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Tema:
AMPLIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLÉICOS POR
PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
Departamento Académico de Ciencias
Grupo de Microbiología Molecular y Biotecnología
Quién Invento la PCR ?
Blgo. Dr. José González Cabeza
Kary Mullis, geneticista, Nobel
Prize em Química (1993) pelo
desenvolvimento de um
método que permite
sintetizar, em poucas horas e
in vitro, uma grande
quantidade de um
determinado fragmento de
DNA
Seus estudos em 1985
permitiram amplificar o DNA.
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification
of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230: 1350-54
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed
chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35
PCR = Reacción en Cadena de la Polimerasa
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ Kary Mullis → 1983.
➢ Amplificación selectiva de secuencias de DNA realizada en un
sistema in vitro, libre de cèlulas.
➢ Permite la obtención de un elevado número de copias de una
secuencia de DNA a partir de pequeñas muestras y un posible mal
estado de conservación.
➢ Es una técnica de análisis rápida, sencilla y eficaz.
APLICACIÓN Y VERSATILIDAD DE LA PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
Número de articulos publicados anualmente
en los que se utiliza la tècnica de PCR
• La PCR ha
revolucionado la
biologia molecular y se
ha convertido en una
herramienta de
trabajo
imprescindible, no
solo en el análisis
genético sino también
para el análisis
microbiòlogico,
patòlógico,
bioquímico, etc.
FECHAS IMPORTANTES DE SU HISTORIA
Blgo. Dr. José González Cabeza
1985: PRIMER ARTÍCULO SOBRE PCR.
1987: PRIMER TERMOCICLADOR COMERCIAL (Perkin-Elmer Cetus).
1989: DNA Pol y PCR → MOLÉCULA DEL AÑO (SCIENCE).
1993: KARY MULLIS → PREMIO NOBEL DE QUÍMICA.
1994: PRIMER TERMOCICLADOR PARA PCR in situ.
1995: PCR A TIEMPO REAL.
REPLICACIÓN DEL DNA
Blgo. Dr. José González Cabeza
Cadena líder
(Leading Strand)
Primer (riboNTPs)
Fragmento de Okasaki
Cadena rezagada
(Lagging Strand)
Basta un primer
EVENTOS DE LA REPLICACIÓN
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ Apertura de las cadenas (orígen de replicación).
➢ Colocación de los iniciadores (primers de RNA) (La cadena líder
utilizará un solo iniciador mientras que las cadenas rezagadas
utilizarán varios iniciadores de RNA).
➢ Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores).
➢ Eliminación de los iniciadores de RNA.
➢ Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa).
DESARROLLOS CLAVE EN LA PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ DNA Polimerasas Termoestables.
➢ Oligonucleótidos Sintéticos.
➢ Termocicladores.
AMPLIFICACIÓN in vivo
Blgo. Dr. José González Cabeza
EL CICLO DE LA PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
Etapa 1 → DESNATURALIZACIÓN.
Etapa 2 → HIBRIDACIÓN.
Etapa 3 → ELONGACIÓN.
ETAPAS DE UNA REACCIÓN DE PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
1. Desnaturalitzación
2. Hibridación
3. Elongación
94-95ºC, 1 min.
72ºC, 1 min.
45-65ºC, 1 min.
PCR: PROGRAMACIÓN DE CICLOS
Blgo. Dr. José González Cabeza
RT
92ºC
55ºC
72ºC
92ºC 92ºC
55ºC 55ºC
72ºC 72ºC
Desnaturalización:
Lo mas corto
posible. Evita
inactivación de la
enzima.
Anillamiento:
Lo mas cerca
posible de las Tm
de los primers
Extensión:
Lo mas extenso
posible para asegurar
fragmentos completos
DESARROLLO DE UNA PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
DESNATURALITZACIÓ
94-96ºC 4-5 minuts
CICLES (20-40)
desnaturalització: 94-96ºC 1 minut
hibridació: 50-65ºC 1 minut
extensió: 72ºC 1 minut
EXTENSIÓ
72ºC 5-10 minuts
CONSERVACIÓ
4ºC a temps indefinit
Thermus acquaticus
Blgo. Dr. José González Cabeza
Thermus
acquaticus
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297 Vol.
98, No. I
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating
Extreme Thermophile
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE
Department of Microbiology, Indiana University,
Bloomington, Indiana 47401
The isolation of a new thermophilic bacterium, Thermus
aquaticus gen. n. And sp. n., is described. Successful
enrichment requires incubation at 70 to 75 C, and the use
of nutrient media relatively dilute with respect to the
organic components.
Strains of T. aquaticus have been isolated from a variety of
thermal springs in Yellowstone National Park and from a
thermal spring in California. The organism has also been
isolated from man-made thermal habitats, such as hot tap
water, in geographical locations quite distant from thermal
springs. Isolates of T. Aquaticus are gram-negative
nonsporulating nonmotile rods which frequently form long
filaments at supraoptimal temperatures or in the
stationary phase. The optimum temperature for growth is
70 C, the maximum 79 C, and the minimum about 40 C.
The generation time at the optimum is about 50 min.
Double
strand cDNA
AAAAA
TTTTT
RT
AAAAA
TTTTT
RT
RT
AAAAA
TTTTT
Oligo dT primer is
bound to mRNA
Reverse
transcriptase (RT)
copies first cDNA
strand
Reverse
transcriptase
digests and
displaces mRNA
and copies second
strand of cDNA
Conversion of mRNA to cDNA by Reverse Transcription
A. Double
strand DNA
B. Denature
96º
50º
C. Anneal
primers
50º
D. Polymerase
binds
72º
Taq
Taq
72º
Taq
Taq
E. Copy
strands
1
2
3
4
F.
Denature
96º
First round
of cDNA
synthesis (4
strands)
Taq
Taq
1
2
3
4
50º
G. Anneal
primers
1
2
3
4
Taq
Taq
Taq
Taq
72º
H.
Polymerase
binds
1
2
3
4
Taq
Taq
Taq
Taq
I. Copy
strands
72º
Second
round of
cDNA
synthesis (8
strands)
1
2
3
4
J.
Denature at 96º
Anneal primers at
50º
1
2
3
4
72º
K. Bind polymerase
(not shown) and copy
strands
Third
round of
cDNA
synthesis
(16
strands)
1
2
3
4
L.
