Técnicas basadas en el ADN para la identificación de Cefalopodos (PCR-RFLP)

MEMORIA del PROYECTO
Bachillerato de Investigación y Excelencia. Curso 2016-2017
I.E.S. “Félix Rodríguez de la Fuente”
“Técnicas basadas en el ADN para la identi-“Técnicas basadas en el ADN para la identi-
ficación de Cefalópodos (PCRficación de Cefalópodos (PCR--RFLP)”RFLP)”
Alumnas: AÍda Álvarez Pardo, Jimena Vadillo Corcuera
Coordinador: Luis de Benito Aparicio.

Técnicas basadas en el ADN para la identificación de cefalópodos (PCR-RFLP)
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ÍNDICE
1. Introducción
2. Objetivo
3. Materiales y métodos
3.1. Muestras utilizadas
3.2. Extracción de ADN
3.3. Cuantificación y calidad de ADN por espectrofotometría
3.4. Amplificación del ADN mediante PCR convencional
3.5. Digestión de los productos de PCR mediante enzimas de restricción
(ER)
4. Resultados y discusión
4.1. Cuantificación y calidad de ADN extraído
4.2. Visualización de los productos de PCR
4.3. Visualización de las digestiones
5. Conclusiones
6. Bibliografía
7. Bibliografía online

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1. ABSTRACT
In order to provide a tool for the prevention of commercial frauds in fish
products, a polymerase chain reaction-restriction fragment length
polymorphism (PCR-RFLP) method has been developed.
This method allows us to clearly differentiate molluscs belonging to the family
Loliginidae from those belonging to the family Ommastrephidae. Cephalopods‟
16S r-DNA was amplified with PCR using a „„universal‟‟ primer pair, and the
amplification product was digested with Dra I and Mbo II restriction enzymes.
The resulting electrophoretic patterns of families Loliginidae and Ommastrephidae
showed characteristic 200 bp band and 600–700 bp band, respectively.
With this methodology, the 4 analysed species belonging to the genus Loligo
have also been differentiated.
2. INTRODUCCIÓN
Los cefalópodos (palabra de raíz griega que significa “pies en la cabeza”) son un
grupo de animales invertebrados marinos muy habituales en la cocina
mediterránea y oriental. En este grupo de animales podemos encontrar el
pulpo, el calamar, la sepia, el chopo, etc. Desde el punto de vista nutricional, un
cefalópodo es un alimento muy beneficioso para el organismo, ya que aunque
presenta una gran variedad de nutrientes (Tabla 1) su aporte calórico es
relativamente bajo (80 calorías/100 g).
Tabla 1. Valor nutricional de algunos cefalópodos.
Por cada 100
gramos
Calamar Pulpo Sepia
Proteínas 16,1 g 17,9 g 16,1 g
Hidratos de
carbono
0,7 g 1,4 g 0,7 g
Grasa total 1,40 g 1,4 g 0,9 g
Colesterol 167,5 mg 48 mg 110 mg
Agua 81,70 g 79,30 g 82,3 g
Zinc 1,2 mg 1,7 mg 1,2 mg
Selenio 65 mg 44,8 mg 65 mg
Vitamina B12 2 mg 3 mg 2 mg
Fuente: http://www.dietas.net/tablas-y-calculadoras/tabla-de-composicion-
nutricional-de-los-alimentos.

