Western blott

Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
WESTERN BLOT

Alumnos:
Arias Orozco Patricia E.
Rosario Amaris Guevara García
Jessica Wendolyn García Pérez
Acosta Dent Andrea
Ortiz Robles Cintia
Moreno Rodríguez Eduardo

Grupo:
4BM3

Asignatura:
Laboratorio de Biotecnología Molecular

Profesora:
Dra. Paola Berenice Zarate Segura.

Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.1

PRÁCTICA NO. 11
Western Blot
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo General
 Conocerá y realizará la técnica de western blot para detección de proteína mediante la
reacción antígeno-anticuerpo.

1.2 Objetivos específicos

 Conocer la metodología para realizar electroforesis en gel de poliacrilamida.
 Aprender la metodología para realizar una transferencia a membrana de nitrocelulosa.
 Aplicar la técnica de western blot para detectar proteínas (IgG humana).

2. INTRODUCCIÓN

2.1 Fundamento Western Blot

El western blot es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas basada en
la capacidad de unión a anticuerpos específicos. Luego de separar las proteínas en un gel
de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), las bandas de proteínas se transfieren a una membrana
de nitrocelulosa (electrotransferencia), las bandas individuales de proteína (proteína de
interés) se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o
monoclonal radiomarcado o unido a enzimas específicas para la proteína de interés.

Los complejos Ag-AB que se forman en la banda que contiene la proteína reconocida por
el anticuerpo pueden visualizarse de diversos modos. Si un anticuerpo radioactivo se unió
a la proteína de interés, es posible determinar su posición en la mancha (blot) exponiendo
una placa de rayos x a la membrana, un procedimiento que se conoce como
autorradiografía. Sin embargo, en los procedimientos de detección que más se usan suelen
emplearse anticuerpos unidos a enzima. Tras la unión del conjugado de enzima y
anticuerpo, la adición de un sustrato cromógeno que produce un producto de color
intenso y soluble origina la aparición de una banda de color en el sitio del antígeno blanco.

La técnica también puede identificar un anticuerpo específico en una mezcla. En este caso
los antígenos conocidos de peso molecular bien definido se separan mediante SDS-PAGE y
se transfieren a nitrocelulosa. Las bandas separadas de antígenos conocidos se prueban
luego con la muestra que se sospecha contiene anticuerpo específico para uno o más
antígenos. La reacción de un anticuerpo con una banda se detecta mediante el empleo de
un anticuerpo secundario radio marcado o ligado a enzima específica para la especia de
los anticuerpos en la muestra de estudio (figura 1.).



Figura 1. Mecanismo de acción molecular western blot

2.2 Purificación de proteína

Se debe tener en cuenta que nuestras proteínas de interés se encuentran en solución
acuosa de baja salinidad. Al incrementar la concentración de sales en la solución,
incorporando lentamente sulfato de amonio, (entre 20-95% de saturación), la proteína
comienza a tener intercambios iónicos con los iones de amonio y sulfato, sustituye los
sitios de intercambio que compartía con el agua y pasado un tiempo de esta manera, la
proteína disminuye su solubilidad y “precipita”.
Por lo general las moléculas de mayor peso molecular se precipitan primero. Esta nueva
solución se centrifuga y el precipitado que contiene las proteínas se recupera.
El éxito de la precipitación depende del tiempo de contacto y de la concentración de la
solución.

2.3 Diálisis

Consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de
materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de
la presión osmótica, es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes


por una membrana semipermeable (una membrana que permite el paso selectivo de las
moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular).
De esta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas.
Es necesario realizar este paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la
diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos
aleatorios de las moléculas individuales.

2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

La electroforesis es el fenómeno por el cual una molécula que posee carga neta se
desplaza en respuesta a la aplicación de un campo eléctrico. La velocidad de migración o
movilidad a través del campo eléctrico dependerá de varios factores como son: la
intensidad de dicho campo; la carga neta, tamaño y forma de las moléculas; así como la
fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el cual las moléculas se están
moviendo. La electroforesis es una herramienta analítica simple, rápida y muy sensible, lo
que la convierte en una técnica de gran utilidad para la separación y el estudio de
moléculas cargadas tales como proteínas y ácidos nucleicos.

Para la electroforesis de proteínas se utilizan los geles de poliacrilamida debido a su buena
resolución y gran versatilidad. Además, poseen una serie de ventajas tales como: ser
químicamente inertes, estables en un amplio rango de pH, temperatura, fuerza iónica y
fácil de generar mediante la polimerización de acrilamida.


El gel se prepara a partir del monómero de acrilamida (figura 2) que forma largas cadenas
lineales, con abundantes grupos polares que las hace solubles en medios acuosos.

