1. SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANO
POR EL MÉTODO DE GELACIÓN IONOTRÓPICA
COMO POTENCIAL SISTEMA DE LIBERACIÓN
CONTROLADA DE ANTIBIÓTICOS.
Rosvin E. Des Bouillons Gamboa
1
Tutores: Gabriela Montes de Oca, MSc
Ricardo Starbird-Pérez, Dr. rer. nat
Lectores: José Roberto Vega-Baudrit, PhD
Bernal Sibaja Hernández, PhD
201269016

2. Contenido
 Introducción
 Objetivos
 Metodología
 Resultados & Discusión
 Conclusiones
 Recomendaciones

3. Fuente: The Royal Society & The Royal Academy of Engineering (20004)
Diseño, fabricación y uso de sistemas
nanoestructurados
Nanopartículas (NP)
Nanotecnología
2015 $1 Trillón Prod Global

4. Watkins et al. (2015) . Int. J. Nanomedicine. 2015:10 6055–6074 doi: 10.2147/IJN.S92162
Nanopartículas
(10-1000nm)
Chitosano (CS)
Liberación controlada de fármacos

5. Younes & Rinaudo (2015) Mar Drugs. 13(3) 1133-1174 doi: 10.3390/md13031133 Taylor et al. (2015) Nature Scientific Reports. 5:10608. DOI: 10.1038/srep10608.
Brizzi, 2016 Scienza&Tecnica-ANSA
Chitosano (CS)
Desacetilación
Grado de desacetilación
(%DDA)
Quitosano
Quitina

6. Propiedades del CS
%DDA Masa Molecular
Biodegradabilidad Mucoadhesividad
Biocompatibilidad
Baja Toxicidad
Antimicrobiano
Liberación controlada
&
Quitanasas, quitosanasas, lisozimas
6 g/kg ∼ azúcar
Cargas positivas Interacciones electrostáticas
No rx alérgicas/rechazo
Glicoproteínas

7. Nanopartículas de CS(CSNPs)
Carga positiva
Internalizadas
por tejidos y
células.
Área Superficial
50-100nm
Circulación Prolongada
Xiong et al. (2014).Advanced Drug Delivery Reviews doi:10.1016/j.addr.2014.02.002
Biodistribución
Especificidad
Ad y absorber

8. 8
Diagnosis y Terapia del Cáncer
saquinavir – VIH- Jurkat Linfocitos T
Ramana et al. (2014) Biochimica et Biophysica Acta 1840 (2014) 476–484Lee et al. (2014) Nanomedicine (2014) 9(11), 1697–1713 de Campos et al. (2004) Pharmaceutical Research, 21(5)
Terapia VIH Tratamiento oftalmológico
Otras aplicaciones de las CSNPs
Conjuntiva – CSFL NP – CSFL - FMarcadores fluorescentes – NIRF

9. Métodos de Síntesis de CSNPs
Entrecruzamiento por emulsión
Micelas reversasSpray-drying
Método de tamizadoCoacervación/precipitación
Gelación Ionotrópica
Solventes orgánicos
Viabilidad celular
Procesos complicados
Desestabilización del agente activo
NP de gran tamaño
Equipo

10. Método de Gelación Ionotrópica
CS policatión Tripolifosfato de Sodio (TPP)
Younes & Rinaudo (2015) Mar Drugs. 13(3) 1133-1174 doi: 10.3390/md13031133
Entrecruzamiento
iónico reversible
Fuerzas electrostáticas

11. Método simple
No solventes orgánicos
T. ambiente
No entrecruzamiento químico
Entrecruzamiento físico reversible
Agente activo protegido
Disolución acuosa
Koukaras et al. (2012). Mol. Pharm. 9(10), 2856–2862. doi: 10.1021/mp300162j
Ventajas
Método de Gelación Ionotrópica
Relaciones CSTPP