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A pesar de las escasas diferencias nutricionales entre los diferentes tipos de
cefalópodos su precio en el mercado es muy distinto (Tabla 2).
Tabla 2. Precio en lonja de los cefalópodos.
Calamar Pulpo Sepia Pota-volador
Precio 7,50 €/kilo 4 €/kilo 2,5 €/kilo 1,3 €/kilo
Fuente: Lonja del puerto Vigo. Precios del día 18 de noviembre de 2016.
http://www.apvigo.com.
La producción mundial en el 2012, según la FAO (Organización de las Naciones
Unidas para la Alimentación y la Agricultura), alcanzó 4.027.627 Tm. España
ocupa el lugar 17 en el ranking mundial con unas capturas de 57.797 Tm
volumen superior al de 2009 (46.134 Tm). La variedad de precios y la diversidad
de cefalópodos que se capturan obligan a un proceso de regulación de estos
productos para evitar fraudes alimentarios.
Por ejemplo, la Agencia Catalana de Consumo (ACC) sancionó en 2011 a seis
compañías del sector conservero español por la comercialización, bajo
diferentes marcas, de latas que anunciaban pulpo o calamar pero que en
realidad contenían otra especie de cefalópodos. Las sanciones ascendieron a un
total de 102.000 euros. En realidad, los productos envasados eran de las especies
Dosidicus gigas e Illex argentinus, conocidas comercialmente como potón del
pacífico y pota argentina, un tipo de cefalópodos de tamaño más grande que el
pulpo y el calamar.
Figura 1. En la parte superior se muestra a la izquierda la pota argentina (Illex
argentinus) y a la derecha el potón del pacífico (Dosidicus gigas). Tomado de
http://zomufish.com.pe.
Según la ACC, la escasez de pulpo provocó que algunas empresas envasasen
potón en vez de pulpo y calamar, a pesar de que su precio sea sensiblemente
inferior. Información extraída de la noticia del periódico “online”
www.elperiodico.com. La taxonomía dota de herramientas que permiten
diferenciar los animales por ejemplo, el género Octopus (pulpo) posee ocho
apéndices alrededor de la boca mientras que el resto de los géneros estudiados
tienen diez, la estructura del ojo sirve para separar el género Illex de Loligo y
Sepia, la forma de las aletas natatoria sirven para distinguir estos dos últimos

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géneros, el procesamiento industrial hace que estas características se pierdan,
por lo que resulta necesario utilizar otros métodos para poder diferenciarlos.
Figura 2. En la imagen se muestra la diferenciación taxonómica de distintas especies de
cefalópodos aunque el suborden Oegopsida incluye a los géneros Illex y Dosidicus que se
han mencionado anteriormente.
En este sentido, la identificación genética de las especies de cefalópodos
mediante técnicas moleculares ha sido uno de los métodos más desarrollado. En
los trabajos previos que se encuentran en la literatura científica se trató de
asignar a un valor taxonómico (familia, género, especie, etc.), un patrón de
bandas de ADN característico obtenido por la técnica PCR-RFLP. Esta técnica se
basa en amplificar una región de un gen que presente una baja variabilidad
genética y tratarlo con enzimas que lo cortan en fragmentos por sitios
específicos (enzimas de restricción). Posteriormente, los fragmentos que se
obtienen de esta digestión se separan por tamaños utilizando para ello una
electroforesis en gel de agarosa. El resultado final es una distribución de
diferentes bandas que corresponden a los diferentes tamaños de ADN
obtenidos y que se asemejan a un código de barras.
 Colombo et al. (2002) utilizaron esta técnica con el gen ADN-r 16S, una
pareja de cebadores “universales” y la enzimas de restricción Asn I, les
permitió reconocer dos familias: Loliginidae (Loligo) y Ommastrephidae
(Ilex) (Figura 3).

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Figura 3. Datos de la electroforesis del ADN en gel obtenidos por la técnica
PCR-RFLP de las familias de cefalópodos. En la foto podemos observar como
las especies de la familia Loliginidae (11-12, 14-17) presenta una banda a 200 bp
(base pair: pares de bases) y 600 bp que no presenta la familia Ommatrephidae (1-
5, 7-8). Mientras que la familia Ommastrephidae se diferencia de Loliginidae por
unas características bandas a 300 bp y 700 bp.
 De Luna et al. (2011), amplificaron el gen ADN-r 5S y para simplificar el
proceso no los trataron con enzimas de restricción, a la espera de que los
tamaños de los amplicones obtenidos en la PCR fueran suficientes para
diferenciarlos. Con el resultado obtenido llegaron a la conclusión de que
era posible reconocer los individuos analizados a nivel de especie,
género y familia (Figura 4).
Figura 4. Análisis de la PCR del gen 5S rDNA de seis especies de cefalópodos:
1- Loligosurinamensis, 2- Loligosanpaulensis, 3- Lolliguncilabrevis, 4-
Sepiotheuthissepioidea, 5-Ornithoteuthisantillarum, 6- Illexargentinus. Las cuatro
primeras especies son de la familia Loliginidae y todas tienen una banda a 650
bp, las otras dos son de la familia Ommatrephidae que presenta una banda
característica a 500 bp.
 Chapela et al. (2003) y Santaclara et al. (2007) también han aplicado las
técnicas moleculares también se han aplicado al gen para el citocromo
“b” con distintas combinaciones de enzimas de restricción (Tsp509 I y Nsi
I, Chapela et al. (2003) y Sfc I, Hph I, y Hinf I, Santaclara et al. (2007) así