Figura 2. Estructura de la acrilamida, bisacrilamida y poliacrilamida

La polimerización de la acrilamida se obtiene por la adición de catalizadores de la
polimerización que inician y aceleran el proceso de formación de un gel tridimensional.
Normalmente, el proceso se inicia con la adición de persulfato amónico a una disolución
acuosa (tampón) de ambos monómeros (acrilamida + bisacrilamida), seguido de la adición
de TEMED (N,N,N’,N’-tetrametilendiamina) que actúa como propagador de la reacción de
polimerización a pH básico (el pH ácido retarda la polimerización)(figura 3). Por lo tanto,
ajustando las concentraciones de persulfato y TEMED puede controlarse la velocidad de
polimerización

Figura 3. Reacción de polimerización de la acrilamida

El tamaño de poro de los geles de poliacrilamida viene determinado por la concentración
total de monómeros. La concentración de acrilamida (% T) representa el porcentaje en
peso del monómero total empleado (acrilamida + bisacrilamida; % p/v) y determina la
longitud promedio de la cadena del polímero. La concentración de bis-acrilamida (% C)


representa el porcentaje de este monómero en el gel y determina el grado de
entrecruzamiento. Por lo tanto incrementando %T el tamaño de poro decrece (los geles
con %T inferiores a 2.5-3.0% son casi líquidos y los geles con un %T del 30% presentan un
reticulado tan denso que moléculas tan pequeñas como 2000-3000 Da difícilmente
pueden atravesarlos).

Tabla 1. Relación del %T con los kDa de proteína.
Concentración de acrilamida kDA
(%T)
3-5 >100
5-12 20-150
10-15 10-80
>15 <15

La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en
condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE). En el caso del SDS- las
proteínas se solubilizan en un detergente (SDS), desnaturalizándolas y cargándolas con
carga negativa a lo largo de la cadena polipetídica (una molécula de SDS por cada dos
residuos de aminoácidos) (figura 4). Debido a que la cantidad de SDS que se une a las
proteínas es prácticamente proporcional a su tamaño, los complejos SDS-proteínas
presentan un valor carga/masa constante y por lo tanto se separan de acuerdo a su
tamaño cuando migran desde el cátodo al ánodo a una velocidad relacionada con su peso
molecular. Además del SDS, se emplean otros agentes desnaturalizantes como son un
agente reductor, generalmente el 2-mercaptoetanol que reduce los puentes disulfuro (Cys-
S-S-Cys) a grupos tioles (Cys-SH).

Figura 4. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida. El tratamiento de las muestras con agentes
desnaturalizantes provoca la desnaturalización de las proteínas, pérdida de la estructura secundaria y la disociación de las
subunidades. Las proteínas quedan cargadas negativamente y migran del polo negativo al positivo durante la
electroforesis.


En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de proteínas
debido a:
La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS.
Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo tanto,
en el mismo sentido.
Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración
también lo es y las electroforesis son muy rápidas.
La separación depende de un parámetro físico-químico, como es la masa
molecular, que se puede calcular.
Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente.

En esta práctica la electroforesis de proteínas se basa en un sistema discontinuo el cual se
tiene un gel concentrador y un gel separador, la diferencia entre estos dos es el pH y la
concentración de acrilamida. El fundamento de esta técnica es la siguiente: La movilidad de
una proteína en el gel concentrador es intermedia entre la movilidad de los iones cloruro
Cl- del gel y la movilidad del ión glicina Gly- del buffer. Por lo tanto, entre ambos frentes
existe una zona de baja conductividad y gran diferencia de voltaje, de forma que las
proteínas se concentran en una zona muy reducida entre ambos iones. Una vez en el gel
separador, el pH básico favorece la ionización de la glicina de forma que sus iones migran
a través de los polipéptidos concentrados, justo por detrás de los iones cloruro. A partir de
este momento las proteínas migran a través del gel separador en una zona de voltaje y pH
uniforme de forma que se separan en base a su tamaño (figura 5).

Figura 5. Sistema discontinuo en gel de poliacrilamida

2.5 IgG
La inmunoglobulina G (IgG) es una de las cinco clases de anticuerpos humorales
producidos por el organismo. Es la inmunoglobulina más abundante de suero (600-1.800


mg por 100 mL), constituye alrededor del 80% del total de las
inmunoglobulinas séricas. Es la inmunoglobulina más pequeña, con
un peso molecular de 150.000 Da así puede pasar fácilmente del
sistema circulatorio del cuerpo a los tejidos. La síntesis de IgG se
controla principalmente por el estímulo de los antígenos, al aparecer
una infección .Esta proteína especializada es sintetizada por el
organismo en respuesta a la invasión de bacterias, hongos y virus.
Existen 4 subclases de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).

 IgG1, IgG3, IgG4 cruzan con facilidad la placenta y tienen un papel importante en la
protección del feto en desarrollo
 IgG3 es el activador del complemento más eficaz, seguida por IgG1; IgG2 es menos
eficiente y la IgG1 no activa complemento en lo absoluto.
 IgG1 e IgG3 se unen con gran afinidad a receptores en células fagocíticas, por
consiguiente media las opsonización.

2.6 Sangre

Las sustancias que se forman en el organismo deben ser transportadas de un lugar a otro.
Desde y hacia las células corporales. La homeostasis del ambiente interno depende de ello.

El principal medio de transporte es un líquido llamado sangre; el sistema transportador es
el sistema cardiovascular. Y el sistema complementario de transporte es el sistema
linfático.

