Este documento presenta información sobre el aislamiento y caracterización del ADN. Describe la estructura de doble hélice del ADN, incluyendo los componentes de los nucleótidos y los enlaces entre las cadenas. Explica cómo se separan las cadenas durante la desnaturalización del ADN mediante calor o cambios de pH. Los objetivos son aislar ADN cromosómico bacteriano, determinar su espectro de absorción y concentración, y analizar factores que influyen en la desnaturalización del ADN como la secuencia de

1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Departamento de Genética Microbiana
PRACTICA NO.1
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE DNA
INTRODUCCIÓN
El ADN estápresente entodaslascélulasyesel material hereditarioque contienetodala
informacióngenéticaque lacélulanecesita.En1953, JamesD. Watsony Francis Crick
descubrieronlaformade lamoléculadel ácidodesoxirribonucleicooADN.Estamoléculaes
semejante aunaescaleraenformade caracol o espiral yse le conoce como laDoble Hélice.La
escalerade ADN,estáformadapor dos cadenasque se unenpor mediode peldaños.lospeldaños
formanparejasgracias a cuatro paresde basesnitrogenadasllamadasnucleótidosque se conocen
como adenina(A),timina(T),guanina(G),ycitosina(C). losácidosnucleicossonde dostipos,
púricasy pirimidínicas.
Un nucleótido tiene trescomponentes: unabase púricao pirimídica,unidaatravésde uno de sus
nitrógenos,mediante unenlace N.glicósido,aunazúcar cíclico de cinco carbonos(lacombinación
de la base con el azúcar se denominanucleósido)y unfosfato,esterificadoconel carbonoen
posiciónSdel azúcar. Los nucleótidosexistentambiénenformasactivas,tipodi- ytrifosfato,en
lasque uno o dos gruposfostatoestanunidosal nucleótidoporenlacesde anhídridofosfórico
(pirofosfato).
Los nucleótidosse unenentre si paraformarlargascadenasde polinuclóetidos,estauniónentre
monómerosnucleótidosse realizamediante enlaces fosfodiésterentre loscarbonosde las

2. posiciones3’de unnucleótidoconla5’
Cada hélice esunaserie de nucleótidosunidosporenlacesfosfodiésterenlosque ungrupo
fosfatoformaun puente entre gruposOHde dosazúcares sucesivos(posiciones3’ de un
azúcar y 5’ del siguiente).
Las dos hélicesse mantienenunidasmediantepuentes de hidrogenoproducidos
entre lasbasesnitrogenadasde cadahélice.Siguiendolosdatosde Chargaff (1959), la
Adeninade unahélice apareaconla Timinade lahélice complementariamediante dos
puentesde hidrógeno.Igualmente,laGuaninade unahélice apareaconla Citosinade la
complementariamediante trespuentesde hidrógeno.
Las doshélicesporrazonesde complementaridadde lasbasesnitrogenadasson
antiparalelas,teniendosecuenciasde átomosinversas.Unahélice llevalasecuencia5’P→
3’ OH , mientrasque lahélice complementariasigue lasecuenciade átomos3’OH→ 5’P.
Desnaturalización
Las cadenasdel DNA se separancuandose rompenlosenlacesde hidrógenoexistentesentre las
bases.Esta fusiónde laestructurasecundariapuede llevarseacabo ensolución,aumentandola
temperaturaóbienpor titulaciónconácidosóálcalis.Losácidosprotonizanlosnitrógenosdel
anillode A,Gy C; losálcalisdesprotonizanlosnitrógenosdel anillode Gy T. La pococorriente
labilidadde losenlacesglicosídicosde lapurinaa bajopH hace que lautilizaciónde ácidosnosea
convenienteparalosexperimentosde desnaturalización. Laestabilidaddelduplex esuna función
directadel númerode paresG-C que contiene unidosporuntriple enlace de hidrógeno;cuanto
mayor esla fracciónmolarde pares G-C,tanto más elevadaeslatemperaturaoel pH de la fusión.
La temperaturacorrespondiente al puntomediode lafusióndelDNA (Tm) estádeterminadapor
su contenidoenG-C
ABSORBANCIA A 260 nm
El estadofísicode los ácidosnucleicosestárelacionadoconsu
capacidadde absorciónde laluz ultravioleta(UV) a260nm. El menorgrado de absorciónse
produce enestado de doble hélice,laabsorciónaumentacuandose produce ladesnaturalización
pasandoa estadode hélice sencilla(efectohipercrómico,aumentode laabsorbancia) y,por
último,si degradamoseste ADN de hélice sencillaanivel de nucleótidoslibres,de nuevo
aumentalaabsorbancia.

