Este documento describe varias técnicas de estudio de la materia viva como la microscopía electrónica de transmisión y de barrido, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis, centrifugación y separación por sedimentación en gradiente de sacarosa. Explica las partes de un microscopio electrónico, cómo funciona cada tipo de microscopio, y detalla los principios y aplicaciones de la centrifugación, centrifugación diferencial y separación en gradiente.

1. Técnicas de estudio
de la materia viva
Javier Medina

2. Técnicas de estudio
de la materia viva
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6. MET: Partes
 Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan contra el
espécimen, creando una imagen aumentada.
 Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz
de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los
microscopios ópticos no funcionan con los electrones.
 Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio
electrónico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las
moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de
un microscopio de estas características.
 Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del
objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada.
 Sistema de registro que muestra la imagen que producen los
electrones, que suele ser una computadora.
La MET no explora superficies: el haz de electrones incidente
atraviesa la muestra y genera una sombra de la ultraestructura que es
capturada en una pantalla fosforescente , ubicada en la parte inferior
de la columna.

8. Microscopio electrónico de barrido
 En el microscopio electrónico de barrido la
muestra es recubierta con una capa de metal
delgado, y es barrida con electrones
enviados desde un cañón. Un detector mide
la cantidad de electrones enviados que
arroja la intensidad de la zona de muestra,
siendo capaz de mostrar figuras en tres
dimensiones, proyectados en una imagen de
TV.

9. Comparación microscopios
electrónicos
:

15. Cromatografía de intercambio iónico

16. Electroforesis

18. Centrifugación
 Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las
muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en
poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor
que la del medio que las rodea.
 Tipo:
– centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g)
– super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000
g a 20000 g)
– ultracentrífugas (de 15000 g a 600000 g).
 En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la
cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido
a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más
de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso
vacío en la cámara de la centrífuga para evitar el
calentamiento de rotor y muestra.

19. Centrifugación: coeficientes de
sedimentación
 El coeficiente de sedimentación de una partícula o
macromolécula se calcula dividiendo su velocidad constante de
sedimentación (en m/s) por la aceleración aplicada (en m/s2
).
 El resultado tiene dimensiones de tiempo y se expresa
habitualmente en svedbergs (S).
 Los valores de coeficientes de sedimentación no son aditivos,
debido a que dependen tanto de la masa, como de la forma
que tenga la molécula. Una partícula formada por la unión de
dos partículas 5 S no tiene un coeficiente de sedimentación de
10 S. Por ejemplo, los ribosomas eucarióticos están formados
por dos subunidades, una 60 S y otra 40 S. Sin embargo, el
valor final del conjunto del ribosoma no es 100 S, sino 80.

20. Centrifugación diferencial

21. Separación por sedimentación en
gradiente de sacarosa