TEMA 8. PCR - Dr GONZALEZ.pdf

Tema:
AMPLIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLÉICOS POR
PCR
Blgo. Dr. José González Cabeza
Departamento Académico de Ciencias
Grupo de Microbiología Molecular y Biotecnología

Quién Invento la PCR ?
Kary Mullis, geneticista, Nobel
Prize em Química (1993) pelo
desenvolvimento de um
método que permite
sintetizar, em poucas horas e
in vitro, uma grande
quantidade de um
determinado fragmento de
DNA
Seus estudos em 1985
permitiram amplificar o DNA.
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification
of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230: 1350-54
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed
chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35

PCR = Reacción en Cadena de la Polimerasa
➢ Kary Mullis → 1983.
➢ Amplificación selectiva de secuencias de DNA realizada en un
sistema in vitro, libre de cèlulas.
➢ Permite la obtención de un elevado número de copias de una
secuencia de DNA a partir de pequeñas muestras y un posible mal
estado de conservación.
➢ Es una técnica de análisis rápida, sencilla y eficaz.

APLICACIÓN Y VERSATILIDAD DE LA PCR
Número de articulos publicados anualmente
en los que se utiliza la tècnica de PCR
• La PCR ha
revolucionado la
biologia molecular y se
ha convertido en una
herramienta de
trabajo
imprescindible, no
solo en el análisis
genético sino también
para el análisis
microbiòlogico,
patòlógico,
bioquímico, etc.

FECHAS IMPORTANTES DE SU HISTORIA
1985: PRIMER ARTÍCULO SOBRE PCR.
1987: PRIMER TERMOCICLADOR COMERCIAL (Perkin-Elmer Cetus).
1989: DNA Pol y PCR → MOLÉCULA DEL AÑO (SCIENCE).
1993: KARY MULLIS → PREMIO NOBEL DE QUÍMICA.
1994: PRIMER TERMOCICLADOR PARA PCR in situ.
1995: PCR A TIEMPO REAL.

REPLICACIÓN DEL DNA
Cadena líder
(Leading Strand)
Primer (riboNTPs)
Fragmento de Okasaki
Cadena rezagada
(Lagging Strand)
Basta un primer

EVENTOS DE LA REPLICACIÓN
➢ Apertura de las cadenas (orígen de replicación).
➢ Colocación de los iniciadores (primers de RNA) (La cadena líder
utilizará un solo iniciador mientras que las cadenas rezagadas
utilizarán varios iniciadores de RNA).
➢ Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores).
➢ Eliminación de los iniciadores de RNA.
➢ Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa).

DESARROLLOS CLAVE EN LA PCR
➢ DNA Polimerasas Termoestables.
➢ Oligonucleótidos Sintéticos.
➢ Termocicladores.

AMPLIFICACIÓN in vivo

EL CICLO DE LA PCR
Etapa 1 → DESNATURALIZACIÓN.
Etapa 2 → HIBRIDACIÓN.
Etapa 3 → ELONGACIÓN.

ETAPAS DE UNA REACCIÓN DE PCR
1. Desnaturalitzación
2. Hibridación
3. Elongación
94-95ºC, 1 min.
72ºC, 1 min.
45-65ºC, 1 min.

PCR: PROGRAMACIÓN DE CICLOS
RT
92ºC
55ºC
72ºC
92ºC 92ºC
55ºC 55ºC
72ºC 72ºC
Desnaturalización:
Lo mas corto
posible. Evita
inactivación de la
enzima.
Anillamiento:
Lo mas cerca
posible de las Tm
de los primers
Extensión:
Lo mas extenso
posible para asegurar
fragmentos completos

DESARROLLO DE UNA PCR
DESNATURALITZACIÓ
94-96ºC 4-5 minuts
CICLES (20-40)
desnaturalització: 94-96ºC 1 minut
hibridació: 50-65ºC 1 minut
extensió: 72ºC 1 minut
EXTENSIÓ
72ºC 5-10 minuts
CONSERVACIÓ
4ºC a temps indefinit

Thermus acquaticus
Thermus
acquaticus
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297 Vol.
98, No. I
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating
Extreme Thermophile
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE
Department of Microbiology, Indiana University,
Bloomington, Indiana 47401
The isolation of a new thermophilic bacterium, Thermus
aquaticus gen. n. And sp. n., is described. Successful
enrichment requires incubation at 70 to 75 C, and the use
of nutrient media relatively dilute with respect to the
organic components.
Strains of T. aquaticus have been isolated from a variety of
thermal springs in Yellowstone National Park and from a
thermal spring in California. The organism has also been
isolated from man-made thermal habitats, such as hot tap
water, in geographical locations quite distant from thermal
springs. Isolates of T. Aquaticus are gram-negative
nonsporulating nonmotile rods which frequently form long
filaments at supraoptimal temperatures or in the
stationary phase. The optimum temperature for growth is
70 C, the maximum 79 C, and the minimum about 40 C.
The generation time at the optimum is about 50 min.