La sangre no sólo está constituida por líquido, sino también por millones de células. La
parte líquida es el plasma (uno de los tres compartimiento líquidos del organismo), y las
células son los elementos figurados de la sangre.

La sangre tiene una temperatura de 38ºC, un pH entre 7,35 y 7,45, y corresponde al 8 %
del peso corporal.

Las funciones de la sangre son:
1. Transporte: Capta las sustancias alimenticias y el oxígeno en los sistemas
digestivo y respiratorio, y los libera en las células de todo el cuerpo. Transporta el
CO2 de3sde las células hasta los pulmones para ser eliminado. Recoge los desechos
de las células y los deja en los órganos excretorios. Capta hormonas y las lleva a sus
órganos blancos. Transporta enzimas, amortiguadores y otras sustancias
bioquímicas.


2. Regulación: del pH mediante las sustancias amortiguadoras. Además regula la
temperatura corporal, ya que puede absorber grandes cantidades de calor sin que
aumente mucho su temperatura, y luego transferir eses calor absorbido desde el
interior del cuerpo hacia su superficie, en donde se disipa fácilmente. Mediante la
presión osmótica, regula el contenido de agua de las células, por interacción de los
iones y proteínas disueltos.
3. Protección: mediante la coagulación se evita la pérdida excesiva de sangre.
Mediante la fagocitosis y la producción de anticuerpos protege contra las
enfermedades.

Parte corpuscular

Glóbulos Rojos: (Eritrocitos o hematíes) Tienen como función transportar el oxígeno a los
tejidos eliminando el Anhídrido Carbónico. Proceden a la regulación del equilibrio acido /
base de la sangre. Están compuestos por el 65% de agua y el 35 % de sustancias sólidas
(95% de hemoglobinas y 5% de lípidos).

Poseen en su superficie el antígeno que determina el grupo sanguíneo llamado
aglutinina. Un mm cúbico de sangre contiene un número de glóbulos rojos que va de 4.2
a 6 millones.

Glóbulos Blancos: (Leucocitos) Tienen la función de defensa del organismo. Algunos
sirven para destruir las sustancias extrañas al organismo; otros sirven a la creación de
anticuerpos.
Se dividen en Granulocitos, Linfocitos y Monocitos.

Los valores normales van de 4.000 a 10.000 por mm cúbico de sangre.

Plaquetas: Son los elementos más pequeños de la sangre. En un mm cúbico hay cerca de
300.000 plaquetas. Tienen una vida muy corta, de 3 a 5 días y su función es importante en
la coagulación de la sangre.

Parte líquida

Plasma: Representa el componente líquido de la sangre gracias a la cual las células
sanguinas pueden circular. El plasma está formado principalmente por agua (90%) en la
cual se encuentran disueltas y circulan muchas sustancias como proteínas, azúcar, grasas,
sales minerales, hormonas, vitaminas, anticuerpos y factores de la coagulación.

Entre las sustancias más importantes que transporta el plasma se encuentran las
siguientes:


 La Albúmina: Es una proteína que ayuda a mantener el agua del plasma en una proporción
equilibrada.
 Las Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente
a las infecciones. Su disminución acarreará una bajada de defensas.
 Factores de Coagulación: Son imprescindibles para evitar las hemorragias. La ausencia de
algún factor de coagulación puede ocasionar trastornos hemorrágicos ya que se dificulta la
formación del coágulo.
 Otras proteínas transportan sustancias necesarias para el normal funcionamiento de las
células (grasas, azúcares, minerales, etc.).

El plasma se utiliza para elaborar concentrados específicos de proteínas, que constituyen el
tratamiento de varias enfermedades como la hemofilia y otros defectos de la coagulación,
inmunodeficiencias con riesgo de padecer múltiples infecciones graves, la trombosis y otras.

Plasma
Es un líquido acuoso, formado por:

91,5 % de agua
8,5 % de solutos 7 % son albúmina 54%
proteínas globulinas 38%
fibrinógeno 7 %
otras 1 %
1,5 % son otros electrolitos
componentes nutrientes
gases
enzimas,
hormonas,
amortiguadores
vitaminas
productos de desecho



3. DESARROLLO EXPERIMENTAL

Salting In

Incubamos 10 min la
Se realizó extracción muestra hasta la
Centrifugamos 10 min
de sangre aparición del coágulo,
este se retiró

Agitar granitos de sal
Recuperamos
hasta observar
sobrenadante (suero)
precipitación

Diálisis

cada dos horas se tenia
Estas bolsas se dejaron
que cambiar el agua
Las muestras se colocaron sumergidas en agua
destilada con cuidado de
en bolsitas de dialisis destilada con agitacion
no dejar las muestras por
constante
mucho tiempo sin agua

Despues de
Recuperar las muestras en
aproximadamente 8 horas,
tubos Eppendorf
se detuvo el proceso



Electroforesis

Gel separador 10mL Gel concentrador 5mL
Se preparó en tubos Solución de Solución de acrilamida
falcon la solución para acrilamida 3.3mL 0.65mL
el gel concentrador y Amortiguador pH Amortiguador pH 6.8
gel separador 8.8 2.5mL 1.25mL
H20 4.16mL H20 3.05mL

A cada solución se le agrego el
persulfato de amonio y TEMED
para la preparación del gel y se
montaron las placas donde se
vertió la solución preparada de
acrilamida y se espero a que
polimerizara.