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como distintos tipos de cebadores. Los resultados han permitido
diferenciar 8 especies de cefalópodos en el estudio de Chapela et al.,
mientras que el de Santaclara et al. abarca 20 especies entre Lologinidae y
Ommastrephidae, y, además, incluye una especie de la familia Sepiidae y
dos de la familia Octopodidae (Figura 5).
Figura 5. Resultados de la técnica PCR-RFLP del gen citocromo “b” con
enzimas Tsp509 I según Chapela et al. (2003).
3. OBJETIVO
Como podemos ver por la bibliografía, la técnica PCR-RFLP lleva muy poco
tiempo practicándose para la detección de fraudes alimentarios. El estudio de
genes y enzimas de restricción que permitan un análisis rápido y fiable está
todavía en desarrollo. Esto explica el hecho de que, aunque han transcurrido
quince años desde el inicio de esta metodología, el número de especies a las que
se le ha aplicado es muy reducido. Por todo ello, el presente proyecto estudia la
identificación de cuatro especies habituales en el mercado español: calamar
común (Loligo vulgaris), pota (Illex spp), sepia (Sepia spp) y pulpo común
(Octopus vulgaris). Para lograrlo amplificaremos un fragmento del gen ADN-r
16S presente en las mitocondrias y los fragmentos ampliados serán tratados con
las enzimas de restricción Dra I y Mbo II.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Muestras utilizadas
Para la realización del proyecto se han empleado ejemplares frescos de cuatro
especies de cefalópodos comprados en un local comercial de Burgos llamado
Alimerka: calamar común (Loligo vulgaris), pota (Illex spp), sepia (Sepia spp) y
pulpo común (Octopus vulgaris). Se ha elegido un individuo de cada especie
conservado en un frigorífico del laboratorio a una temperatura de -20º C hasta
el proceso de extracción del ADN.

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3.2. Extracción de ADN
El ADN genómico de todos los ejemplares descritos previamente había sido
extraído de una muestra de 30-50 mg de tejido conectivo de acuerdo al
protocolo basado en CTAB fenol-cloroformo descrito por Roger y Bendich
(1988), aunque con ligeras modificaciones. Este protocolo consta de las
siguientes etapas:
Homogeneización del tejido y la lisis celular. Consiste en romper las uniones entre
las células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a
liberar el material genético. Para ello se añade 100 µL de proteinasa K (20
mg/mL) y 200 µL de tampón de extracción CTAB 2X (bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB) 2% (p/v), 100 mM
tris(hidroximetil)aminometano (Tris) 20 mM ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA) 1,4% (p/v) NaCl, 1% (p/v) PVP). A continuación se incuban los tubos a
55º C durante 12 horas a 150 rpm (Figura 5).
Figura 5. Esquema del proceso de homogeneización y lisis celular.
Purificación del ADN. En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y los
lípidos teniendo en cuenta la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfatos
presentes en el ADN. Con este objetivo se utiliza un solvente orgánico
compuesto por un volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para
diferenciar la fase acuosa de la orgánica se centrifuga a 14800 rpm durante 5
minutos. Al final del proceso, las proteínas y los lípidos quedan retenidos en la
fase orgánica, mientras que el ADN permanece en la fase acuosa. Se extrae esta
fase y se transfiere a un nuevo tubo donde se repite el proceso con la finalidad
de garantizar la pureza del ADN, algo que se consigue añadiendo de nuevo un
volumen de CTAB 2X. Posteriormente, se deja incubar el tubo en un baño María
durante 10 minutos a 65ºC para que el detergente actúe, se añade también un
volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y se centrifuga a 14800 rpm
durante 5 minutos. Después de ser eliminados los lípidos y las proteínas se
recupera el ADN (Figura 6).