Denature at 96º
Anneal primers at
50º
1
2
3
4
M.
Copy strands at
72º
Fourth
round of
cDNA
synthesis
(32
strands)
72º
1
2
3
4
cDNA
strands (32)
are now
shown as
lines
1
2
3
4
After 5 rounds
there are 32
double strands of
which 24 (75%) are
are same size
PCR DEMO
Blgo. Dr. José González Cabeza
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs
NÚMERO DE CICLOS
Blgo. Dr. José González Cabeza
CYCLE NUMBER DNA copy number
0 1
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1,024
11 2,048
12 4,096
13 8,192
14 16,384
15 32,768
16 65,536
17 131,072
18 262,144
19 524,288
20 1,048,576
21 2,097,152
22 4,194,304
23 8,388,608
24 16,777,216
25 33,554,432
26 67,108,864
27 134,217,728
28 268,435,456
29 536,870,912
30 1,073,741,824
31 1,400,000,000
32 1,500,000,000
33 1,550,000,000
34 1,580,000,000
0.0E+00
2.0E+08
4.0E+08
6.0E+08
8.0E+08
1.0E+09
1.2E+09
1.4E+09
1.6E+09
1.8E+09
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DNA
copy
number
Copies of DNA = 2N
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs
NÚMERO DE CICLOS
Blgo. Dr. José González Cabeza
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DNA
copy
number
(log)
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs
NÚMERO DE CICLOS
Blgo. Dr. José González Cabeza
Q = m (1 + E)n
MOLÉCULES DE DNA EN UNA PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
Nº
de
còpies
Nº de cicles
DNA motlle
En el tercer ciclo recién se obtienen dos copias exactas del segmento de
DNA especifico.
Blgo. Dr. José González Cabeza
VENTAJAS DE LA PCR SOBRE OTRAS TECNICAS
Blgo. Dr. José González Cabeza
✓ ALTA SENSIBILIDAD
✓ ALTA ESPECIFICIDAD
✓ RAPIDEZ
CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o
productos amplificados previamente).
DESVENTAJA
COMPONENTES DE LA PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
• a. Termociclador
• b. Microtubos para PCR
• c. Buffer de Amplificación
• d. ADN molde
• e. dNTPs
• f. Primers (Cebadores)
• g. La Taq polimerasa
Termocicladores
Blgo. Dr. José González Cabeza
Termociclador: Realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas
programadas de forma exacta.
Tipos de termocicladores: El de color negro es una tétrada, y en él se
pueden procesar simultáneamente 4 conjuntos de 96 muestras. Los
cuatro más pequeños, de color blanco tienen, cada uno, una capacidad
de 96 pocillos.
Blgo. Dr. José González Cabeza
Termocicladores
1. DNA MOLDE
Blgo. Dr. José González Cabeza
• La cantidad habitual usada en una PCR convencional,
depende de la complejidad del DNA molde.
– Humanos: 10 ng – 1 µg
– Levaduras: 10 ng
– Bacterias: 1 ng
– Fago Lambda: 20 pg
– Plásmidico: 1 – 2 pg
2. DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES
Blgo. Dr. José González Cabeza
• 1983 Klenow
(poco eficaz e
inespecífica; 37ºC).
• 1988 Taq
polimerasa I
(Thermus aquaticus).
Enzim Vida mitj.
95ºC
Procesiv. Taxa
d’extensió
Activitat
exonucl.
Activitat
correctora
Taq 40 min 50-60 nt 75 nt/s Si No
Stoffel 80 min 5-10 nt >50 nt/s No No
Tth 20 min 30-40 nt >33 nt/s Si No
Pfu >2 h 60 nt/s No Si
Pwo >2 h No Si
2. DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES
Blgo. Dr. José González Cabeza
2. DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES
Blgo. Dr. José González Cabeza
DNA POLIMERASA FUENTE
Taq
Amplitaq
Hot Tub
Pyrostase
Vent
Deep Vent
Tth
Pfu
ULTma
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus.
Thermus flavis.
Thermus flavis.
Thermococcus litoralis.
Pyrococcus GB-D.
Thermus thermophilus.
Pyrococcus furiosus
Thermotoga maritima
Taq DNA POLIMERASA
Blgo. Dr. José González Cabeza
Mt 94 KdA
Temp. óptima. 72 – 80 C
pH óptimo. 7,0 – 7,5
[Mg2+] óptima. 1,5 – 4 mM
Vélocidad de Síntesis. 2 – 4 Kb / min.
Procesividad. 30 – 60 bases
Producto de PCR más largo. 5 kb
ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS
DE LA DNA POLIMERASAS
Blgo. Dr. José González Cabeza
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
Pol 5’ → 3’
Exo 3’ → 5’
(Correctora)
Exo 5’ → 3’
TIPO DE DNA POLIMERASAS A EMPLEAR
Blgo. Dr. José González Cabeza
APLICACION LONGITUD TEMPLADO
HASTA
ENZIMA
RUTINA 5kb Taq Pol
ALTA ESPECIFICIDAD
Tº AMBIENTE
5kb Platinum Taq Pol
ALTA ESPECIFICIDAD
ALTA FIDELIDAD
12kb Platinum Pfu Pol
SIN AGREGADO DE A (PARA
GENOTIPIFICACION)
500pb Platinum Genotype Pol
ALTO CONTENIDO DE GC
CODONES REPETIDOS
Dependiendo de la
polimerasa
Taq, Platinum Taq
DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu
Blgo. Dr. José González Cabeza
Actividad 3´ → 5´ Exonucleasa. Polimerasas con actividad 3´ → 5´
tienen menor error = Proofreading
➢ Taq Polimerasa con
actividad 3´ → 5´
exonucleasa.
➢ Mayor cantidad de
errores = 1,1 X 10-4
sustituciones / base.
➢ Pfu presenta actividad 3´
→ 5´ exonucleasa.
➢ Menor cantidad de
errores = 1,6 X 10-6
errores / base.
DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu
Blgo. Dr. José González Cabeza
DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu
Blgo. Dr. José González Cabeza
DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu
Blgo. Dr. José González Cabeza
3. CEBADORES O “Primers”
Blgo. Dr. José González Cabeza
3’ 5’
3’
5’
3’
5’
3’ 5’
n n’
m
• Los cebadores permiten definir los límites (extremos 5’ de cada un
de ellos) de la secuencia específica del DNA molde a amplificar.
