Pcr en endodoncia

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
SAN LUIS POTOSÍ
MAESTRÍA EN ENDODONCIA

EDUARDO RODRÍGUEZ CASTRO

BIOLOGÍA MOLECULAR EN
MICROBIOLOGÍA

¿Qué es la biología
molecular?
 Estudio de la estructura, función y
composición de las moléculas
biológicamente importantes.

http://mc2coruna.org/domus/genetica/html/adn.html

¿Qué es la microbiología?
 Microbiología: es la rama de la
biología encargada del estudio de
los microorganismos, seres vivos
pequeños, también conocidos
como microbios.

http://www.google.com.mx/imgres?q=e+fecali+en+el+conducto+radicular&hl=es&sa=X&gbv=2&biw=1366&bih=643&tbm=isch&tbnid=33idI101o_y9kM:&imgrefurl=http://www.iztacala.unam.mx/rrivas/NOTAS/Notas13Microbiologia/genpatpersistentes.html&docid=lCj
AfVcLL-ctuM&imgurl=http://www.iztacala.unam.mx/rrivas/imagenes/microbiologia/enterococcus-faecalis.jpg&w=192&h=224&ei=MMi9T9WsGKKi2wWxj4CHDw&zoom=1

Un poco de historia…….

Watson y Crick, escribieron
en 1953, ― esta estructura
tienen una novedosa
característica, la cual la
hace tener un
considerable interés
biológico‖.

http://www.galileog.com/ciencia/biologia/adn/adn1.htm#descubrimiento

ADN
 Sustancia química donde se
almacenan las instrucciones
que dirigen el desarrollo de
un huevo hasta formar un
organismo adulto, que
mantienen su funcionamiento
y permiten la herencia.

http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/cromosomas.htm

ADN
 Azúcares, llamados
desoxirribosas,
 Ácido fosfórico
 Bases
nitrogenadas: la
adenina, la
timina, la guanina, y
la citosina.

http://mc2coruna.org/domus/genetica/html/adn.html

Replicación, Transcripción Y
Traducción

http://www.youtube.com/watch?v=JQvGvnUIFUw

Sensibilidad y Especificidad

 En microbiología:
 la sensibilidad analítica, es la
capacidad de una prueba para
detectar pequeñas cantidades
de un organismo o substancia en
una muestra.
 Especificidad: es la capacidad
para identificar a
microorganismos correctamente.

Microbiological and molecular analysis of endodontic infections, J. CRAIG BAUMGARTNER Endodontic Topics
2004, 7, 35–51

En endodoncia….
 La identificación de organismos que causan
procesos infecciosos es el objetivo para
comprender la enfermedad y así proveer un
tratamiento antimicrobiano efectivo.
 La detección e identificación de todos los
microorganismos asociados ha sido difícil.
 No hay una correlación absoluta entre especies
microbianas específicas o en combinación con
signos y síntomas clínicos.

Microbiological and molecular analysis of endodontic infections, J. CRAIG BAUMGARTNER Endodontic Topics 2004, 7,
35–51

No cumplen con los postulados de Koch. Generalidades; Métodos
Moleculares
 Los métodos moleculares son:
sencillos, rápidos y más precisos que los
métodos tradicionales de cultivo.

 Ventaja:
 No se necesitan organismos viables.
 Objetivos:
 Separación de los ácidos nucleicos.
 Dejar una muestra no infecciosa.
 Eliminar sustancias inhibidoras.
 Desventaja:
 los organismos no son cultivados.
Microbiological and molecular analysis of endodontic infections
J. CRAIG BAUMGARTNER Endodontic Topics 2004, 7, 35–51

Exploiting Molecular Methods to Explore Endodontic Infections: Part 1—Current Molecular Technologies for Microbiological Diagnosi

PCR:Reacción en cadena de la
polimerasa
J. F. Siqueira, Jr, DDS, MSc, PhD, and I. N. Roˆc¸as, DDS, MSc, PhD

 Método molecular, diseñado por Kary
JOE — Volume 31, Number 6, June 2005

Mullis en 1983. premio nobel de
química 1993.
 Capaz de amplificar una pequeña
copia de un gen a millones o billones
de copias de ese mismo gen.
 Hoy en día, es posible aislar cualquier
gen de cualquier organismo usando
PCR.
Microbiological and molecular analysis of endodontic infections, J. CRAIG BAUMGARTNER Endodontic Topics 2004, 7,

Ventajas de la PCR

 A partir de una muestra pequeña de ADN se
puede obtener una cantidad considerable
para el estudio que se vaya a realizar.
 El producto se puede utilizar para
clonar, secuenciar y análisis.
 Se puede amplificar ADN de cualquier
organismo vivo o muerto.