Una vez preparados los
geles, estos se meten en la
cámara de electroforesis, se
conecta y se deja correr
durante 1h aprox

Western blot
Transferencia
En esta práctica se realizó una transferencia por peso (en vez de aplicar corriente
simplemente al sistema de la figura 7 se le aplicaron libros en la parte de arriba), pero
generalmente se realiza una electrotransferencia el cual se montaría de la siguiente
manera:



Figura 6. Electrotransferencia, en la práctica en vez de aplicar el ánodo y cátodo simplemente se aplicaron
libros en la parte superior y de esta manera se llevó a cabo una transferencia por peso.

Bloqueo de membrana


Unión a anticuerpo y revelado

Se incubó la memebrana
Retiramso solución de
con el conjugado de
bloqueo y se hicieron 3
anticuerpo -peroxidasa Lavar con PBS 3 veces
lavados con PBS
1h a temperatura
(agitación continua)
ambiente

Se incubó la membrana
en la solución de
Se enjuaga la membrana
cromógeno/sustrato
H2O MQ y dejar secar
hasta que aparecieran
las bandas

3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La cantidad de proteínas presentes en el suero de
sangre humana son muchas y variadas las
M 1 2 3 4 5 proteínas que se pueden encontrar en el suero
humano son las siguientes con su correspondiente
peso molecular.

MOLECULA % en el
PESO (Da)
suero
IgA 170000-720000
IgM 5 al 10% 950000
IgG 150000
IgE 190000
IgD 185000
Fibrógeno 340000
Albumina 69000

Como se observa la IgG es la proteína con menor peso molecular, el peso de las IgG según
el marcador de peso molecular corresponde a las señaladas por las flecha roja en la
imagen superior, por lo que podemos decir que si obtuvimos una buena cantidad de IgG y
otras proteínas , sin embargo considerando la gran cantidad de proteínas y que son de


peso molecular más altos estos debieron haber formado varias bandas a lo largo del gel
las, más de las que se observan, por lo que se puede decir que quedaron aglomeradas en
la parte superior del gel, provocando incluso como se observa en el carril 5 una
aglomeración muy grande, esto ocurrió ya que falto tiempo de corrimiento del gel. Otro
aspecto importante es que se cargaron 10чL de muestra lo cual por la cantidad de
proteína que se aglomerada podemos decir que fue mucha muestra y pudimos haber
cargado solamente unos 5чL de muestra de esta manera también hubiéramos podido
observar menos aglomeración, bandas más nítidas y precisas. Para poder saber con certeza
que cantidad de muestra cargar se debe hacer primero una cuantificación de proteínas,
para esto se pueden aplicar el método de Bradford, Lowry, ABS a 280nm y muchos otros
más que también ya vienen en kits.

Una vez corrido el gel este se transfirió a una membrana de nitrocelulosa por peso, lo que
esperábamos era que las proteínas corridas en el gel junto al marcador se transfirieran a la
membrana, estas al quedar en la superficie tendrán más contacto con el conjugado, se
añade el conjugado Ac-Enzima y luego el substrato/cromógeno el cual nos daría el
revelado de las bandas individuales de IgG.

Para identificar a IgG se utilizó el conjugado
proteína A PEROXIDASA [P-8651 SIGMA]
obtenida de Staphylococcus aureus, la cual se
utiliza en aplicaciones para Elisa directo, usando
IgG humana, la especificidad de los enlaces es
IgG solo de mamíferos, excepto rata, cabra y
oveja.

Se observa en la imagen de la de la membrana
que si hubo transferencia ya que el marcador se
ve a simple vista aunque al revelar no se notó
nada, esto pudo haber sido por los reactivos (tal
vez ya no servían) o por la leche, pero al teñir
con rojo de ponceau si se notaron las bandas
donde hubo unión a IgG ya que las bandas se
veían definidas (tenues), todas a la misma altura.
Esto nos confirma que si hubo transferencia,
bloqueo de la membrana ya que no hubo
uniones inespecíficas (no se observaron otras bandas) y que si se realizó la unión
Ag-Ac.

Preguntas de la Discusión

¿Qué es y para que se utilizó el Rojo de Ponceau?


Conocido también como Ácido Carmínico, se utiliza mezclado con ácido acético (0.1% Rojo
Ponceau, 5% ácido acético) para visualizar proteínas sobre membranas de nitrocelulosa. Es
un colorante muy usado, ya que luego puede decolorarse con facilidad con ácido
acético y metanol, y las proteínas pueden ser visualizas posteriormente con un anticuerpo
(Western blot). Aunque tiene menor sensibilidad de detección
que otros colorantes permanentes como el Azul de
Comassie o la plata, es un método que permite una detección
rápida.