Diseño de Cebadores
Blgo. Dr. José González Cabeza
• Longitud
• Entre 15 - 25 nt.
• Composición de Bases
• Una proporción similar de cada uno de los nucleótidos.
• Un contenido de G y C similar en la pareja de cebadores.
• Evitar repeticiones.
• Evitar posibles formaciones de estructures secundarias.
• Extremo 3’
• Evitar complementariedad que afecten a el extremo 3’ del mismo cebador
o entre cebadores.
• Extremos 3’ ricos con G y C pueden dar lugar a inespecificidades.
• Temperatura de fusión
• Ha de ser similar la Tm en la pareja de cebadores.
Diseño de Cebadores
Blgo. Dr. José González Cabeza
TEMPERATURA DE FUSIÓN
(Tm = Melting Temperature)
Blgo. Dr. José González Cabeza
La desnaturalización (separación
de las dos cadenas) es dóna per
blocs depenent del contingut
amb GC de cada bloc
TEMPERATURA DE FUSIÓN
Y CONTENIDO EN GC
Blgo. Dr. José González Cabeza
Diseño de Cebadores
Blgo. Dr. José González Cabeza
Diseño de Cebadores
Blgo. Dr. José González Cabeza
Dímeros de Cebadores (“Primer Dimers”)
Blgo. Dr. José González Cabeza
Diseño de Cebadores
Blgo. Dr. José González Cabeza
CÁLCULO DE LAS Tm DE LOS CEBADORES
Blgo. Dr. José González Cabeza
• Tm = [(nº G+C)x4+(nº A+T)x2]
• Tm = 81,5+16,6 (log10(I))+0,41(%GC)-(600/N)
– I és la concentració de cations monovalents i N la llargada en nucleòtids de
la molècula
• Tp = 22+1,46 [(nº G+C)x2+(nº A+T)]
FACTORES QUE AFECTAN A LA TM
Blgo. Dr. José González Cabeza
FACTORES QUE DETERMINAN LA ESTABILIDAD Y ESPECIFICIDAD
DE LAS HIBRIDACIONES
Blgo. Dr. José González Cabeza
• Características de les moléculas
– Complementariedad (secuencia) [estabilidad y especificidad].
– Longitud de la molécula (número de pares de bases) [estabilidad
y especificidad].
– Porcentaje de GC [estabilidad].
• Características del ambiente
– Temperatura [estabilidad].
– pH [estabilidad].
– Concentración salina (cationes monovalentes como el Na+)
[estabilidad].
– Agentes desnaturalitzantes (formamida, formaldehido, úrea,
otros) [estabilidad].
4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
Blgo. Dr. José González Cabeza
• El buffer de la reacción de PCR suele contener Tris-HCl y KCl.
• El pH es de 8,3 a 25ºC, pero disminuye a la temperatura de
polimerización hasta 7,2 - 6,8.
• El Mg+2 es necesario para la actividad de la Taq polimerasa (precisa
una concentración de Mg+2 libre de al menos 1,2 - 1,3 mM).
• Un defecto de Mg+2 disminuye la eficacia de la amplificación,
mientras que un exceso puede producir inespecificidad.
• Los dNTPs compiten por el Mg+2 en cantidades equimolares.
• Debe de haber la misma conentración de cada uno de los cuatro
dNTPs.
Blgo. Dr. José González Cabeza
4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
Blgo. Dr. José González Cabeza
4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
Blgo. Dr. José González Cabeza
4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
Blgo. Dr. José González Cabeza
4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
Blgo. Dr. José González Cabeza
4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
Blgo. Dr. José González Cabeza
PCR
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
0
2
5
4
0
5
0
6
0
Nº ciclos
Nº
pb
4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
CORRIDO ELECTROFORÉTICO
Blgo. Dr. José González Cabeza
Visualización se puede realizar con
bromuro de etidio
+
Lámpara de luz UV).
+
Cámara Fotográfica
DNA and dye are loaded in a well on a gel, and an
electric field is placed across the gel
Blgo. Dr. José González Cabeza
(b) DNA fragments move through the gel, shorter
fragments faster than longer fragments.
Electrode
Gel
Well
DNA samples from PCR of
Snowball’s DNA
Direction of
electric field
Blgo. Dr. José González Cabeza
mixtures of DNA
fragments of different sizes
cathode
anode
-
+
glass
plates
gel
short
fragments
long
fragments
completed gel
power
source
CORRIDO ELECTROFORÉTICO
Blgo. Dr. José González Cabeza
CORRIDO ELECTROFORÉTICO
ANÁLISIS DE LA MUESTRA
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio
(lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad.
Ladder: pesos conocidos
1. Fragmento a 1857 pb
2 y 4. Fragmento a 800 pb
3. No hay producto
5. Multiples bandas
(primers inespecíficos se
pegan a varios sitios)
Blgo. Dr. José González Cabeza
…muchas gracias.
Blgo. Dr. José González Cabeza
gonzalezbiotec@hotmail.com
www.gonzalezcabeza.com
Blgo. Dr. José González Cabeza
Tema:
APLICACIONES DE LA PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
Departamento Académico de Ciencias
Grupo de Microbiología Molecular y Biotecnología
DETECCIÓN DE SECUENCIAS
Blgo. Dr. José González Cabeza
• Detección de Mutaciones:
Puntuales / Delecciones / Inserciones.
• Diagnóstico de Enfermedades Genéticas
→ Cuando se conoce el gen responsable de la patología.
• Diagnóstico de Microorganismos Patógenos
→Detección de secuencias específicas.
• Detección de Infecciones
→ VIH: Secuencias específicas del profago en células
sanguineas.
AMPLIFICACIONES DE GRANDES
CANTIDADES DE DNA
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ DNA molde
→ Procede de una muestra escasa, difícil de lograr o
incluso irrepetible.
→ Por tanto, fuente inagotable para el futuro.
PRODUCCIÓN DE SONDAS
➢ Sondas → Experiencias de Hibridación.
➢El sustrato puede ser una mezcla de DNAs o un fragmento de DNA
clonado.