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html

Desventajas de la PCR
 Se puede reproducir solamente partes del
genoma en donde se conoce por lo menos
una mínima secuencia de 20 – 40 pb.
 Se necesitan ―primers‖ específicos que
sean complementarios al fragmento que se
desea sintetizar.
 La polimerización puede tener errores al
sintetizar el ADN.
 Puede contaminarse con otro ADN (puede
ser del mismo investigador o de cualquier
otro)

Aplicaciones de la PCR
◦ Sus aplicaciones son múltiples:Detección
de agentes infecciosos.
◦ Análisis de DNA de cualquier organismo
vivo o muerto, análisis de fósiles
◦ Mutagénesis dirigida (cambios en la
información contenida a través de
―primers‖ con mutaciones)
◦ Investigación forense
◦ Pruebas de paternidad


¿PCR?

 La polimerasa es una enzima capaz
de transcribir o replicar ácidos
nucleicos. Resultan cruciales en la
división celular (ADN polimerasa) y en
la transcripción del ADN (ARN
polimerasa).
 Se realiza de manera exponencial.

Microbiological and molecular analysis of endodontic infections
J. CRAIG BAUMGARTNER Endodontic Topics 2004, 7, 35–51

Componentes de la PCR

 La Taq polimerasa
 El amortiguador
 El ADN molde
 Los oligonucleótidos (dNTPs)

Microbiología Humana, Eugene W. Nester et al, manual
moderno, 5ª edición, pág. 262.

Taq polimerasa

 Un factor muy importante de la PCR
es la DNA polimerasa estable en el
calor, de un termófilo, Thermus
aquaticus.
 La Taq polimerasa, a diferencia de la
DNA polimerasa de E. Coli, no se
destruye a altas temperaturas, por lo
tanto podrá desnaturalizar DNA en el
primer paso de cada ciclo etde la
Microbiología Humana, Eugene W. Nester al, manual
amplificación.

Amortiguador
 Solución buffer: 50mM KCl, 10mM
Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura
ambiente). Su función la de resistir los
cambios de pH.
 MgCl2: (cloruro de magnesio)Puede
estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se
usa 25mM -Es un cofactor para la
función de la polimerasa-


ADN molde
 Es una parte de ADN, a partir de la cual se realizará
la amplificación.
 El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000
nucleótidos de longitud.
El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-
500 ng.

Microbiología Humana, Eugene W. Nester et al, manual moderno, 5ª edición, pág. 262.

Oligonucleótidos

 Cebadores Son “primers”:
secuencias cortas de nucleótidos 20-
24 nucleótidos de
longitud, complementarias a una
región del DNA que se quiere
amplificar. -Se usa a concentración de
1 M-


 El primer paso para esta técnica es la
extracción de DNA.
Técnica de PCR
 A partir de la muestra de realiza lo
siguiente: Tubo de Ependorf, 2 ml.
250 µL Buffer de lisis celular. (NaCl 0,1 M;
sacarosa 0,2M; EDTA 50mM, tris-HCl 100Mm
pH8,25; SDS 0,05 %).
Proteinasa K, 10mg/ml
Se incuba a 65 °C por una hora
Se mezcla, vortex 1
min.
300 µL de etanol
Se mezcla, vortex 1
min.
Cloroformo 300 µL
Se mezcla, vortex 1
min.
Centrifugado 14 mil rpm. 15 min Retirar fase acuosa
Etanol al 100% 1 Se precipita el DNA.
ml.
Centrifugado 5 min.
300 µL de etanol
Centrifugado 5 min.
Pasta blanca
http://es.scribd.com/doc/20820913/EXTRACCION-DE-ADN-DE-mosquito-y-sangre
http://www.youtube.com/watch?v=qH_c-3VKI6U