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Figura 6. Esquema del proceso de purificación del ADN.
Precipitación del ADN. Al ADN recuperado se le añade un volumen de tampón
de precipitación CTAB (1% CTAB (p/v), 50 mM Tris, 10 mMEDTA). A
continuación se centrifuga a 14.800 rpm durante 10 minutos, lo que permite que
el ADN permanezca en forma de “pellet” en el fondo del tubo. Se elimina el
sobrenadante y se le adiciona al “pellet” dos volúmenes de etanol al 95%,
además de un tampón TE alto en sal, con altas concentraciones de sodio o
amonio, (10mM Tris, 1 mM EDTA, 1 M NaCl). La incorporación de estos
cationes permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndose insoluble al
reducir las fuerzas repulsivas que hay entre las cadenas debido a los grupos
fosfato. Posteriormente se centrifuga a 14800 rpm durante 15 minutos, proceso
que permite la precipitación del ADN mientras que el etanol es desechado. Los
restos de etanol del “pellet” se eliminan lavándolo con etanol al 70% y el
remanente con su evaporación en una estufa a 35ºC (Figura 7).
Figura 7. Esquema del proceso de precipitación del ADN.
Rehidratación del “pellet”. Para mantener el ADN en solución se añaden 40µL de
TE 0,1X (10 nM Tris-HCl (pH 8,0), 1mM EDTA) lo que previene la degradación
del ADN (Figura 3).

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3.3. Cuantificación y calidad del ADN por espectrofotometría
Utilizando un espectrofotómetro de microplacas se ha medido la absorbancia a
260 nm para determinar la concentración y la pureza del ADN según la relación
de absorción UVA 260/ A280 nm (Figura 8).
Figura 8. Espectrofotómetro de microplacas (Bioteck, Power Wave 52).
3.4. Amplificación y visualización de los productos de la PCR
Las secuencias del gen que codifica para el 16S del ADN mitocondrial estaban
disponibles en la base de datos del National Center for Biotechnology Information
(NCBI) correspondiente a las especies: Loligovulgaris, Illex spp, Sepia spp y
Octopusvulgaris. Estas secuencias han sido alineadas con BLAST y, a partir de
ellas, el Área de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Burgos
ha diseñado una pareja de “primers” denominada C16S. Las secuencias del
“primer” F (forward) y R (reverse) se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. “primers” usados en la amplificación del sistema C16S. W: A, T.
F 5' G G T A T T W T A A C T G T A C T A A G 3’
R 3' G G T A T C C C T A T T G T C G C A T T 5'
Las amplificaciones han sido llevadas a un volumen final de 50 µl que contenía:
el ADN obtenido en el proceso de extracción, la ADN polimerasa llamada Taq-
polimerasa, “buffer” (tampón) que hace que se mantenga el pH apropiado para
que se lleve a cabo la síntesis y cloruro de magnesio (MgCl₂) que actúa como
cofactor de la enzima. Además, se ha añadido los 4 tipos de
desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) que sirven para crear las cadenas
molde del ADN y los “primers”. Al final del proceso lo que se ha obtenido son
cinco tubos diferentes de 50 µl, conteniendo cuatro de ellos el ADN de las
cuatro especies de cefalópodos respectivamente y el quinto, denominado NTC
(No Template Control), al que no se le añade el ADN sino agua para saber si los
cebadores o los otros componentes están contaminados con ADN del exterior.

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Tabla 5. Cantidades óptimas para la realización de la PCR.
Cantidad inicial Cantidad final
Buffer 10 x 1x
MgCl₂ 25 µM 2µM
dNTPs 10 µM 0,8µM
Taq pol 5 U/µl 1 U
C16S F 10000 nM 800 nM
C16S R 10000 nM 800 nM
DNA 10 ng
H₂O Vol final: 50 µl
Con el objetivo de amplificar una región concreta de ADN mediante las
condiciones mencionadas anteriormente, se ha procedido a la realización de
una PCR (Tabla 6).
Tabla 6. Programa de ciclos de la PCR.
Programa
Temperatura (ºC) Tiempo (mins) Repeticiones
95 3:00
95 0:30
49 1:00
72 0:30 35X
72 7:00
Generalmente, la PCR se inicia con la desnaturalización o separación de la
doble hélice del ADN mediante el calentamiento de la muestra a una
temperatura de 95°C para romper los puentes de hidrogeno que las unían. De
esta manera cada cadena queda como molde para la síntesis de una nueva
cadena complementaria de ADN. Una vez separadas las cadenas del ADN, se
alinean los “primers” a sitios específicos complementarios de las cadenas
sencillas de la región que se va a amplificar, bajando la temperatura a 49°C para
permitir la unión (alineamiento) de los “primers”. Finalmente, se consigue
sintetizar una nueva cadena incrementando la temperatura a 72°C porque es la
temperatura óptima a la cual la ADN polimerasa se une a los “primers” y
comienza la replicación. Estas tres etapas (desnaturalización, alineamiento y
extensión del ADN) se repiten sucesivamente en cada nuevo ciclo amplificando
simultáneamente la región de interés de las dos cadenas complementarias. Los
productos generados aumentan su concentración de manera exponencial
porque cada nueva copia sirve de molde en los ciclos subsecuentes, dando
origen a millones de copias del fragmento seleccionado.