Double
strand cDNA
AAAAA
TTTTT
RT
AAAAA
TTTTT
RT
RT
AAAAA
TTTTT
Oligo dT primer is
bound to mRNA
Reverse
transcriptase (RT)
copies first cDNA
strand
Reverse
transcriptase
digests and
displaces mRNA
and copies second
strand of cDNA
Conversion of mRNA to cDNA by Reverse Transcription

A. Double
strand DNA
B. Denature
96º
50º
C. Anneal
primers
50º
D. Polymerase
binds
72º
Taq
Taq

72º
Taq
Taq
E. Copy
strands
1
2
3
4
F.
Denature
96º
First round
of cDNA
synthesis (4
strands)
Taq
Taq

1
2
3
4
50º
G. Anneal
primers

1
2
3
4
Taq
Taq
Taq
Taq
72º
H.
Polymerase
binds

1
2
3
4
Taq
Taq
Taq
Taq
I. Copy
strands
72º
Second
round of
cDNA
synthesis (8
strands)

1
2
3
4
J.
Denature at 96º
Anneal primers at
50º

1
2
3
4
72º
K. Bind polymerase
(not shown) and copy
strands
Third
round of
cDNA
synthesis
(16
strands)

1
2
3
4
L.
Denature at 96º
Anneal primers at
50º

1
2
3
4
M.
Copy strands at
72º
Fourth
round of
cDNA
synthesis
(32
strands)
72º

1
2
3
4
cDNA
strands (32)
are now
shown as
lines

1
2
3
4
After 5 rounds
there are 32
double strands of
which 24 (75%) are
are same size

PCR DEMO

CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs
NÚMERO DE CICLOS
CYCLE NUMBER DNA copy number
0 1
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1,024
11 2,048
12 4,096
13 8,192
14 16,384
15 32,768
16 65,536
17 131,072
18 262,144
19 524,288
20 1,048,576
21 2,097,152
22 4,194,304
23 8,388,608
24 16,777,216
25 33,554,432
26 67,108,864
27 134,217,728
28 268,435,456
29 536,870,912
30 1,073,741,824
31 1,400,000,000
32 1,500,000,000
33 1,550,000,000
34 1,580,000,000
0.0E+00
2.0E+08
4.0E+08
6.0E+08
8.0E+08
1.0E+09
1.2E+09
1.4E+09
1.6E+09
1.8E+09
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DNA
copy
number
Copies of DNA = 2N

NÚMERO DE CICLOS
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DNA
copy
number
(log)

NÚMERO DE CICLOS
Q = m (1 + E)n

MOLÉCULES DE DNA EN UNA PCR
Nº
de
còpies
Nº de cicles
DNA motlle

En el tercer ciclo recién se obtienen dos copias exactas del segmento de
DNA especifico.

VENTAJAS DE LA PCR SOBRE OTRAS TECNICAS
✓ ALTA SENSIBILIDAD
✓ ALTA ESPECIFICIDAD
✓ RAPIDEZ
CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o
productos amplificados previamente).
DESVENTAJA

COMPONENTES DE LA PCR
• a. Termociclador
• b. Microtubos para PCR
• c. Buffer de Amplificación
• d. ADN molde
• e. dNTPs
• f. Primers (Cebadores)
• g. La Taq polimerasa

Termocicladores
Termociclador: Realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas
programadas de forma exacta.
Tipos de termocicladores: El de color negro es una tétrada, y en él se
pueden procesar simultáneamente 4 conjuntos de 96 muestras. Los
cuatro más pequeños, de color blanco tienen, cada uno, una capacidad
de 96 pocillos.

