada et al.,
2000
“ Reported growth inhibition after
transfection of the p21 gene into
glioma cells”
Thompson et al.,
1998
“ Histone acetylation clearly must
alter expression of other genes
involved in cell growth, such as
c-MYC, c-MYB, and more”

37. Conclussion
 The HDAC inhibitors are a great idea to treat differents
types of cancer, due to number of actions that cause
like inhibit the cell proliferation and cell cycle, and
induce apoptosis.
 Through HDAC inhibitors we can induce p53 protein
function, reducing the risk of developing cancer.

38. Conclussion
• We can achieve reduce the effects caused by
chemotherapy and radiotherapy with new drugs
alternatives, like HDAC inhibitors.
• We can conclude that acetylation of histone proteins,
play a crucial role in the regulation of cell growth and
activation of apoptosis or programmed cell death.

41. Referencias Bibliográficas
• Hideki Kamitani; Seijiro Taniura; Kenji Watanabe; Makoto
Sakamoto; Takashi Watanabe; Thomas Eling. “Histone
acetylation may suppress humanglioma cell proliferation
when p21WAF/Cip1and gelsolin are induced”. Neuro-
Oncology. Pp: 95 – 101.