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Una vez finalizada la PCR, se procede a visualizar los productos de
amplificación mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1,5%
(p/v) en 1X TAE (trihidroxiaminometano 40µM tris-acetato, 1mMEDTA
etilendietilentetracético) y 0,33X de SYBR®Safe (Invitrogen). Puesto que la
agarosa es insoluble en el tampón TAE a una temperatura ambiente, se calienta
durante 2 minutos en un microondas. Como marcador de pesos moleculares se
utiliza PerfectTM 100-1000bp (0,05 μg/μl), pinchando 6 μl en el gel. En cada
pocillo del gel se cargan 15 μl de los productos de amplificación junto con 3 μl
de tampón de carga 6X (30% (v/v) glicerol, 0,25% (p/v) azul de bromofenol) y
se somete el gel a una corriente eléctrica constante de 120 V. El resultado final se
observa con luz UV en un transiluminador Molecular Imager Gel Doc XR
(software QuantityOne v 4.5.2).
3.5. Digestión de los productos de PCR mediante enzimas de
restricción (ER)
El término RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a
secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas
por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción).
Para desarrollar el siguiente método se han empleado las enzimas de
restricción Dra I y Mbo I (Figura 9).
Dra I Mbo II
5‟ …TTT AAA … 3‟ 5‟ …GAAGANNNNNNNN NNNN…3‟
3‟… AAA TTT …5‟ 3‟ …CTTCTNNNNNNN NNNNN…5‟
Figura 9. La secuencia de la izquierda muestra el punto de corte de la enzima de
restricción Dra I y la secuencia de la derecha el lugar de reconocimiento de la enzima
de restricción Mbo II.
Se han utilizado las muestras obtenidas en la PCR del método anterior. Sobre
los amplicones obtenidos se han preparado dos mezclas de reacción, una por
cada enzima de restricción (ER), con una concentración de reactivos
determinada (Tablas 7 y 8).
Tabla 7. Condiciones de digestión para la enzima Dra I.
Cantidad inicial Cantidad final Rxn 5
Buffer 10X ONE 10x 1x 25 µL
Dra I ER 15 U/µl 2U 0,7 µL
BSA 100x 1x 2,5 µL
H2O 171,8µl 171,8 µL

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Tabla 8. Condiciones de digestión para la enzima Mbo II.
Cantidad inicial Cantidad final Rxn 5
Buffer 10X ONE 10x 1x 25 µL
Mbo II ER 10 U/µl 2U 0,7 µL
BSA 100x 1x 2,5 µL
H2O 171,5 µL
Se han elaborado cinco muestras de las cuales cuatro contienen entre 0,1 y 2 µg
del producto de PCR obtenido en el método anterior. Una quinta muestra se ha
añadido con agua con el fin de servir como muestra de control.
La función del BSA (bovine serum albumine: albúmina de suero bovino) es
estabilizar la enzima de restricción. Para realizar la digestión los tubos han sido
incubados a 37ºC. En la secuencia de los amplicones obtenidos, una enzima de
restricción puede producir un gran número de cortes en los lugares donde
reconozca la secuencia específica para hacerlo. Las secuencias de restricción
presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes
en el ADN de los amplicones de las diferentes especies de cefalópodos, por lo
que se considera que las especies son polimórficas para estos fragmentos de
restricción.
Para la visualización de la RFLP se sigue el siguiente método: los fragmentos de
restricción se separan mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al
2% (p/v) en 1X TAE y 0,33X de SYBR®Safe (Invitrogen) a través del cual corren
debido a un campo eléctrico constante de 120 V. Su disociación obedece a la
masa que depende de la longitud del fragmento. Se utiliza como marcador de
pesos moleculares PerfectTM 100-1000bp (0,05 μg/μl), pinchando 6 μl en el gel.
Este marcador de pesos moleculares genera una banda cada 100 pb, siendo la
banda más marcada la que corresponde a 500 pb. En cada pocillo de gel se
cargan 15 μl de los productos de digestión junto con 3 μl de tampón de carga
6X. El resultado final se observa con luz UV en un transiluminador Molecular
Imager Gel Doc XR (software QuantityOne v 4.5.2).
Este patrón de bandas puede servir por tanto para reconocer la especie, aunque
esta haya sido transformada y las características morfológicas que la distinguían
hayan desaparecido.
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Cuantificación y calidad del ADN extraído
Dado que la espectrofotometría se basa en la relación que existe entre la
absorción de la luz por parte de un compuesto y su concentración, analizando
la siguiente tabla de resultados podemos llegar a las siguientes conclusiones
(Tabla 9).