PRODUCCIÓN DE ssDNA POR
PCR ASIMÉTRICA
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ Regularmente para Secuenciación
→ Mét. de dideoxinucleótidos terminadores de cadena → ssDNA.
➢ PCR Asimétrica
→ Inicialmente se producen sdDNA, pero luego cebador limitante
se agota pero el segundo continua sintetizando, dando lugar a
ssDNA.
PCR Asimétrica
Blgo. Dr. José González Cabeza
Ciclos
Iniciales
Cebadores
→ /  = 1 / 100
→

Ciclos Finales
Cebador

SECUENCIACIÓN DE DNA
Blgo. Dr. José González Cabeza
SECUENCIACIÓN DE DNA
Blgo. Dr. José González Cabeza
SECUENCIACIÓN DE DNA
Blgo. Dr. José González Cabeza
PCR Multiplex
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ Varias secuencias target en forma simultánea.
➢ La eficiencia de amplificación de ambos targets no es
necesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets (% GC).
- Temperatura de hibridación de los diferentes primers.
- Tamaño de las diferentes secuencias target.
- Artefactos / dímeros entre diferentes primers.
PCR Multiplex
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ PCR con dos o mas conjuntos de
primers para amplificación de
diferentes fragmentos de uma misma
muestra.
➢ Objetivos:
✓ Identificación de varios virus.
✓ Identificación de delecciones de
genes en dolencias degenerativas
(Distrofia muscular de Duchenne)
SÍNTESIS DE GENES
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ Análogo al anterior → “Genes Sintéticos”.
➢ A partir de oligonucleótidos sintéticos y solapantes que se van
añadiendo ordenadamente.
→ Longitud de Cebadores: X = 50 nt.
→ Hasta 1000 pb (1 día de trabajo).
SÍNTESIS DE GENES
Blgo. Dr. José González Cabeza
Blgo. Dr. José González Cabeza
RECONSTRUCCIÓN DE DNA
RECONSTRUCCIÓN DE DNA
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ DNA Procedente de muestras arqueológicas, especies antiguas,
incluso especies extinguidas (ancient DNA).
➢ DNA degradado, fragmentado.
➢ PCR: Capaz de regenerar DNA original de tamaño mucho más
grande.
RECONSTRUCCIÓN DE DNA
Blgo. Dr. José González Cabeza
MODIFICACION DE SECUENCIAS
AMPLIFICADAS
Blgo. Dr. José González Cabeza
➢ ADICION DE DIANAS DE RESTRICCIÓN.
→ No hibrida con el DNA molde.
→ No afecta para cebar la polimerización.
→ Pdto. de amplificación + Enzima de restricción.
→ Clonaje en vector que tenga extremos compatibles.
➢ ADICIÓN DE ELEMENTOS REGULADORES DE LA EXPRESIÓN.
Ej: Promotores (Ej. T7, T3 o SP6) / RBS → SIN NECESIDAD DE
CLONAJE.
MODIFICACION DE SECUENCIAS
AMPLIFICADAS
Blgo. Dr. José González Cabeza
Blgo. Dr. José González Cabeza
RE1
RE2
RE1 RE2 RE1 RE2
RE1 RE2
MODIFICACION DE SECUENCIAS
AMPLIFICADAS
Blgo. Dr. José González Cabeza
MODIFICACION DE SECUENCIAS
AMPLIFICADAS
PCR INVERSA
Blgo. Dr. José González Cabeza
MUTAGENESIS DIRIGIDA
Blgo. Dr. José González Cabeza
Clonación
MUTAGÉNESIS SITIO ESPECÍFICA
Blgo. Dr. José González Cabeza
RE1
RE2
MUT1
MUT2
RE1 RE2
RE1+MUT1 RE2+MUT2
RE2
RE1
MUTAGÉNESIS AL AZAR
Blgo. Dr. José González Cabeza
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
• PCR en condiciones de baja
fidelidad
– Desbalance de
nucleotidos
– Mn++ en vez de Mg++
– Polimerasas mutantes
DETERMINACIÓN DE POLIMORFISMOS
GENÉTICOS
Blgo. Dr. José González Cabeza
Blgo. Dr. José González Cabeza
…muchas gracias.
Blgo. Dr. José González Cabeza
gonzalezbiotec@hotmail.com
www.gonzalezcabeza.com
RT - PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
Double
strand cDNA
AAAAA
TTTTT
RT
AAAAA
TTTTT
RT
RT
AAAAA
TTTTT
Oligo dT primer is
bound to mRNA
Reverse
transcriptase (RT)
copies first cDNA
strand
Reverse
transcriptase
digests and
displaces mRNA
and copies second
strand of cDNA
RT Transcriptasa Reversa:
- Avian Myeloblastosis Virus (AMV)
- Moloney murine leukemia virus (MMLV)
Blgo. Dr. José González Cabeza
Oligo dT: Para retrotranscrir todos los mRNAs presentes en la muestra. Los extremos
5‟ de genes muy largos se pueden perder.
Específico: Se retrotranscribe el gen de interés y otros que tengan la misma secuencia
(splicing alternativos, familia conservada).
Random: Se retrotranscribe todo el RNA de mi muestra (también sin poly-A). Se
obtienen fragmentos demRNAs, independientemente dela longitud de los genes.
RT - PCR
3´ RACE
Blgo. Dr. José González Cabeza
Transcripción reversa del mRNA:
Pimer adaptador (oligo - adaptador)
Amplificación por PCR: Primer
adaptador y un primer específico del
exón conocido (sense)
5´ RACE
Blgo. Dr. José González Cabeza
Transcripción reversa del mRNA: primer
específico del exón conocido (antisense)
Agregado de poli-A a la primer hebra de cDNA
(transferasa terminal)
Amplificación por PCR: primer adaptador y el
primer específico (antisense)
3´o 5´RACE clonado del producto en vector
secuenciaciónPrimer adaptador (sitios de
restricción)
NESTED PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
X bp Y bp
X bp Y bp
Fragmento A: Z pb
Fragmento B: Z -(X+Y)pb
NESTED PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
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Primers Degenerados
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• Se usan cuando quiero amplificar un gen y solo conozco su secuencia
de aminoacidos.
• Se realizan todos los primers posibles para unirlos a la secuencia de
interes.
• No los diseñamos en nuestro laboratorio, se piden.