12. Sintetizar nanopartículas de quitosano utilizando el método de gelación ionotrópica por
entrecruzamiento con Tripolifosfato (TPP).
Caracterizar las nanopartículas por Dispersión Dinámica de Luz (DLS), Espectroscopía
Infraroja con Transformada de Fourier (FTIR), Microscopio Electrónico de Transmisión
(TEM) y Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).
Evaluar la actividad antibacteriana in vitro, utilizando el método de la determinación de la
concentración mínima inhibitoria en Escherichia coli (gram negativa) y Staphylococcus
aureus (gram positiva).
12
Objetivo General
Sintetizar nanopartículas de quitosano por medio del método de gelación ionotrópica
como sistema de liberación controlada de antibióticos
Objetivos Específicos

13. Metodología

14. Síntesis de CSNPs Caracterización MIC
[Se define relac. CSTPP por DLS]
FTIR
TEM
AFM
S. aureus
E. coli

15. Síntesis de CSNPs por gelación ionotrópica
-10°C

16. Caracterización
Dispersión Dinámica de Luz (DLS)
Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
ZetaPotencial DHP
3mL 1,5mL
5μL1:50 Rejilla Desecador
5μL1:50 Mica T. amb
150 kHz
mica hidrofílica
modo intermitente
al aire
Rayado MH 1x 24h antes
Inóculo 2h antes Centrifugación
Pellet Dsln Salina
D.O. ideal
Ensayo resazurina
inhibición del crec.
viabilidad celular

17. Resultados & Discusión

18. Síntesis de CSNPs
100-300kDa %DDA 75-85%
CS
Prueba preliminar
Dsln. Opalescente
Dsln. turbia
Formación de NPs
Precipitación
Inestabilidad, floculación

19. Espectroscopía Infraroja con Transformada
de Fourier (FTIR)

20. Interacción entre los iones fosfato (del
TPP) y amonio (del CS).
FTIR

21. Dispersión Dinámica de Luz (DLS)

22. Stokes-Einstein
Mov. Browniano
Análisis de Fluct.
De Intensidad
D=
𝑘𝑇
6𝜋𝜂𝑅

23. Cuadro 1. Distribuciones de Diámetro Hidrodinámico Promedio (DHP)
y Zeta potencial (ZetaPot) determinados por DLS. (n=3)
Entrecruzamiento NH3 Libres
100-300kDa %DDA 75-85%
CS

24. Cuadro 1. Distribuciones de Diámetro Hidrodinámico Promedio (DHP)
y Zeta potencial (ZetaPot) determinados por DLS. (n=3)
Entrecruzamiento NH3 Libres
100-300kDa %DDA 75-85%
CS

25. Distribución de DH de CSNPs
81,90%
18,30%
87,50%
10,40%
84,10%
11,8%
83,10%
16,90%
Dos Familias PdI
100-300kDa %DDA 75-85%
CS

26. Microscopio Electrónico de Transmisión
(TEM)

27. Vacío
Hidratación Mínima
Morfología No-esféricas
Dos poblaciones
Promedio=(65±13,77)nm
Desecación

28. Vacío
Hidratación Mínima
Morfología No-esféricas
Dos poblaciones
(65±13,77)nm (194,57±9,23)nmVs.

29. Microscopio de Fuerza Atómica (AFM)

30. CSNPs no liof.
(102,34±17,91)nm diámetro
(10,27±2,82)nm altura

31. CSNPs liof.
(557,69±178,58)nm
(12,71±4,78)nm
Agregación
Centrifugación
Liofilización

32. Determinación de la Concentración Mínima
Inhibitoria (MIC)

33. inhibición del crec. viabilidad celular
Ensayo de la Resazurina

34. Columna 7
S. aureus
E. coli
Inhibición
Columna 6Inhibición
inhibición del crec. viabilidad celular
CSNPs en dsln. síntesis
A)
B)

35. Modelos de interacción CSNPs - Células
+ -
Fuerzas Electrostáticas
CS compite con iones Ca2+
En Membrana celular
Cambios en permeabilidad
Desbalances osmóticos
Viabilidad
salida de electrolitos intracelulares
Iones potasio, proteínas, ácidos
nucleicos, glucosa y lactato
deshidrogenasa
http://bvs.sld.cu/

36. Xu et al., 2015 Polymers 2015, 7(9), 1850-1870; doi:10.3390/polym7091488

37. 37
Catherine Stanley
Jeon et al., 2014 PLoS ONE 9(3): e92723. doi:10.1371/journal.pone.0092723.g003
Cadena O del LPS
Más negativa

38. E. coli
inhibición del crec. viabilidad celular
NO HAY EFECTO
1,38-0,25µg/mL
Crecimiento Celular
S. aureus
A)
B)
Crecimiento Celular
CSNPs proceso de liof.