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Alfredo G. torres y Beatriz
Eugenia Baca, Centro de investigaciones microbiológicas instituto de ciencias,
Universidad autónoma de puebla Elementos, no. 23. Vol. 3, 1995, pp. 16-21



tubo de Ependorf de .25 ml
electroforesis en gel
Ya con la extracción de DNA se
Técnica de PCR; amplificación y

prosigue a colocar el DNA diana en un


TERMOCICLADOR

PROPIEDAD DEL IPICYT, LABORATORIO DE PROTEOMICA, SLP. MEXICO

 Segundo paso:
 El DNA molde es incubado a alta
temperatura (92-98°C, por 30 a 90
segundos), en el termociclador para
separar las cadenas complementarias,
DESNATURALIZACIÓN del DNA y así
hacerlas accesibles al apareamiento con el
iniciador especifico.



 Tercer paso:
 ALINEAMIENTO, la mezcla de
reacción es enfriada para permitir que
los oligonucleótidos iniciadores se
alineen o hibriden las secuencias
complementarias del DNA blanco.


 Cuarto paso:
 EXTENSIÓN, se lleva a cabo a una
temperatura intermedia, en la cual la DNA
polimerasa copia el DNA entre las
secuencias correspondientes a los
oligonucleótidos iniciadores.
 Estas tres etapas constituyen un ciclo
térmico. En tanto que para un protocolo típico
de PCR se incluyen de 30 a 50 ciclos.


Exploiting Molecular Methods to Explore Endodontic Infections: Part 1—Current Molecular Technologies for Microbiological Diagnosis


exponencial
En el PCR hay una amplificación

 Electroforesis en gel
 Se usa para separar fragmentos de
DNA, de acuerdo a su tamaño.
 Técnica:
 Bloque de gel (agar o
poliacrilamida), con poros.
 Se coloca en el gel la muestra de DNA
previamente amplificado.

Electroforesis en gel El gel se somete a corriente
eléctrica.
El DNA tiene carga
negativa, por lo que los
fragmentos migran hacia
el electrodo positivo.

Las moléculas de
DNA más pequeñas
realizan su recorrido
más rápido en el gel.

Se tiñe la muestra con
bromuro de etidio.
Fluorescente a la luz UV
Cámara de
electroforesis

 La muestra al pasar por la cámara de
electroforesis esta lista para poder
analizarla, esto se logra mediante un
fotodocumentador.
 El cual emite luz UV sobre la muestra
y se identifica el ADN por su color
fluorescente.
 la información obtenida se registra en
el computador y se almacena la
fotografía.

 Fotodocumentador.

PROPIEDAD DEL IPICYT, LABORATORIO DE PROTEOMICA, SLP. MEXICO

 Analisis de resultados
 Cada banda fluorecente representa
millones de moleculas de un tamañao
especifico de DNA.
 Se mide el tamaño según las pares de
bases en Kb.
 1 Kb = 1,000 pares de bases.

Análisis de la secuencia del
rDNA 16S
 El rRNA, presente en todos los
organismos, realiza una tarea constante
y muy importante, limitando el numero
de mutaciones sin afectar al organismo.
 La secuencia del rDNA 16S es similar en
ciertas porciones a la de todos los
organismos.
 Sufre cambios muy lentos y por lo tanto
es útil para determinar cambios
recientes.
 Es efectiva para determinar la
filologénesis de organismos con relación
distante.

Hibridación del DNA
 Se determina la magnitud de la
similitud en la secuencia de
nucleótidos entre dos organismo a
medir.
 Las dos cepas que muestren cuando
menos similitud del 70% se
consideraran como miembros de la
misma especie.


Conclusión
 La inmensa cantidad de conocimiento
genético esta afectando a la
nomenclatura bacteriana. Mientras
mas genomas se secuencian, se hará
aparente la similitud evolutiva entre
los organismos.
 Todos estos cambios crearán una
fuente potencial de confusión para el
científico y el hombre en común.

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