Desventajas

 Débil unión al soporte, de baja sensibilidad total de la
banda de proteínas
 Límite de detección: 250ng
 Bajo contrate, bandas rojas difíciles de fotografiar
 Tiempo de tinción aproximadamente 5 minutos
 Las bandas tienden a desaparecer después de unas horas.

¿Cómo reacciona el 4-cloro, 1-naftol?

En presencia de HRP y de peróxido de hidrógeno el cloronaftol reacciona forman un
precipitado azul-negro. La reacción es fácilmente controlable, aunque es relativamente
insensible y difícil de fotografiar.

¿Por qué utlizar membranas de nitrocelulosa y cual es el tamaño del poro?

Membrana de nitrocelulosa pura contiene la mayor capacidad de enlace posible.
Compatibles con diversos procedimientos de detección, como procedimientos isotópicos y
colorimétricos o quimioluminiscentes o fluorescencia. La membrana no requiere estar
impregnada con metanol y por lo tanto es selectiva para proteínas hidrófilas. Antes de la
transferencia, la membrana se humedece con agua y luego con el buffer de transferencia.

Tamaño de poro de 0,2 μm que garantiza una elevada retención de proteínas
pequeñas de peso inferior a 20 kD, reduciendo el paso de la muestra sin enlace.

¿Por qué utilizamos Proteína-A Peroxidasa P-8651 SIGMA?

La proteína A es un polipéptido de 42000 Daltons constituyente habitual de la pared
celular de Staphilococcus aureus. Se ha estudiado con gran detalle la interacción entre la
proteína A y los anticuerpos: la proteína A tiene cuatro potenciales lugares de unión a los
anticuerpos, sin embargo sólo se puede usar uno a la vez. Sin embargo la proteína A es
claramente bifuncional permitiendo la formación de complejos multiméricos. En las
moléculas de anticuerpo la región de unión a la proteína A se encuentra en las regiones
constantes segunda y tercera de la cadena pesada. Por ello, cualquier anticuerpo tiene al


menos dos lugares de unión a la proteína A, y esto es una organización ideal para la
formación de complejos multiméricos.

La afinidad de la proteína A depende de las regiones Fc del anticuerpo, dependientes de la
subclase. La proteína A tiene alta afinidad por los anticuerpos humanos, de burro, conejo,
perro, cerdo y cobaya, menor afinidad pero aún útil por ratón, vaca o caballo, y es baja y
por ello poco útil para detectar anticuerpos de oveja, cabra, rata o gallina. En este último
caso se suele emplear un anticuerpo puente de una especie por la que tenga alta afinidad.

Hay tres propiedades de la proteína A que la hacen muy útil en los estudios
inmunocitoquímicos:

1. Debido a que la región de unión con el anticuerpo reside en la región Fc, la unión a
proteína A no cambia la capacidad del anticuerpo de unirse a su antígeno.
2. Incluso una proteína A desnaturalizada renaturaliza fácil y rápidamente
recuperando su capacidad de unión.
3. Aunque la afinidad de la proteína A por el anticuerpo es elevada la unión antígeno-
anticuerpo se puede romper con facilidad reduciendo el pH.

La proteína A se ha empleado en gran cantidad de métodos inmunoquímicos, acoplada a
isótopos radiactivos (detección en Western blot), a marcadores fluorescentes, oro coloidal,
etc..., unida a resinas en la confección de lechos cromatográficos para la purificación de
anticuerpos.

En la actualidad la proteína A se purifica tanto de fuentes naturales (S. aureus) como a
partir de sistemas de sobreexpresión de proteínas recombinantes.

Fuente: Staphylococcus aureus
Propiedades:
Forma: Polvo liofilizado
Aplicaciones: Elisa directo, usando IgG humana
Temperatura de almacenamiento: -20 °C
Especificidad: Enlaces a IgG solo de mamíferos, excepto rata, cabra y oveja.
Forma Física: Polvo liofilizado incluido con citrato de sodio como buffer. Proteína
determinada por absorbancia a 205 nm.
Seguridad: Uso de gafas, guantes y filtro respirador

¿Cuál es la función de B MERCAPTOETANOL?

Se utiliza en la electroforesis SDS-PAGE, se trata de un tipo de electroforesis
desnaturalizante en la que las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de


agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS
que desnaturaliza y recubre a la proteína), y se separan como cadenas polipeptídicas
aisladas.
Algunas proteínas pueden ser desnaturalizadas por 2-mercaptoetanol por medio de su
habilidad para separar puentes disulfuro:
cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH → 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH

Por medio de la ruptura de los puentes S-S, la estructura terciaria así como la estructura
cuaternaria de algunas proteínas se pueden ver disruptas. Si una proteína consta de varias
cadenas polipeptídicas distintas unidas mediante puentes disulfuro, la acción del 2-
mercaptoetanol separará las cadenas polipeptídicas distintas. Por ello, el 2-mercaptoetanol
se emplea profusamente para analizar el estado de oligomerización de las proteínas.
El 2-mercaptoetanol se puede reemplazar por ditiotreitol (DTT) o el menos oloroso tris(2-
carboxietil)fosfina (TCEP) en aplicaciones biológicas.