Termocicladores

1. DNA MOLDE
• La cantidad habitual usada en una PCR convencional,
depende de la complejidad del DNA molde.
– Humanos: 10 ng – 1 µg
– Levaduras: 10 ng
– Bacterias: 1 ng
– Fago Lambda: 20 pg
– Plásmidico: 1 – 2 pg

2. DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES
• 1983 Klenow
(poco eficaz e
inespecífica; 37ºC).
• 1988 Taq
polimerasa I
(Thermus aquaticus).
Enzim Vida mitj.
95ºC
Procesiv. Taxa
d’extensió
Activitat
exonucl.
Activitat
correctora
Taq 40 min 50-60 nt 75 nt/s Si No
Stoffel 80 min 5-10 nt >50 nt/s No No
Tth 20 min 30-40 nt >33 nt/s Si No
Pfu >2 h 60 nt/s No Si
Pwo >2 h No Si

DNA POLIMERASA FUENTE
Taq
Amplitaq
Hot Tub
Pyrostase
Vent
Deep Vent
Tth
Pfu
ULTma
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus.
Thermus flavis.
Thermus flavis.
Thermococcus litoralis.
Pyrococcus GB-D.
Thermus thermophilus.
Pyrococcus furiosus
Thermotoga maritima

Taq DNA POLIMERASA
Mt 94 KdA
Temp. óptima. 72 – 80 C
pH óptimo. 7,0 – 7,5
[Mg2+] óptima. 1,5 – 4 mM
Vélocidad de Síntesis. 2 – 4 Kb / min.
Procesividad. 30 – 60 bases
Producto de PCR más largo. 5 kb

ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS
DE LA DNA POLIMERASAS
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
Pol 5’ → 3’
Exo 3’ → 5’
(Correctora)
Exo 5’ → 3’

TIPO DE DNA POLIMERASAS A EMPLEAR
APLICACION LONGITUD TEMPLADO
HASTA
ENZIMA
RUTINA 5kb Taq Pol
ALTA ESPECIFICIDAD
Tº AMBIENTE
5kb Platinum Taq Pol
ALTA ESPECIFICIDAD
ALTA FIDELIDAD
12kb Platinum Pfu Pol
SIN AGREGADO DE A (PARA
GENOTIPIFICACION)
500pb Platinum Genotype Pol
ALTO CONTENIDO DE GC
CODONES REPETIDOS
Dependiendo de la
polimerasa
Taq, Platinum Taq

DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu
Actividad 3´ → 5´ Exonucleasa. Polimerasas con actividad 3´ → 5´
tienen menor error = Proofreading
➢ Taq Polimerasa con
actividad 3´ → 5´
exonucleasa.
➢ Mayor cantidad de
errores = 1,1 X 10-4
sustituciones / base.
➢ Pfu presenta actividad 3´
→ 5´ exonucleasa.
➢ Menor cantidad de
errores = 1,6 X 10-6
errores / base.

DIFERENCIAS ENTRE Taq y Pfu

3. CEBADORES O “Primers”
3’ 5’
3’
5’
3’
5’
3’ 5’
n n’
m
• Los cebadores permiten definir los límites (extremos 5’ de cada un
de ellos) de la secuencia específica del DNA molde a amplificar.

Diseño de Cebadores
• Longitud
• Entre 15 - 25 nt.
• Composición de Bases
• Una proporción similar de cada uno de los nucleótidos.
• Un contenido de G y C similar en la pareja de cebadores.
• Evitar repeticiones.
• Evitar posibles formaciones de estructures secundarias.
• Extremo 3’
• Evitar complementariedad que afecten a el extremo 3’ del mismo cebador
o entre cebadores.
• Extremos 3’ ricos con G y C pueden dar lugar a inespecificidades.
• Temperatura de fusión
• Ha de ser similar la Tm en la pareja de cebadores.

Diseño de Cebadores

TEMPERATURA DE FUSIÓN
(Tm = Melting Temperature)
La desnaturalización (separación
de las dos cadenas) es dóna per
blocs depenent del contingut
amb GC de cada bloc

TEMPERATURA DE FUSIÓN
Y CONTENIDO EN GC

Dímeros de Cebadores (“Primer Dimers”)

CÁLCULO DE LAS Tm DE LOS CEBADORES
• Tm = [(nº G+C)x4+(nº A+T)x2]
• Tm = 81,5+16,6 (log10(I))+0,41(%GC)-(600/N)
– I és la concentració de cations monovalents i N la llargada en nucleòtids de
la molècula
• Tp = 22+1,46 [(nº G+C)x2+(nº A+T)]

FACTORES QUE AFECTAN A LA TM

FACTORES QUE DETERMINAN LA ESTABILIDAD Y ESPECIFICIDAD
DE LAS HIBRIDACIONES
• Características de les moléculas
– Complementariedad (secuencia) [estabilidad y especificidad].
– Longitud de la molécula (número de pares de bases) [estabilidad
y especificidad].
– Porcentaje de GC [estabilidad].
• Características del ambiente
– Temperatura [estabilidad].
– pH [estabilidad].
– Concentración salina (cationes monovalentes como el Na+)
[estabilidad].
– Agentes desnaturalitzantes (formamida, formaldehido, úrea,
otros) [estabilidad].