• Los primers degenerados difieren entre ellos en la secuencia
de los codones que codifican para el mismo amino ácido.
• Se utilizan para intentar amplificar genes que se presume
tengan zonas conservadas a nivel proteína, pero se desconoce
la secuencia del cDNA.
• Ej: Buscar proteínas homólogas en otras especies.
• Alineamiento de seqde varias protconocidas en otras especies
• Determinar motivos protconservados
• Diseñar primers degenerados
Primers Degenerados
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Primers Degenerados
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Primers Degenerados
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Primers Degenerados
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Primers Degenerados
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Blgo. Dr. José González Cabeza
…muchas gracias.
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gonzalezbiotec@hotmail.com
www.gonzalezcabeza.com
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Transcripción Reversa
1. Purificación de RNA mensajero
2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)
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INMUNO - PCR vs ELISA
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protein
E
S P
ELISA
antibody with
linked enzyme
St
B
protein
Immuno-PCR
antibody with
linked DNA
B
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El Producto de PCR puede ser detectado por electroforesis o por ELISA
PCR INVERSA
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  • 1. Tema: AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS POR PCR Blgo. Dr. José González Cabeza Departamento Académico de Ciencias Grupo de Microbiología Molecular y Biotecnología
  • 2. Quién Invento la PCR ? Blgo. Dr. José González Cabeza Kary Mullis, geneticista, Nobel Prize em Química (1993) pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA Seus estudos em 1985 permitiram amplificar o DNA. Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54 Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35
  • 3. PCR = Reacción en Cadena de la Polimerasa Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ Kary Mullis → 1983. ➢ Amplificación selectiva de secuencias de DNA realizada en un sistema in vitro, libre de cèlulas. ➢ Permite la obtención de un elevado número de copias de una secuencia de DNA a partir de pequeñas muestras y un posible mal estado de conservación. ➢ Es una técnica de análisis rápida, sencilla y eficaz.
  • 4. APLICACIÓN Y VERSATILIDAD DE LA PCR Blgo. Dr. José González Cabeza Número de articulos publicados anualmente en los que se utiliza la tècnica de PCR • La PCR ha revolucionado la biologia molecular y se ha convertido en una herramienta de trabajo imprescindible, no solo en el análisis genético sino también para el análisis microbiòlogico, patòlógico, bioquímico, etc.
  • 5. FECHAS IMPORTANTES DE SU HISTORIA Blgo. Dr. José González Cabeza 1985: PRIMER ARTÍCULO SOBRE PCR. 1987: PRIMER TERMOCICLADOR COMERCIAL (Perkin-Elmer Cetus). 1989: DNA Pol y PCR → MOLÉCULA DEL AÑO (SCIENCE). 1993: KARY MULLIS → PREMIO NOBEL DE QUÍMICA. 1994: PRIMER TERMOCICLADOR PARA PCR in situ. 1995: PCR A TIEMPO REAL.
  • 6. REPLICACIÓN DEL DNA Blgo. Dr. José González Cabeza Cadena líder (Leading Strand) Primer (riboNTPs) Fragmento de Okasaki Cadena rezagada (Lagging Strand) Basta un primer
  • 7. EVENTOS DE LA REPLICACIÓN Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ Apertura de las cadenas (orígen de replicación). ➢ Colocación de los iniciadores (primers de RNA) (La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA). ➢ Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores). ➢ Eliminación de los iniciadores de RNA. ➢ Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa).
  • 8. DESARROLLOS CLAVE EN LA PCR Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ DNA Polimerasas Termoestables. ➢ Oligonucleótidos Sintéticos. ➢ Termocicladores.
  • 9. AMPLIFICACIÓN in vivo Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 10. EL CICLO DE LA PCR Blgo. Dr. José González Cabeza Etapa 1 → DESNATURALIZACIÓN. Etapa 2 → HIBRIDACIÓN. Etapa 3 → ELONGACIÓN.
  • 11. ETAPAS DE UNA REACCIÓN DE PCR Blgo. Dr. José González Cabeza 1. Desnaturalitzación 2. Hibridación 3. Elongación 94-95ºC, 1 min. 72ºC, 1 min. 45-65ºC, 1 min.
  • 12. PCR: PROGRAMACIÓN DE CICLOS Blgo. Dr. José González Cabeza RT 92ºC 55ºC 72ºC 92ºC 92ºC 55ºC 55ºC 72ºC 72ºC Desnaturalización: Lo mas corto posible. Evita inactivación de la enzima. Anillamiento: Lo mas cerca posible de las Tm de los primers Extensión: Lo mas extenso posible para asegurar fragmentos completos
  • 13. DESARROLLO DE UNA PCR Blgo. Dr. José González Cabeza DESNATURALITZACIÓ 94-96ºC 4-5 minuts CICLES (20-40) desnaturalització: 94-96ºC 1 minut hibridació: 50-65ºC 1 minut extensió: 72ºC 1 minut EXTENSIÓ 72ºC 5-10 minuts CONSERVACIÓ 4ºC a temps indefinit
  • 14. Thermus acquaticus Blgo. Dr. José González Cabeza Thermus acquaticus JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297 Vol. 98, No. I Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating Extreme Thermophile THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE Department of Microbiology, Indiana University, Bloomington, Indiana 47401 The isolation of a new thermophilic bacterium, Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is described. Successful enrichment requires incubation at 70 to 75 C, and the use of nutrient media relatively dilute with respect to the organic components. Strains of T. aquaticus have been isolated from a variety of thermal springs in Yellowstone National Park and from a thermal spring in California. The organism has also been isolated from man-made thermal habitats, such as hot tap water, in geographical locations quite distant from thermal springs. Isolates of T. Aquaticus are gram-negative nonsporulating nonmotile rods which frequently form long filaments at supraoptimal temperatures or in the stationary phase. The optimum temperature for growth is 70 C, the maximum 79 C, and the minimum about 40 C. The generation time at the optimum is about 50 min.