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Tabla 9. Determinación espectrofotométrica de la cantidad de ADN extraído.
Muestra Absorbancia:
260
Absorbancia:
280
Ratio:
260/280
Concentración:
µg/µL
Calamar 3,684 2,227 1,654 3,684
Pulpo 1,892 0,962 1,967 1,892
Pota 0,784 0,45 1,742 0,784
Sepia 1,068 0,574 1,862 1,068
La evaluación de la concentración y pureza del ADN se ha llevado a cabo
mediante la determinación de la absorbancia a 260 y 280 nm:
 A260: permite estimar la concentración de ADN teniendo en cuenta que
una unidad de densidad óptica a esta longitud de onda equivale a
50 µg/mL de ADN de doble cadena.
 A260/A280 ratio: esta relación de absorbancia permite valorar la pureza
del ADN extraído. Valores entre 1,75–1,85 indican que el ADN
extraído es puro, valores inferiores a 1,75 sugieren contaminación por
proteínas y valores superiores a 1,85, contaminación por ARN u
oligonucleótidos.
Dado que el ADN presenta una absorbancia a 260 nm se puede ver como la
muestra de calamar es la que más cantidad de ADN presenta, seguida del
pulpo, la sepia y, finalmente, la pota. Por otro lado, como las proteínas
presentan una absorbancia a 280 nm, la relación 260/280 muestra el grado de
pureza obtenido en las muestras. En este caso, el mayor grado de pureza se
obtiene en el pulpo, seguido de la sepia, la pota y el calamar.
La concentración de ADN es suficiente para preparar disoluciones de 10 ng/mL
con el objetivo de ser utilizadas posteriormente en la PCR, siempre que se
garanticen 100 ng de ADN en cada una de las mezclas.
4.2. Amplificación y visualización de los productos de la PCR
Las diferentes especies de cefalópodos estudiados presentan similitudes en su
genoma, variando en algunos pares de bases, por lo cual los cebadores
utilizados presentan ciertas modificaciones (R, Y, M, K…). Por tanto, en vez de
presentar una única base nitrogenada, dicha modificación hace posible que se
codifique para dos o más bases nitrogenadas. De esta manera un mismo
cebador puede ser utilizado para diversas especies. La nomenclatura según las
reglas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC). W es: A,
T. El sistema C16S, diseñado en el Área de Bioquímica y Biología Molecular de

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la Universidad de Burgos, amplifica un fragmento que codifica 16S ARN en
cefalópodos. El gen escogido ha sido el que codifica para el sistema 16 S ARNr.
Por su parte, el ARN ribosómico 16S es un componente de la subunidad 30S de
los ribosomas procariontes. Su presencia en los genes mitocondriales de
eucariontes se explica según la teoría endosimbiótica, ya que este orgánulo
habría surgido en su origen de un procarionte.
Debido a la carga negativa proporcionada por los fosfatos, las moléculas de
ácidos nucleicos se mueven cuando están expuestos a una corriente eléctrica
constante de 120 V. La velocidad de migración de los fragmentos de ADN es
proporcional a la carga de las macromoléculas e inversamente proporcional a
su masa y conformación. Como los ácidos nucleicos tienen un esqueleto fosfato
de carga negativa, la razón carga/masa es constante para todos los tamaños, lo
que hace que migren en un campo eléctrico en función de su tamaño (Figura
10).
Figura 10. La fotografía muestra la imagen obtenida en el transiluminador molecular
(Tabla 10). Se observan las bandas numeradas que corresponden con el 1: calamar, 2:
pota, 3: pulpo y 4: sepia. En la columna de la derecha aparecen las bandas
correspondientes a los marcadores de pesos moleculares (PerfectTM 100-1000bp). Este
marcador de pesos moleculares genera una banda cada 100 pb, siendo la banda más
marcada la que corresponde a 500 pb.
Tabla 10. Comparativa entre los tamaños de los amplicones teóricos y
experimentales para las especies analizadas.
Muestra Tamaño teórico (pb) Tamaño observado (pb)
Calamar 360 400
Pota 353 380
Pulpo 352 390
Sepia 328 380