4. BUFFER DE LA REACCIÓN DE PCR y dNTPs
• El buffer de la reacción de PCR suele contener Tris-HCl y KCl.
• El pH es de 8,3 a 25ºC, pero disminuye a la temperatura de
polimerización hasta 7,2 - 6,8.
• El Mg+2 es necesario para la actividad de la Taq polimerasa (precisa
una concentración de Mg+2 libre de al menos 1,2 - 1,3 mM).
• Un defecto de Mg+2 disminuye la eficacia de la amplificación,
mientras que un exceso puede producir inespecificidad.
• Los dNTPs compiten por el Mg+2 en cantidades equimolares.
• Debe de haber la misma conentración de cada uno de los cuatro
dNTPs.

PCR
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
0
2
5
4
0
5
0
6
0
Nº ciclos
Nº
pb

CORRIDO ELECTROFORÉTICO
Visualización se puede realizar con
bromuro de etidio
+
Lámpara de luz UV).
+
Cámara Fotográfica

DNA and dye are loaded in a well on a gel, and an
electric field is placed across the gel
(b) DNA fragments move through the gel, shorter
fragments faster than longer fragments.
Electrode
Gel
Well
DNA samples from PCR of
Snowball’s DNA
Direction of
electric field

mixtures of DNA
fragments of different sizes
cathode
anode
-
+
glass
plates
gel
short
fragments
long
fragments
completed gel
power
source

ANÁLISIS DE LA MUESTRA
➢ La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio
(lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad.
Ladder: pesos conocidos
1. Fragmento a 1857 pb
2 y 4. Fragmento a 800 pb
3. No hay producto
5. Multiples bandas
(primers inespecíficos se
pegan a varios sitios)

…muchas gracias.
gonzalezbiotec@hotmail.com
www.gonzalezcabeza.com

Tema:
APLICACIONES DE LA PCR
Departamento Académico de Ciencias
Grupo de Microbiología Molecular y Biotecnología

DETECCIÓN DE SECUENCIAS
• Detección de Mutaciones:
Puntuales / Delecciones / Inserciones.
• Diagnóstico de Enfermedades Genéticas
→ Cuando se conoce el gen responsable de la patología.
• Diagnóstico de Microorganismos Patógenos
→Detección de secuencias específicas.
• Detección de Infecciones
→ VIH: Secuencias específicas del profago en células
sanguineas.

AMPLIFICACIONES DE GRANDES
CANTIDADES DE DNA
➢ DNA molde
→ Procede de una muestra escasa, difícil de lograr o
incluso irrepetible.
→ Por tanto, fuente inagotable para el futuro.
PRODUCCIÓN DE SONDAS
➢ Sondas → Experiencias de Hibridación.
➢El sustrato puede ser una mezcla de DNAs o un fragmento de DNA
clonado.

PRODUCCIÓN DE ssDNA POR
PCR ASIMÉTRICA
➢ Regularmente para Secuenciación
→ Mét. de dideoxinucleótidos terminadores de cadena → ssDNA.
➢ PCR Asimétrica
→ Inicialmente se producen sdDNA, pero luego cebador limitante
se agota pero el segundo continua sintetizando, dando lugar a
ssDNA.

PCR Asimétrica
Ciclos
Iniciales
Cebadores
→ /  = 1 / 100
→

Ciclos Finales
Cebador


SECUENCIACIÓN DE DNA

PCR Multiplex
➢ Varias secuencias target en forma simultánea.
➢ La eficiencia de amplificación de ambos targets no es
necesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets (% GC).
- Temperatura de hibridación de los diferentes primers.
- Tamaño de las diferentes secuencias target.
- Artefactos / dímeros entre diferentes primers.

PCR Multiplex
➢ PCR con dos o mas conjuntos de
primers para amplificación de
diferentes fragmentos de uma misma
muestra.
➢ Objetivos:
✓ Identificación de varios virus.
✓ Identificación de delecciones de
genes en dolencias degenerativas
(Distrofia muscular de Duchenne)

SÍNTESIS DE GENES
➢ Análogo al anterior → “Genes Sintéticos”.
➢ A partir de oligonucleótidos sintéticos y solapantes que se van
añadiendo ordenadamente.
→ Longitud de Cebadores: X = 50 nt.
→ Hasta 1000 pb (1 día de trabajo).