  • 15. Double strand cDNA AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT RT RT AAAAA TTTTT Oligo dT primer is bound to mRNA Reverse transcriptase (RT) copies first cDNA strand Reverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNA Conversion of mRNA to cDNA by Reverse Transcription
  • 16. A. Double strand DNA B. Denature 96º 50º C. Anneal primers 50º D. Polymerase binds 72º Taq Taq
  • 22. 1 2 3 4 72º K. Bind polymerase (not shown) and copy strands Third round of cDNA synthesis (16 strands)
  • 24. 1 2 3 4 M. Copy strands at 72º Fourth round of cDNA synthesis (32 strands) 72º
  • 26. 1 2 3 4 After 5 rounds there are 32 double strands of which 24 (75%) are are same size
  • 27. PCR DEMO Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 28. CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NÚMERO DE CICLOS Blgo. Dr. José González Cabeza CYCLE NUMBER DNA copy number 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 0.0E+00 2.0E+08 4.0E+08 6.0E+08 8.0E+08 1.0E+09 1.2E+09 1.4E+09 1.6E+09 1.8E+09 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR cycle DNA copy number Copies of DNA = 2N
  • 29. CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NÚMERO DE CICLOS Blgo. Dr. José González Cabeza 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR cycle DNA copy number (log)
  • 30. CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NÚMERO DE CICLOS Blgo. Dr. José González Cabeza Q = m (1 + E)n
  • 31. MOLÉCULES DE DNA EN UNA PCR Blgo. Dr. José González Cabeza Nº de còpies Nº de cicles DNA motlle
  • 32. En el tercer ciclo recién se obtienen dos copias exactas del segmento de DNA especifico. Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 33. VENTAJAS DE LA PCR SOBRE OTRAS TECNICAS Blgo. Dr. José González Cabeza ✓ ALTA SENSIBILIDAD ✓ ALTA ESPECIFICIDAD ✓ RAPIDEZ CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o productos amplificados previamente). DESVENTAJA
  • 34. COMPONENTES DE LA PCR Blgo. Dr. José González Cabeza • a. Termociclador • b. Microtubos para PCR • c. Buffer de Amplificación • d. ADN molde • e. dNTPs • f. Primers (Cebadores) • g. La Taq polimerasa
  • 35. Termocicladores Blgo. Dr. José González Cabeza Termociclador: Realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta. Tipos de termocicladores: El de color negro es una tétrada, y en él se pueden procesar simultáneamente 4 conjuntos de 96 muestras. Los cuatro más pequeños, de color blanco tienen, cada uno, una capacidad de 96 pocillos.
  • 36. Blgo. Dr. José González Cabeza Termocicladores
  • 37. 1. DNA MOLDE Blgo. Dr. José González Cabeza • La cantidad habitual usada en una PCR convencional, depende de la complejidad del DNA molde. – Humanos: 10 ng – 1 µg – Levaduras: 10 ng – Bacterias: 1 ng – Fago Lambda: 20 pg – Plásmidico: 1 – 2 pg
  • 38. 2. DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES Blgo. Dr. José González Cabeza • 1983 Klenow (poco eficaz e inespecífica; 37ºC). • 1988 Taq polimerasa I (Thermus aquaticus). Enzim Vida mitj. 95ºC Procesiv. Taxa d’extensió Activitat exonucl. Activitat correctora Taq 40 min 50-60 nt 75 nt/s Si No Stoffel 80 min 5-10 nt >50 nt/s No No Tth 20 min 30-40 nt >33 nt/s Si No Pfu >2 h 60 nt/s No Si Pwo >2 h No Si
  • 39. 2. DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 40. 2. DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES Blgo. Dr. José González Cabeza DNA POLIMERASA FUENTE Taq Amplitaq Hot Tub Pyrostase Vent Deep Vent Tth Pfu ULTma Thermus aquaticus Thermus aquaticus. Thermus flavis. Thermus flavis. Thermococcus litoralis. Pyrococcus GB-D. Thermus thermophilus. Pyrococcus furiosus Thermotoga maritima
  • 41. Taq DNA POLIMERASA Blgo. Dr. José González Cabeza Mt 94 KdA Temp. óptima. 72 – 80 C pH óptimo. 7,0 – 7,5 [Mg2+] óptima. 1,5 – 4 mM Vélocidad de Síntesis. 2 – 4 Kb / min. Procesividad. 30 – 60 bases Producto de PCR más largo. 5 kb
  • 42. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DE LA DNA POLIMERASAS Blgo. Dr. José González Cabeza 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ Pol 5’ → 3’ Exo 3’ → 5’ (Correctora) Exo 5’ → 3’
  • 43. TIPO DE DNA POLIMERASAS A EMPLEAR Blgo. Dr. José González Cabeza APLICACION LONGITUD TEMPLADO HASTA ENZIMA RUTINA 5kb Taq Pol ALTA ESPECIFICIDAD Tº AMBIENTE 5kb Platinum Taq Pol ALTA ESPECIFICIDAD ALTA FIDELIDAD 12kb Platinum Pfu Pol SIN AGREGADO DE A (PARA GENOTIPIFICACION) 500pb Platinum Genotype Pol ALTO CONTENIDO DE GC CODONES REPETIDOS Dependiendo de la polimerasa Taq, Platinum Taq
  • 44. DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu Blgo. Dr. José González Cabeza Actividad 3´ → 5´ Exonucleasa. Polimerasas con actividad 3´ → 5´ tienen menor error = Proofreading ➢ Taq Polimerasa con actividad 3´ → 5´ exonucleasa. ➢ Mayor cantidad de errores = 1,1 X 10-4 sustituciones / base. ➢ Pfu presenta actividad 3´ → 5´ exonucleasa. ➢ Menor cantidad de errores = 1,6 X 10-6 errores / base.
  • 45. DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 46. DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 47. DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 48. 3. CEBADORES O “Primers” Blgo. Dr. José González Cabeza 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ n n’ m • Los cebadores permiten definir los límites (extremos 5’ de cada un de ellos) de la secuencia específica del DNA molde a amplificar.
  • 49. Diseño de Cebadores Blgo. Dr. José González Cabeza • Longitud • Entre 15 - 25 nt. • Composición de Bases • Una proporción similar de cada uno de los nucleótidos. • Un contenido de G y C similar en la pareja de cebadores. • Evitar repeticiones. • Evitar posibles formaciones de estructures secundarias. • Extremo 3’ • Evitar complementariedad que afecten a el extremo 3’ del mismo cebador o entre cebadores. • Extremos 3’ ricos con G y C pueden dar lugar a inespecificidades. • Temperatura de fusión • Ha de ser similar la Tm en la pareja de cebadores.