39. E. coli
inhibición del crec. viabilidad celular
NO HAY EFECTO
22-4µg/mL
Crecimiento Celular
S. aureus
A)
B)
Crecimiento Celular
CSNPs proceso de liof.
[∼12 veces]

40. Posibles Razones
Concentración
Kauper & Forrest (2006)
[CSNPs]
Filtrar 0,45μm y 0,22μm
35%
Valor de MIC >22μg/mL

41. Posibles Razones
Liofilización
Centrifugación
Agregación del sistema
Congelamiento
Desestabilización
Área superficial
Interacción con las bact.
Con CSTPP NPs Var. 142,8%
Cristales

42. inhibición del crec. viabilidad celular
Valor de MIC
100-22µg/mL
Total Inhibición
550-100µg/mL
S. aureus
A)
B)
E. coli
Crecimiento Celular
22-4µg/mL
Quitosano

43. inhibición del crec. viabilidad celular
Valor de MIC
100-22µg/mL
Total Inhibición
550-100µg/mL
S. aureus
A)
B)
E. coli
Crecimiento Celular
22-4µg/mL
Quitosano

44. Se logró definir la relación CSTPP 4:1 como la mejor relación valores de tamaño y ZetaPot
adecuados.
Se logró caracterizar por los diferentes métodos físico químicos las CSNPs.
Se logró dar un acercamiento sobre la capacidad de inhibición de las CSNPs en solución de síntesis,
pero no se logró obtener el mismo resultado luego de que las CSNPs fueron expuestas al proceso de
liofilización.
Para las CSNPS 4:1 en solución de síntesis se vio una muy pequeña diferencia de inhibición entre S.
aureus y E. coli, en donde S. aureus aparenta ser un poco más sensible.
Se logró acercar el rango para la determinación de la concentración mínima inhibitoria para el CS
entre 100µg/mL y 22µg/mL.
44
Conclusiones

45. Como un extra se se realizó la curva de calibración (R2=0,9965) para la ampicilina y se realizaron
pruebas para la Eficiencia de Carga (EE) de las NPs con ampicilina, sin embargo se obtuvieron
valores de (16,83± 2,36) por lo que se recomienda realizar más pruebas.
Evaluar la efectividad de diferentes crioconservantes como manitol, sacarosa y trehalosa para la
preservación de la estabilidad de las CSNPs ante los procesos de centrifugación, congelamiento y
liofilización.
Realizar ensayos comparativos entre las CSNPs, antibiótico y las CSNPs cargadas con antibiótico.
Realizar análisis por AFM, TEM y SEM de las bacterias tratadas con NPs para elucidar el
mecanismo de acción de las NPs.
45
Recomendaciones

46. Dr. José Vega-Baudrit, Lanotec,
PoliUNA, CeniBiot, CeNAT, CIB,
Gaby Oca, Bernal, Michael, Rey,
Gaby Ávila, Laura, Daniels,
MaJosé, Cano, Cristofer, Cristina,,
Steph, Gia, Karen, Sebas, Mixie,
Mattey, HDi, Antonio M.U., Hazel,
D. Duesing,
46
Agradecimientos

47. DIAPOSITIVAS DE APOYO

48. EE Ampicilina 197nm Curva calibración R2=0,9965 EE=(16,83±2,36)%

49. 49
Movimiento Browniano
Colisiones
aleatorias con
moléculas del
Solvente
Para NPs de mayor tamaño
El coef de Difusión es
pequeño,
Se mueven más lento.

55. 55

56. 56