3. Figura1. Espectrode absorción Figura2. Efectohipercrómico
característico del DNA de doble cadena
OBJETIVOS
 Aislar DNA Cromosómico de alto peso molecular a partir de un cultivo
bacteriano y/o de un lisado fágico.
 Establecer el espectro de absorción del DNA aislado.
 Determinar la concentración y grado de pureza del DNA obtenido.
 Determinar la influencia de Algunas Características de la secuencia del
DNA sobre su desnaturalización empleando el programa bioinformático
DNA-MAN.
RESULTADOS
Aislamiento de DNA cromosómico de un microorganismo Gram negativo
(Escherichia coli cepa W3350)
Tabla 1. Absorbancias a diferentes longitudes de onda del aislamiento de DNA
cromosómico de Escherichia coli de los equipos de la sección 1 grupo 5QV2
Equipo/Abs 230nm 240nm 250nm 260nm 270nm 280nm 290nm 300nm
1 5.643 5.424 7.228 7.985 6.720 4.366 1.908 0-481
2 7.096 7.553 10.741 11.509 9.549 6.233 2.758 1.566
3 5.001 6.5 9.253 10.253 7.981 4.83 1.957 0.394
4 3.109 3.729 5.329 5.838 5.583 2.752 1.126 0.252
5 4.885 5.255 7.249 7.753 6.61 4.214 1.828 0.346
6 6.91 9.70 14.398 15.697 12.448 7.275 2.926 0.534

4. Figura 3. Espectro de absorción del DNA cromosómico de Escherichia coli W3355
obtenido por el equipo 6 sección 1 grupo 5QV2
CALCULOS
Tabla2. Resultadosde loscálculosde pureza,concentraciónDNA soluciónoriginal y concentración
de DNA de doble cadenade losequiposde lasección1 del grupo5QV2
CALCULOS del equipo 6 sección 1 grupo 5QV2
Equipo Pureza Concentración IAE
µg/mL
Concentración
(proporción)
1 1.83 354.88 399.25
2 1.84 511.51 575.45
3 2.12 455 512.65
4 2.12 259.46 291.9
5 1.83 344 387.5
6 2.15 697.64 784.85

5. Calculo de la concentración DNA solución original
𝐶 =
𝐴𝑠260𝑛𝑚
𝐴𝑒 . 𝑏
Pureza =
𝐴𝑠260
𝐴𝑠280
C=
15.697
(22500)(1)
= 6.9764X10-4
g/mL Pureza=
15.697
7.275
= 2.15
6.9764X10-4
[
g⃥
mL
] [
1000m⃥g
1⃥g
] [
1000µg
1m⃥g
]
C=697.644 µg/mL
Calculo de concentración DNA de doble cadena
1unidad de As260nm de = 50 µg /mL de DNA
DNA de doble cadena de doble cadena
15.697[
50µg/mL
1unidadAs260
] = 784.85 µg/mL
Curva de desnaturalización del DNAproblema teórico:
Ejercicio 1
Absorción de la luz a 260 nm por el DNA cromosómico a diferentes temperaturas
°c As 260 nm
67 0.278
71 0.278
75 0.278
79 0.278
83 0.379
87 0.478
91 0.476
95 0.476
Tabla 3: absorbancias a 260nm a diferentes temperaturas de DNA cromosómico.