  • 50. Diseño de Cebadores Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 51. TEMPERATURA DE FUSIÓN (Tm = Melting Temperature) Blgo. Dr. José González Cabeza La desnaturalización (separación de las dos cadenas) es dóna per blocs depenent del contingut amb GC de cada bloc
  • 52. TEMPERATURA DE FUSIÓN Y CONTENIDO EN GC Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 53. Diseño de Cebadores Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 54. Diseño de Cebadores Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 55. Dímeros de Cebadores (“Primer Dimers”) Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 56. Diseño de Cebadores Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 57. CÁLCULO DE LAS Tm DE LOS CEBADORES Blgo. Dr. José González Cabeza • Tm = [(nº G+C)x4+(nº A+T)x2] • Tm = 81,5+16,6 (log10(I))+0,41(%GC)-(600/N) – I és la concentració de cations monovalents i N la llargada en nucleòtids de la molècula • Tp = 22+1,46 [(nº G+C)x2+(nº A+T)]
  • 58. FACTORES QUE AFECTAN A LA TM Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 59. FACTORES QUE DETERMINAN LA ESTABILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LAS HIBRIDACIONES Blgo. Dr. José González Cabeza • Características de les moléculas – Complementariedad (secuencia) [estabilidad y especificidad]. – Longitud de la molécula (número de pares de bases) [estabilidad y especificidad]. – Porcentaje de GC [estabilidad]. • Características del ambiente – Temperatura [estabilidad]. – pH [estabilidad]. – Concentración salina (cationes monovalentes como el Na+) [estabilidad]. – Agentes desnaturalitzantes (formamida, formaldehido, úrea, otros) [estabilidad].
  • 60. 4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs Blgo. Dr. José González Cabeza • El buffer de la reacción de PCR suele contener Tris-HCl y KCl. • El pH es de 8,3 a 25ºC, pero disminuye a la temperatura de polimerización hasta 7,2 - 6,8. • El Mg+2 es necesario para la actividad de la Taq polimerasa (precisa una concentración de Mg+2 libre de al menos 1,2 - 1,3 mM). • Un defecto de Mg+2 disminuye la eficacia de la amplificación, mientras que un exceso puede producir inespecificidad. • Los dNTPs compiten por el Mg+2 en cantidades equimolares. • Debe de haber la misma conentración de cada uno de los cuatro dNTPs.
  • 61. Blgo. Dr. José González Cabeza 4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
  • 62. Blgo. Dr. José González Cabeza 4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
  • 63. Blgo. Dr. José González Cabeza 4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
  • 64. Blgo. Dr. José González Cabeza 4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
  • 65. Blgo. Dr. José González Cabeza 4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
  • 66. Blgo. Dr. José González Cabeza PCR 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 0 2 5 4 0 5 0 6 0 Nº ciclos Nº pb 4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
  • 67. CORRIDO ELECTROFORÉTICO Blgo. Dr. José González Cabeza Visualización se puede realizar con bromuro de etidio + Lámpara de luz UV). + Cámara Fotográfica
  • 68. DNA and dye are loaded in a well on a gel, and an electric field is placed across the gel Blgo. Dr. José González Cabeza (b) DNA fragments move through the gel, shorter fragments faster than longer fragments. Electrode Gel Well DNA samples from PCR of Snowball’s DNA Direction of electric field
  • 69. Blgo. Dr. José González Cabeza mixtures of DNA fragments of different sizes cathode anode - + glass plates gel short fragments long fragments completed gel power source CORRIDO ELECTROFORÉTICO
  • 70. Blgo. Dr. José González Cabeza CORRIDO ELECTROFORÉTICO
  • 71. ANÁLISIS DE LA MUESTRA Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad. Ladder: pesos conocidos 1. Fragmento a 1857 pb 2 y 4. Fragmento a 800 pb 3. No hay producto 5. Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)
  • 72. Blgo. Dr. José González Cabeza …muchas gracias. Blgo. Dr. José González Cabeza gonzalezbiotec@hotmail.com www.gonzalezcabeza.com
  • 73. Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 74. Tema: APLICACIONES DE LA PCR Blgo. Dr. José González Cabeza Departamento Académico de Ciencias Grupo de Microbiología Molecular y Biotecnología
  • 75. DETECCIÓN DE SECUENCIAS Blgo. Dr. José González Cabeza • Detección de Mutaciones: Puntuales / Delecciones / Inserciones. • Diagnóstico de Enfermedades Genéticas → Cuando se conoce el gen responsable de la patología. • Diagnóstico de Microorganismos Patógenos →Detección de secuencias específicas. • Detección de Infecciones → VIH: Secuencias específicas del profago en células sanguineas.
  • 76. AMPLIFICACIONES DE GRANDES CANTIDADES DE DNA Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ DNA molde → Procede de una muestra escasa, difícil de lograr o incluso irrepetible. → Por tanto, fuente inagotable para el futuro. PRODUCCIÓN DE SONDAS ➢ Sondas → Experiencias de Hibridación. ➢El sustrato puede ser una mezcla de DNAs o un fragmento de DNA clonado.
  • 77. PRODUCCIÓN DE ssDNA POR PCR ASIMÉTRICA Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ Regularmente para Secuenciación → Mét. de dideoxinucleótidos terminadores de cadena → ssDNA. ➢ PCR Asimétrica → Inicialmente se producen sdDNA, pero luego cebador limitante se agota pero el segundo continua sintetizando, dando lugar a ssDNA.
  • 78. PCR Asimétrica Blgo. Dr. José González Cabeza Ciclos Iniciales Cebadores → /  = 1 / 100 →  Ciclos Finales Cebador 
  • 79. SECUENCIACIÓN DE DNA Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 80. SECUENCIACIÓN DE DNA Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 81. SECUENCIACIÓN DE DNA Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 82. PCR Multiplex Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ Varias secuencias target en forma simultánea. ➢ La eficiencia de amplificación de ambos targets no es necesariamente la misma: - Secuencia de DNA de los diferentes targets (% GC). - Temperatura de hibridación de los diferentes primers. - Tamaño de las diferentes secuencias target. - Artefactos / dímeros entre diferentes primers.