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El tamaño teórico de los amplicones es para el calamar común (Loligo vulgaris)
de 360 pb, la pota (I. illecebrosus) de 353 pb, el pulpo común (Octopus vulgaris)
de 352 pb y la sepia (Sepia officinalis) 328 pb. En la imagen obtenida en el
transiluminador no se puede discriminar por debajo de los 100 pares de bases
que nos indican los marcadores de pesos moleculares pero si se puede apreciar
un orden de tamaño de ADN, siendo el de mayor tamaño el del calamar,
próximo a la banda de 400 pb, seguido del pulpo con 390 pb y la pota, con cerca
de 380 pb al igual que la sepia. Se observa cómo no existe ninguna coincidencia
entre los valores teóricos y los experimentales aunque se mueven en un margen
muy próximo de pares de bases.
Al no haber grandes diferencias entre los amplicones, se hace necesario utilizar
otro método, enzimas de restricción, que permitan una mejor discriminación de
las especies estudiadas.
4.3. Patrones de discusión
Este patrón de bandas puede servir por tanto para reconocer la especie aunque
esta haya sido transformada y las características morfológicas que la distinguían
hayan desaparecido.
En la secuencia de los amplicones obtenidos, una enzima de restricción puede
producir un gran número de cortes en los lugares donde reconozca la secuencia
específica para hacerlo. Las secuencias de restricción presentan usualmente
patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de los
amplicones de las diferentes especies de cefalópodos, por lo que se dice que las
especies son polimórficas para estos fragmentos de restricción (Figura 11).
C16S + Dra I C16S + Mbo II

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Figura 11. Digestión del amplicon obtenido para el gen con la enzima Dra I (fotografía
de la izquierda) y la enzima Mbo II (fotografía de la derecha). Carriles: 1: calamar, 2:
pota, 3: pulpo, 4: sepia y pm: marcador de pesos moleculares.
Tabla 11. Tamaño de los fragmentos generados por las enzimas Dra I y Mbo II.
Observando la tabla 11 vemos que utilizando un solo tipo de endonuclesa, por
ejemplo la Dra I, no es posible identificar las cuatro especies que se habían
propuesto pues el número de bandas y su tamaño coincide para pota y sepia.
Lo mismo ocurre con Mbo II para el calamar y la sepia, pues la discriminación
por debajo de los 100 pares de bases es dudosa y ambas presentan patrones
muy parecidos. En conclusión, es necesario utilizar al menos dos endonucleasas
diferentes para obtener un patrón de bandas fiable que permita distinguir las
cuatro especies estudiadas.
El método utilizado para identificar distintos tipos de cefalópodos tiene tanto
ventajas como inconvenientes.
Una de las principales limitaciones es que hasta el momento no pueden
aplicarse a productos enlatados. Además, el tratamiento por calor que requiere
este tipo de manufacturas produce la degradación de ADN y esto limita su
posible amplificación por PCR. En este sentido, Quinteiro et al. (1998) ya había
señalado que el tamaño máximo de los fragmento de ADN en productos
enlatados estaban alrededor de 170 bp.
5. CONCLUSIONES
A partir del método empleado se ha conseguido obtener una cantidad óptima
de ADN de calidad. Este método permite una rápida identificación del material
fresco aunque hayan desaparecido sus características morfológicas pues en
aproximadamente unas 15 horas de laboratorio nos permite verificar la
autenticidad del material. Para las cuatro especies estudiadas se ha logrado
amplificar el C16S obteniéndose distintas bandas. A diferencia del trabajo de
Sales et al. (2011), el tamaño y distribución de los amplicones no nos ha
permitido diferenciar las cuatro especies estudiadas. Para poder discriminarlas
se han utilizado dos enzimas de las cuales Mbo II ha sido la que mostró un
Tamaño de bandas de ADN (pb)
Muestra Digestión con Dra I. Digestión con MboII.
Calamar 275 450 y 250
Pota 200 250
Pulpo 250 y 100 300
Sepia 200 400 y 250

18
patrón de bandas distintas entre las especies. La gran distancia genética que
existe entre las cuatro familias de las especies estudiadas (Loliginidae,
Ommastrephidae, Sepiidae y Octopodidae) nos impide descubrir un patrón común
que probablemente podía ser descrito si se continúa estudiando especies que
pertenecen a la misma familia como muestran los trabajos de Santaclara et al.
(2007), Chapela et al. (2003) y Colombo et al. (2002). Este método se presenta
como válido y ofrece dos posibles vías por las que se puede continuar
investigando: realizar más estudios ampliando el número de especies de
cefalópodos estudiadas o avanzar en la investigación de nuevas técnicas de
extracción de ADN. Ambas opciones podrían tomar de referencia este estudio
realizado y mejorarlo para aumentar su efectividad.