4 CONCLUSIONES

 Para la purificación de las proteínas del suero obtenido primero se hizo la
precipitación por el método de salting in, luego una separación de las
proteínas de la sal añadida por medio de una diálisis el cual es un proceso
molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de
las moléculas individuales
 Se llevó a cabo una electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida
en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE).
 La cantidad de muestra que se agrega a los pozos debe ser de acuerdo a la
cantidad de proteínas que tenemos de muestra, en este caso se cargaron
10чL los cuales al correr el gel podemos decir que fue demasiado y con 5чL
hubiera bastado. Aunque es recomendable hacer una previa cuantificación
de proteína.
 La transferencia del gel a la membrana de nitrocelulosa fue por peso, la
banda del marcador fue visible desde un principio lo que nos decía que si
hubo transferencia. Al revelar con el sustrato/cromógeno no se identificaron


bandas (pudieron haber sido los reactivos), pero al teñir con rojo de
ponceau si obtuvimos bandas individuales correspondientes a IgG

5 BIBLIOGRAFÍA Y REFERENCIAS

Kindt, J. Thomas, Goldsby, A. Richard, Inmunología de Kuby, 6ta. Edición, Editorial McGraw
Hill, México 2007, páginas 551.

Berg Jeremy Mark, BIOQUIMICA, Edit. Reverte, Primera Edición, España 2008, Págs.
consultadas: 68 -78.

Tobin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide
gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA
1979;76(9):4350-4354.

http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electroforesis.pdf
http://www.westernblotting.org/

6. ANEXO (DISCUSIÓN DEL ARTÍCULO)

Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:
Procedure and some applications

 La técnica de electroforesis produce réplicas de las proteínas separadas en geles de
poliacrilamida con una alta fidelidad.
 En términos generales, las membranas de nitrocelulosa se han utiliza para retener
las proteínas de la solución diluida para su posterior determinación cuantitativa.
 Se demostró que las proteínas inmovilizadas en membranas de nitrocelulosa
se pueden utilizar para detectar lo respectivos anticuerpos.
 Con anticuerpos marcados radiactivamente o conjugado con peroxidasa-
el método es suficientemente sensible para detectar pequeñas cantidades de
antígeno separados por electroforesis, y este simple procedimiento también se
puede utilizar para mostrar el resultado de la presencia de pequeñas cantidades de
de anticuerpos en un suero de título bajo.
 Debido a que el antígeno se inmoviliza en una membrana, el anticuerpo no es
necesario para formar un precipitado con el antígeno. La técnica por lo tanto tiene
el potencial para el análisis de las proteínas inmunoelectroforético mediante el uso
de unión de fragmentos Fab o unión de los anticuerpos contra un factor
determinante, como los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas.
Esto no se podía hacer por las técnicas inmunoelectroforéticas.


 El procedimiento descrito también tiene potencial como una herramienta para
detección sueros patológicos que contienen autoanticuerpos
 La identificación precisa de los componentes inmunogénicos puede ser una
herramienta de diagnóstico útil para diversas condiciones patológicas.
 Otra ventaja de la inmovilización de proteínas de nitrocelulosa es la facilidad de
procesamiento para la autorradiografía.
 Técnicas convencionales, decoloración y secado de geles de poliacrilamida
toma muchas horas, y las condiciones exactas de secado son extremadamente
crítica. Cuando las proteínas son transferidos a un soporte de nitrocelulosa, la
electroforesis toma una hora, las manchas y decoloración menos de 10 minutos, y
el secado de un adicional de 5 min. Así pues, esto es a la vez más rápido y más
simple que los procedimientos convencionales, y lo elimina el procedimiento
tedioso y peligroso de remojar los geles en diphenyloxazol.
 La técnica ha sido desarrollada para detectar anticuerpos específicos contra las
proteínas ribosomales. Sin embargo, es aplicable a cualquier procedimiento
analítico en función de la formación de ligando proteínas-complejos.
 Interacciones que posiblemente se puede analizar de esta forma incluyen a
hormonas
receptor, el receptor de AMP cíclico, proteína e interacciones de ácido nucleico.
 El ligando también puede ser una proteína. Las enzimas separadas en geles de
poliacrilamida también podría ser convenientemente localizadas en transferencias
mediante ensayos in situ.
 Un requisito indispensable para estas aplicaciones es que la proteína no es dañada
por la adsorción proceso y que los sitios de unión siendo accesibles al ligandos y
sustratos.



Chiron RIBA HCV 3.0 SIA
Prueba para Hepatitis C
1. Introducción

El HCV es un virus de RNA de simple cadena positiva, de unos 9,500 nucleótidos,
que nunca pasa en su ciclo celular por fase de DNA. Se le considera el único
representando del género Hepacivirus, perteneciente a la familia de los Flaviviridae.
Es un virus con envoltura glucolipídica. Su genoma contiene una única pauta de
lectura abierta (ORF) que codifica para una poliproteína precursora flaqueada pro
dos regiones no codificantes en ambos extremos 5’ y 3’.