  • 83. PCR Multiplex Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ PCR con dos o mas conjuntos de primers para amplificación de diferentes fragmentos de uma misma muestra. ➢ Objetivos: ✓ Identificación de varios virus. ✓ Identificación de delecciones de genes en dolencias degenerativas (Distrofia muscular de Duchenne)
  • 84. SÍNTESIS DE GENES Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ Análogo al anterior → “Genes Sintéticos”. ➢ A partir de oligonucleótidos sintéticos y solapantes que se van añadiendo ordenadamente. → Longitud de Cebadores: X = 50 nt. → Hasta 1000 pb (1 día de trabajo).
  • 85. SÍNTESIS DE GENES Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 86. Blgo. Dr. José González Cabeza RECONSTRUCCIÓN DE DNA
  • 87. RECONSTRUCCIÓN DE DNA Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ DNA Procedente de muestras arqueológicas, especies antiguas, incluso especies extinguidas (ancient DNA). ➢ DNA degradado, fragmentado. ➢ PCR: Capaz de regenerar DNA original de tamaño mucho más grande.
  • 88. RECONSTRUCCIÓN DE DNA Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 89. MODIFICACION DE SECUENCIAS AMPLIFICADAS Blgo. Dr. José González Cabeza ➢ ADICION DE DIANAS DE RESTRICCIÓN. → No hibrida con el DNA molde. → No afecta para cebar la polimerización. → Pdto. de amplificación + Enzima de restricción. → Clonaje en vector que tenga extremos compatibles. ➢ ADICIÓN DE ELEMENTOS REGULADORES DE LA EXPRESIÓN. Ej: Promotores (Ej. T7, T3 o SP6) / RBS → SIN NECESIDAD DE CLONAJE.
  • 90. MODIFICACION DE SECUENCIAS AMPLIFICADAS Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 91. Blgo. Dr. José González Cabeza RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 MODIFICACION DE SECUENCIAS AMPLIFICADAS
  • 92. Blgo. Dr. José González Cabeza MODIFICACION DE SECUENCIAS AMPLIFICADAS
  • 93. PCR INVERSA Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 94. MUTAGENESIS DIRIGIDA Blgo. Dr. José González Cabeza Clonación
  • 95. MUTAGÉNESIS SITIO ESPECÍFICA Blgo. Dr. José González Cabeza RE1 RE2 MUT1 MUT2 RE1 RE2 RE1+MUT1 RE2+MUT2 RE2 RE1
  • 96. MUTAGÉNESIS AL AZAR Blgo. Dr. José González Cabeza RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 RE1 RE2 • PCR en condiciones de baja fidelidad – Desbalance de nucleotidos – Mn++ en vez de Mg++ – Polimerasas mutantes
  • 98. Blgo. Dr. José González Cabeza …muchas gracias. Blgo. Dr. José González Cabeza gonzalezbiotec@hotmail.com www.gonzalezcabeza.com
  • 99. RT - PCR Blgo. Dr. José González Cabeza Double strand cDNA AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT RT RT AAAAA TTTTT Oligo dT primer is bound to mRNA Reverse transcriptase (RT) copies first cDNA strand Reverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNA RT Transcriptasa Reversa: - Avian Myeloblastosis Virus (AMV) - Moloney murine leukemia virus (MMLV)
  • 100. Blgo. Dr. José González Cabeza Oligo dT: Para retrotranscrir todos los mRNAs presentes en la muestra. Los extremos 5‟ de genes muy largos se pueden perder. Específico: Se retrotranscribe el gen de interés y otros que tengan la misma secuencia (splicing alternativos, familia conservada). Random: Se retrotranscribe todo el RNA de mi muestra (también sin poly-A). Se obtienen fragmentos demRNAs, independientemente dela longitud de los genes. RT - PCR
  • 101. 3´ RACE Blgo. Dr. José González Cabeza Transcripción reversa del mRNA: Pimer adaptador (oligo - adaptador) Amplificación por PCR: Primer adaptador y un primer específico del exón conocido (sense)
  • 102. 5´ RACE Blgo. Dr. José González Cabeza Transcripción reversa del mRNA: primer específico del exón conocido (antisense) Agregado de poli-A a la primer hebra de cDNA (transferasa terminal) Amplificación por PCR: primer adaptador y el primer específico (antisense) 3´o 5´RACE clonado del producto en vector secuenciaciónPrimer adaptador (sitios de restricción)
  • 103. NESTED PCR Blgo. Dr. José González Cabeza X bp Y bp X bp Y bp Fragmento A: Z pb Fragmento B: Z -(X+Y)pb
  • 104. NESTED PCR Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 105. Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 106. Primers Degenerados Blgo. Dr. José González Cabeza • Se usan cuando quiero amplificar un gen y solo conozco su secuencia de aminoacidos. • Se realizan todos los primers posibles para unirlos a la secuencia de interes. • No los diseñamos en nuestro laboratorio, se piden.
  • 107. • Los primers degenerados difieren entre ellos en la secuencia de los codones que codifican para el mismo amino ácido. • Se utilizan para intentar amplificar genes que se presume tengan zonas conservadas a nivel proteína, pero se desconoce la secuencia del cDNA. • Ej: Buscar proteínas homólogas en otras especies. • Alineamiento de seqde varias protconocidas en otras especies • Determinar motivos protconservados • Diseñar primers degenerados
  • 108. Primers Degenerados Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 109. Primers Degenerados Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 110. Primers Degenerados Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 111. Primers Degenerados Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 112. Primers Degenerados Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 113. Blgo. Dr. José González Cabeza …muchas gracias. Blgo. Dr. José González Cabeza gonzalezbiotec@hotmail.com www.gonzalezcabeza.com
  • 114.
  • 115. Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 116. Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 117. Blgo. Dr. José González Cabeza Transcripción Reversa 1. Purificación de RNA mensajero 2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)
  • 118. Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 119. Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 120. INMUNO - PCR vs ELISA Blgo. Dr. José González Cabeza protein E S P ELISA antibody with linked enzyme St B protein Immuno-PCR antibody with linked DNA B
  • 121. Blgo. Dr. José González Cabeza El Producto de PCR puede ser detectado por electroforesis o por ELISA
  • 122. PCR INVERSA Blgo. Dr. José González Cabeza
  • 123. PCR REVERSA Blgo. Dr. José González Cabeza Touch-down PCR Nested touch-down PCR