19
6. BIBLIOGRAFÍA
Chapela, M., & Sotelo, C. P.-M. (2003). Molecular identification of cephalopod
species by FINS and PCR-RFLP of a cytochrome b gene fragment. European
Food Research and Technology, volume 217, pp 524-529. Revisado en
diciembre de 2016.
Colombo, F., Cerioli, M., Colombo, M. M., & Malandra, R. R. (2002). A simple
polymerase chain reaction-restriction fragment lenght polymorphism (PCR-
RFLP) method for the differentiation cephalod mollusc families Loliginidae from
Ommastrephidae, to avoid substitutions in fishery field. Food control, pp 185-
190. Revisado en diciembre de 2016.
Guerra, A. (2006). “Estrategias evolutivas de los cefalópodos” . Investigación y
Ciencia. Pag. 54. Revisado en octubre de 2016.
Roger, S., & Bendich, A. J. (1988). “Extraction of DNA from plant tissues”. Plant.
Mol. Biol. (A6), 1-10. Revisado en octubre de 2016.
Sales, J. B., Rodrigues-Filho, L., & Haimovici, M. S. (2011). “Molecular
differentiation of the species of two squid families (Lologinidae and
Ommastrephidae) based on a PCR study of the 5S rDNA gene”. Food
control 22, pp. 96-98. Revisado en octubre de 2016.
Santaclara, F., & Espiñeira, M. & Vieites, J.M. (2007). “Genetic Identification of
Squids (Families Ommastrephidae and Loliginidae) by PCR-RFLP and
FINS Methodologies” . Journal of Agricultural and Food Chemestry. 55,
pp 9913-9920. Revisado en septiembre de 2016.
7. BIBLIOGRAFÍA ONLINE
Dietas.Net, tu portal de salud y bienestar. (2014). www.dietas.net/tablas-y-
calculadoras/. Revisado en diciembre de 2016.
Lonja del puerto de Vigo. Autoridad portuaria de Vigo . www.apvigo.com/ .
Revisado el 18 de noviembre de 2016.
Ministerio de Agricultura y Pesca, Alimentacion y Medio Ambiente (2014).
www.mapama.gob.es/ “Mercado de cefalópodos”, pag.7. Revisado en
diciembre de 2016.
INIDEP (Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero)
http://www.inidep.edu.ar/ “Calamar (Illex argentinus) “.Revisado en
diciembre de 2016.

20
Josep M. Berengueras (2011). www.elperiodico.com/ “Pulpos que no son
pulpos”. Revisado en diciembre de 2016.
Dr. Antonio López Farré (2014). http://www.teinteresa.es/ “Los cefalópodos y
sus beneficios en la salud”. Revisado en diciembre de 2016.

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8. AGRADECIMIENTOS
Queremos dar las gracias al IES Félix Rodríguez de la Fuente por la oportunidad
que nos ha brindado de iniciarnos en el campo de la investigación. También a la
Universidad de Burgos por poner a nuestra disposición las instalaciones del
Área de Bioquímica y Biología Molecular. Además, de forma personal, damos
las gracias por su tiempo y dedicación a nuestras tutoras, Sonia Ramos y
Natividad Ortega, quienes durante estos cinco meses siempre han estado a
nuestra disposición a pesar de las dificultades que conlleva el año académico en
la universidad.
Agradecemos igualmente a los profesores del instituto que se han ofrecido a
colaborar con nosotros. Es especial, a nuestro tutor, Luis Vidal, del
Departamento de Biología y Geología, que nos ha guiado y ayudado
incondicionalmente con su paciencia, constancia e imaginación. También a
María de la Zarza, del Departamento de Lengua Castellana y Literatura, por
encargarse de la corrección ortotipográfica de esta memoria. A Jesús Pavón, del
Departamento de Ingles, por la ayuda en la elaboración del abstract.
Toda esta coordinación con el profesorado no hubiera sipo posible sin Juan
Manuel Rojo, del Departamento de Tecnología, que ha ejercido como
coordinador.
A todos ellos, gracias.

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