CARACTERISTICAS DEL GENOMA
El genoma del VHC está compuesto por una única cadena lineal de ARN de polaridad
positiva, no segmentado. Consiste en:
 una región 5' UT o NCR (región no codificadora) de aproximadamente 340
nucleótidos
 una región codificadora de proteína, de 9400 nucleótidos, que codifica
presumiblemente un precursor polipeptídico de aproximadamente 3000
aminoácidos
 una pequeña región 3'UT (región no codificadora) de aproximadamente 50
nucleótidos.

Este genoma de ARN tiene una alta tasa de sustitución de bases (2x10-3) por año. Esto
resulta en una gran diversidad genética entre las diferentes cepas y dentro de la misma
cepa, a lo largo del tiempo, pudiendo agrupar a los VHC en tipos. Hasta el momento han
sido identificados cerca de 10 variantes, diagnosticadas con test inmunoenzimáticos y por
técnicas de biología molecular (reacción en cadena de la polimerasa -PCR).

CARACTERISTICAS DE LAS PROTEINAS VIRALES

Las poliproteínas codificadas de aproximadamente 3000 aminoácidos son en 7 proteínas:
 Una proteína de la nucleocápside de 190 aminoácidos;
 Dos proteínas de la envoltura de 190 y 370 aminoácidos, respectivamente.
Las 4 proteínas restantes son proteínas no estructurales:
 Una proteína llamada NS2 de 250 aminoácidos con función de unión a membrana
 La proteína NS3 de 500aa con funciones de proteasa-helicasa
 La proteína NS4 de 460aa con función de unión a membrana
 La proteína NS5 de 1050aa con probable función de polimerasa

Se han identificado regiones hipervariables en todos los genes que codifican proteínas
virales, pero los más variables son los que codifican para las proteínas de la envoltura.



Figura 7. Debido a la estructura viral, el virus es genéticamente inestable y muta
muy rápido. Esto quiere decir que se vuelve resistente a los agentes antivirales lo
cual hace su tratamiento más difícil.

Figura 8. Ciclo de replicación del virus dentro de la célula



Para el diagnóstico del virus se realizan dos tipos de pruebas se utilizan en el diagnóstico y
tratamiento de la infección por VHC: las pruebas serológicas que detectan
anticuerpo específico contra los virus de la hepatitis C (anti-VHC) y
pruebas moleculares para la detección de ácido nucleico viral.

Pruebas moleculares
Algunas de las técnicas moleculares más usadas se presentan en la siguiente tabla:

Pruebas serológicas:

Las pruebas que detectan anti-HCV se utilizan para detección y diagnóstico del virus. Se
puede detectar en el suero o plasma usando inmunoensayos. Para el diagnóstico de
Hepatitis C en un principio se evidenciaban la presencia de anticuerpos para tres antígenos
virales: C-100 (proteína codificada por región no estructural 3 y 4), C-22 (proteína
estructural del Core) y 33C (proteína no estructural de la región NS3). Hoy en día ya se
utilizan otros antígenos recombinantes y algunas de las siguientes pruebas:


Abbott HCV EIA 2.0:
Es un inmunoensayo que antígenos recombinantes (HC-34(E.Coli), HC-31 (E. Coli NS3
proteína no estructural y NS4) y c100-3 (levadura NS3/NS4 con SOD) que se adhieren a
los anticuerpos que se encuentran en las muestras infectadas.

ORTHO_HCV Version 3.0 ELISA

Se utilizan micropocillos que contienen antígenos recombinados del virus de la hepatitis.
La tecnología de Elisa utiliza el principio que los antígenos o anticuerpos que produce el
virus se pueden detectar por el antígeno o anticuerpo complementario que está ligado a
una enzima capaz de reaccionar con un substrato cromógeno. Los antígenos
recombinantes q se utilizan en esta prueba son c22-3, c200 y la NS5.

VITROS_ Anti-HCV assay

Es un inmunoensayo de diagnóstico in vitro para la detección cualitativa de anticuerpos de
inmunoglobulina G al virus de la hepatitis C (anti-VHC) en suero y plasma.

La especificidad de estos inmunoensayos es del 99%. Falsos positivos se dan generalmente
cuando las pruebas se hacen en poblaciones donde el virus se encuentra en menor


cantidad. Falsos negativos pueden ocurrir cuando hay enfermedades contra el sistema
inmune como el VIH, trasplante de órganos o en pacientes con hemodiálisis.

Para la confirmación de estos resultados con inmunoensayos se puede utilizar la “The
recombinant immunoblot assay, Chiron RIBA HCV 3.0 SIA” (utilizado en clase).

CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA
Ensayo en tira inmunoabsorbente (SIA) para la detección de anticuerpos frente al virus de
la hepatitis C (anti-HCV) en suero o plasma humano.

La detección de anti-HCV mediante la metodología del SIA se basa en las técnicas de
absorción Western y de puntos, en las que inmunógenos específicos (es decir,
poliproteínas antigénicas) codificados por el genoma del HCV son inmovilizados sobre una
membrana como soporte. La visualización de la reactividad de los anti-HCV de las
muestras con las proteínas individuales codificadas por el HCV se logra utilizando un
conjugado enzimático de anti-IgG humana de cabra, marcada con peróxidasa.