6. Figura 4: Absorción de la luz a 260 nm por el DNA cromosómico a diferentes
temperaturas
Calculo de la concentración de Adenina y Timina
Tm=69.3+0.41 (G+C)
G+C=(tm-69.3)/0.41
De la gráfica se obtiene Tm=83°C
G+C=(83-69.3)/0.41=33.41
(T+A)=100-33.41=66.59
Curva de desnaturalización del DNAproblema teórico:
Ejercicio 2
Absorción de la luz a 260 nm por el DNA fágico a diferentes temperaturas
°C As 260 nm
63 0.224
67 0.224
71 0.225
75 0.225
79 0.274
83 0.348
87 0.417
91 0.417
95 0.417

7. Tabla 4: absorbancias a 260nm a diferentes temperaturas de DNA fágico.
Figura 5: Absorción de la luz a 260 nm por el DNA fágico a diferentes temperaturas.
Calculo de la concentración de Adenina y Timina
Tm=69.3+0.41 (G+C)
G+C=(tm-69.3)/0.41
De la gráfica se obtiene Tm=82°C
G+C=(82-69.3)/0.41=30.98
(T+A)=100-30.98=62.02
ESPECTRO DE ABSORCIÓN CARACTERISTICO DE E.coli
Figura 6: espectro de absorción del DNA nativo de E. coli y el espectro promedio
para los cuatro componentes desoxinucleótidos en solución acuosa (---).
ESPECTROS DE ABSORCION DEL DNA CONTAMINADO

8. Figura 7: DNA contaminado con fenoles, la flecha muestra la ubicación del pico de
absorción predominante.
Figura 8. Espectros de absorción del ADN contaminado con proteínas. La flecha muestra
la ubicación del pico de absorción predominante.
Influencia de diferentes parámetros sobre la desnaturalización de
oligodesoxirribonucléotidos efectuadas empleando el programa
bioinformático DNAMAN.
A. Influencia del contenido de GC
Oligo: 5'-CACAGTAATGCCTACGATTCATGGGCGTCAGCGTGTGTCA-3'
Primer1: 40 bases
Composition 9 A; 10 C; 11 G; 10 T; 0 OTHER
Percentage: 22% A; 25% C; 27% G; 25% T; 0%OTHER
MW=12.37 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 83.4 °C %GC Tm = 68.9 °C GC+AT Tm = 122.0°C

9. Oligo: 5'-CATCATCATACCAACGGTCGGGGGAGCAGTCATGACGGAC-3'
Primer1: 40 bases
Composition 11 A; 11 C; 12 G; 6 T; 0 OTHER
Percentage: 27% A; 27% C; 30% G; 15% T; 0%OTHER
MW=12.39 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0%
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 85.1 °C %GC Tm = 71.0 °C GC+AT Tm = 126.0°C
Oligo: 5'-CCGCGGCCGGCCGGGCGAGAGCGCAGCAGCGCGCGCAGCA-3'
Primer1: 40 bases
Composition 6 A; 16 C; 18 G; 0 T; 0 OTHER
Percentage: 15% A; 40% C; 45% G; 0% T; 0%OTHER
MW=12.42 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0%
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 101.4°C %GC Tm = 82.3 °C GC+AT Tm = 148.0°C
B. Influencia de la variación en la secuencia de nucleótidos.
Oligonucleótido: 5'-
TACGTCCATGGATACGTACGTGGACCTAGCTGCATACGTA-3'
Primer 2: 40 bases
Composición: 10 A; 10 C; 10 G; 10 T.
Porcentaje: 25% A; 25% C; 25% G; 25% T.
Peso molecular =12.35 kDa
Thermo Tm = 77.8 °C %GC Tm = 67.9 °C GC+AT Tm = 120.0°C
Oligonucleótido: 5'-
ACGGCTACGTACGTCGGCGCATACGTTAATTATATACCGG-3'
Primer 3: 40 bases
Composición: 10 A; 10 C; 10 G; 10 T.
Porcentaje: 25% A; 25% C; 25% G; 25% T.
Peso molecular=12.35 kDa
Thermo Tm = 78.2 °C %GC Tm = 67.9 °C GC+AT Tm = 120.0°C