SÍNTESIS DE GENES

RECONSTRUCCIÓN DE DNA

➢ DNA Procedente de muestras arqueológicas, especies antiguas,
incluso especies extinguidas (ancient DNA).
➢ DNA degradado, fragmentado.
➢ PCR: Capaz de regenerar DNA original de tamaño mucho más
grande.

MODIFICACION DE SECUENCIAS
AMPLIFICADAS
➢ ADICION DE DIANAS DE RESTRICCIÓN.
→ No hibrida con el DNA molde.
→ No afecta para cebar la polimerización.
→ Pdto. de amplificación + Enzima de restricción.
→ Clonaje en vector que tenga extremos compatibles.
➢ ADICIÓN DE ELEMENTOS REGULADORES DE LA EXPRESIÓN.
Ej: Promotores (Ej. T7, T3 o SP6) / RBS → SIN NECESIDAD DE
CLONAJE.

AMPLIFICADAS

RE1
RE2
RE1 RE2 RE1 RE2
RE1 RE2
AMPLIFICADAS

AMPLIFICADAS

PCR INVERSA

MUTAGENESIS DIRIGIDA
Clonación

MUTAGÉNESIS SITIO ESPECÍFICA
RE1
RE2
MUT1
MUT2
RE1 RE2
RE1+MUT1 RE2+MUT2
RE2
RE1

MUTAGÉNESIS AL AZAR
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
• PCR en condiciones de baja
fidelidad
– Desbalance de
nucleotidos
– Mn++ en vez de Mg++
– Polimerasas mutantes

DETERMINACIÓN DE POLIMORFISMOS
GENÉTICOS

RT - PCR
Double
strand cDNA
AAAAA
TTTTT
RT
AAAAA
TTTTT
RT
RT
AAAAA
TTTTT
Oligo dT primer is
bound to mRNA
Reverse
transcriptase (RT)
copies first cDNA
strand
Reverse
transcriptase
digests and
displaces mRNA
and copies second
strand of cDNA
RT Transcriptasa Reversa:
- Avian Myeloblastosis Virus (AMV)
- Moloney murine leukemia virus (MMLV)

Oligo dT: Para retrotranscrir todos los mRNAs presentes en la muestra. Los extremos
5‟ de genes muy largos se pueden perder.
Específico: Se retrotranscribe el gen de interés y otros que tengan la misma secuencia
(splicing alternativos, familia conservada).
Random: Se retrotranscribe todo el RNA de mi muestra (también sin poly-A). Se
obtienen fragmentos demRNAs, independientemente dela longitud de los genes.
RT - PCR

3´ RACE
Transcripción reversa del mRNA:
Pimer adaptador (oligo - adaptador)
Amplificación por PCR: Primer
adaptador y un primer específico del
exón conocido (sense)

5´ RACE
Transcripción reversa del mRNA: primer
específico del exón conocido (antisense)
Agregado de poli-A a la primer hebra de cDNA
(transferasa terminal)
Amplificación por PCR: primer adaptador y el
primer específico (antisense)
3´o 5´RACE clonado del producto en vector
secuenciaciónPrimer adaptador (sitios de
restricción)

NESTED PCR
X bp Y bp
X bp Y bp
Fragmento A: Z pb
Fragmento B: Z -(X+Y)pb

NESTED PCR

Primers Degenerados
• Se usan cuando quiero amplificar un gen y solo conozco su secuencia
de aminoacidos.
• Se realizan todos los primers posibles para unirlos a la secuencia de
interes.
• No los diseñamos en nuestro laboratorio, se piden.

• Los primers degenerados difieren entre ellos en la secuencia
de los codones que codifican para el mismo amino ácido.
• Se utilizan para intentar amplificar genes que se presume
tengan zonas conservadas a nivel proteína, pero se desconoce
la secuencia del cDNA.
• Ej: Buscar proteínas homólogas en otras especies.
• Alineamiento de seqde varias protconocidas en otras especies
• Determinar motivos protconservados
• Diseñar primers degenerados

Primers Degenerados

Transcripción Reversa
1. Purificación de RNA mensajero
2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)

INMUNO - PCR vs ELISA
protein
E
S P
ELISA
antibody with
linked enzyme
St
B
protein
Immuno-PCR
antibody with
linked DNA
B

El Producto de PCR puede ser detectado por electroforesis o por ELISA

PCR REVERSA
Touch-down PCR
Nested touch-down PCR

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