10. Oligonucleótido: 5'-
ACGTATCGATCGAGCGCCCGGTATAGCGCTATGATATCAT-3'
Primer 1: 40 bases
Composición: 10 A; 10 C; 10 G; 10 T.
Porcentaje: 25% A; 25% C; 25% G; 25% T.
Peso molecular =12.35 kDa
Thermo Tm = 79.8 °C %GC Tm = 67.9 °C GC+AT Tm = 120.0°C
C. Influencia de la longitud de la secuencia de nucleótidos
Oligo: 5'-CGCGCGCAGT-3'
Primer1: 10 bases
Composition 1 A; 4 C; 4 G; 1 T; 0 OTHER
Percentage: 10% A; 40% C; 40% G; 10% T; 0%OTHER
MW=3.09 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0%
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 46.0 °C %GC Tm = 42.7 °C GC+AT Tm = 36.0 °C
Oligo: 5'-
CGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGC
GCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGT
-3'
Primer1: 110 bases
Composition 11 A; 44 C; 44 G; 11 T; 0 OTHER
Percentage: 10% A; 40% C; 40% G; 10% T; 0%OTHER
MW=33.98 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0%
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 112.9°C %GC Tm = 88.2 °C GC+AT Tm = 396.0°C
Oligo: 5'-
CGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGTCGCGCGCAGT-3'
Primer1: 50 bases
Composition 5 A; 20 C; 20 G; 5 T; 0 OTHER
Percentage: 10% A; 40% C; 40% G; 10% T; 0%OTHER
MW=15.44 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0%
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 104.0°C %GC Tm = 82.7 °C GC+AT Tm = 180.0°C

11. DISCUSION.
En nuestros resultados la concentración de dna se obtuvo mediante la formula de
concentración y también najo la proporción señalada, mediante estos dos
procedimientos las concentraciones salían diferentes y se optó por utilizar los
valores calculados mediante formula, aunque el otro método es muy exacto por
seguir la ley de Beer-Lambert-Bouguer, contando con una proporcionalidad a
medida que aumenta la absorbancia leida a 260nm este no nos servirá ya que te
arroja valores de concentración únicamente de DNA nativo, esto quiere decir que
si lo ocupamos estamos diciendo que en nuestros microtubos había
exclusivamente DNA de doble cadena, afirmación que es incorrecta.
Nuestros resultados de concentración fueron de 697.644 µg/mL aunque fue la
concentración mas alta de la sección como se muestra en la tabla 2 sigue siendo
una concentración baja, lo mas probable es que esto es debido a las perdidas
acumuladas en cada uno de los pasos. En cuanto a la determinación de pureza
se debe poner especial énfasis en la grafica del espectro de absorción del DNA en
las longitudes de onda 230, 260 y 280, si en nuestro caso se presentara un pico
de absorbancia a 230 esto muestra contaminaciones de proteínas ya que es un
pico característico para los enlaces peptídicos, entonces al momento del
aislamiento, quedaron proteínas, si el caso es un pico en 260 esto es
característico del DNA, es la longitud de onda que absorben mas las bases
nitrogenadas, en 280 es característico de grupos fenilo, anillos aromáticos, esto
mostraría contaminación de fenol que quedo al momento de la extracción, pero
como muestra nuestra figura 1 se obtuvo un buen espectro de absorción con pico
a 260. Entonces para justificar nuestra poca concentración al analizar el
procedimiento al momento de suspender en 500 µL de TE pH 7.8 esto se realiza
para lavar células y cumplir función de buffer, la adicion de RNAsa agitando y la
incubación a 27°C fue para deshacernos del RNA en la muestra, el adicionar 50µL
de lisozima es para romper la pared celular, la adicion de SDS es para solubilizar y
actuar sobre las enzimas al ser agente quelante para el Mg++, el agregar TE a
menor concentración y NaCl 5M se realiza parasolubilizar DNA en agua y a esa
concentración de NacLse asemeja a la fisiológica, esto para afectar el punto
isoeléctrico de proteínas y no precipiten, posteriormente se agrego fenol saturado,

12. este afecta a la estructura de las proteínas, desdoblándolas e interactuando con la
parte no polar de ellas, de esta manera atrapándolas y encapsulándolas al ser
inmiscible en agua, se centrifuga para separar las dos fases acuosa y organica
pero se forma una interfase de proteínas atrapadas, porsterior a esto se extrae la
fase acuosa donde se encuenra el DNA, se deposita en otro tubo, después se
agregó una mezcla cloroformo-alcohol isoamílico que se encarga de eliminar
trazas de fenol al mezclarlo, se centrifugo nuevamente y se extrajo la fase superior
a la que se le adiciono alcohol absoluto el cual precipito al DNA, se mezclo y
centrifugo, posteriormente se adiciono etanol al 70% el cual arrastrara los iones
que queden y precipita al DNA, después se resuspendio con agua destilada
esterilpara tomar las lecturas de Absorbancia, por lo tanto en el momento de las
extracciones es donde se tuvo la perdida del DNA.
En los ejercicios de DNAMAN podemos observar la influencia de GC que
interviene mucho en la Tm, ya que la afecta, de manera en que se tendrá una
mayor temperatura de fusión; esto se explica gracias a que en el apareamiento de
las bases de ambas cadenas de DNA la Guanina y Citosina ya que forma cada
uno tres puentes de hidrogeno, aumentando la estabilidad en la unión de la
molecula. En el segundo ejercicio se observa que no importa la secuencia de
las bases, siempre y cuando se mantenga la misma proporción de G/C con T/A en
dicho oligonucleótido ya que la Tm esta relacionado con el porcentaje de
frecuencia de dichas bases, en el ejercicio podemos ver que mientras la
proporción de las bases sea la misma de igual manera será la Tm constante. En
el tercer ejercicio se realizaron diferentes cadenas de oligonucleótidos, desde
diferente secuencia hasta diferente número de bases; desde 10,50 y 110, pero
siempre con la misma proporción de G/C. En los anteriores ejercicios se observa
que la Tm está en función a la cantidad de G/C, más no en la secuencia como tal;
así que se hicieron aleatoriamente, en el oligonucleótido de 50 bases la Tm vario
incrementándose proporcionalmente al aumento de la cantidad de bases del
oligonucleótido, debido al aumento de enlaces por romper y del tiempo que se
llevara a cabo este proceso.
CONCLUSIONES
 Se logro aislar DNA Cromosómico de alto peso molecular a partir de un
cultivo bacteriano.
 Se obtuvo el espectro de absorción del DNA aislado.

13.  La concentración y pureza del DNA aislado no fueron los optimos.
 Se determino la influencia de Algunas Características de la secuencia del
DNA sobre su desnaturalización empleando el programa bioinformático
DNA-MAN.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín
Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín vol.59 no.2 Medellín July/Dec. 2006 disponible en
línea:
 [http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0304-
28472006000200007] fecha de consulta: 20/feb/2018
 Iván Arenas Sosa, José Luis López Sánchez ,2004, Espectrofotometría de
absorción. Instituto de Biotecnología Universidad Nacional Autónoma de
México, Cuernavaca, Mor. P.p 32 disponible en línea:
[http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrometria_de_absorci
on.pdf] fecha de consulta: 20/feb/2018
 http://smcg.ccg.unam.mx/enp-unam/01-IntrodYEvolucion/structfuncDNA.pdf