Los dos antígenos recombinantes (c33c y NS5) y dos de los péptidos sintéticos (c100p y 5-
1-1p) proceden de regiones putativas no estructurales del virus, mientras que el tercer
péptido (c22p) corresponde a la proteína putativa de la nucleocápside (núcleo) viral. Dado
que los antígenos recombinantes c33c y NS5 del HCV se producen como proteínas
individuales de fusión con superóxido dismutasa humana (SODh), también se ha incluido
SODh recombinante como banda de control en la tira. La banda de control SODh permite
la detección de anticuerpos frente a SODh que no son específicos para las porciones
codificadas de los antígenos recombinantes del HCV. El antígeno c33c del HCV se produce
en bacterias (E. Coli) genéticamente manipuladas, mientras que el antígeno NS5 y el SODh
del HCV se producen en levadura (S. Cerevisae) manipulada genéticamente. Esta
combinación de antígenos tiene mayor especificidad y sensibilidad de reconocimiento.

A)



B)

Figura 9. DEL KIT A) Genoma del HCV y proteínas recombinantes, B) Las regiones donde se ubican los
antígenos recombinantes y péptidos sintéticos a lo largo del genoma del virus.

Las bandas en las tiras están ordenadas de la siguiente manera:
Banda 2 contiene dos péptidos sintéticos 5-1-1(p) and c100 (p), para la región del NS4 del
genoma del virus.
Banda 3 contiene el antígeno recombinante c33-c de la región NS3 del virus.
Banda 4 contiene c22 (p) de la región del core del HCV.
Banda 5 contiene la región NS5 región del genoma del virus.

Figura 10. Tira que se utiliza para la prueba y el antígeno o péptido inmovilizado en cada banda



La prueba se basa en tres etapas en donde se utilizan los antígenos recombinantes y los
péptidos sintéticos inmovilizados como bandas individuales como se muestra en la figura
anterior.

• Incubación de las tiras con las muestras y controles: Los anticuerpo
específicos se fiajran en las bandas correpondientes de antígeno y/o
Primera peptidos sinteticos de la tira
etapa:

• Incubación con el conjugado: El conjugado se fija a la banda de IgG
Segunda humana del complejo Ag-Ac.
etapa

• Detección enzimática por agua oxigeanda y 4-cloro 1-naftol: reacción
enzimática con un produco de color azul-negro en cada banda donde
Tercera fijación especifica a cada uno de los antigenos recombinanates y/o
etapa péptidos recombinantes.

2. OBJETIVOS

Objetivo general:
Aplicar el kit para la prueba del virus de la hepatitis C a las muestras traídas a clase
y ver si son positivas o negativas.

Objetivos específicos:
 Conocer en que consiste el ensayo en tira inmunoabsorbente.
 Identificar los antígenos recombinantes y péptidos sintéticos que usa la prueba
para el reconocimiento del virus.
 Aplicar la metodología a las muestras y comprobar si son positivas o negativas.

3. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Antes de comenzar la metodología preparar:
1. Componentes a temperatura ambiente (15 a 30 °C)
2. Mezclar reactivos suavemente (evitar formación de espuma)
3. Preparar solución tampón



Colocar una tira en cada tubo ( Identificar las muestras y Añadir 1mL de diluyente a
un tubo por muestra y por controles con el numero cada tubo (la tira debe estar
cada control) correspondiente a cada tira. cubierta)

Colocar los tubos en un
Añadir 240чL de la muestra o
oscilador (16 a 20 ciclos por Tapar e invertir para mezclar
del control
minuto) de 4 a 4:30h

Añadir 1mL de diluyente a
Decantar todo el liquido cada tubo y volver a colocar Decantar todo el liquido
en el oscilador de 30 a 35 min.

Añadir 1mL de solucion de
Agragar 30mL adicionales de
Añadir 1mL de conjugado por tampon de lavado en cada
solución tampon. Con un
cada tira al recipiente. Incubar tubo, luego verter el liquido y
volumen total de 60mL. Luego
en agitador de 9 a 11min. las tiras en los reipientes de
decantar el liquido. Repetir
(preparar sustrato) lavado con 10mL de solución
esto dos a tres veces.
tampón

Transferir las tiras a papel
Una vez termianda la Añadir 1mL de sustrato por
absorebente y retirar exceso
incubación decantar el tira en el recipiente. Incubar
de agua, dejar secar en la
conjugado, lavar las tiras con de 15 a 20 min. Luego lavar las
obscuridad 30min,
30mL de soluciión tampón, tiras con 60mL de H2= MQ,
temperatura ambiente,
decantar y repetir dos veces. repetir uan vez mas.
interprtar tiras.



4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Según los controles que manejamos y las muestras, estas concuerdan con los controles
positivos, por lo que las muestras indican positivo para el virus de hepatitis ya que hubo
reacción en cada una de las bandas lo cual nos indica que hubo unión Ag-Ac del virus con
cada antígeno y péptido específico para el virus.

Este tipo de ensayo se pude utilizar como prueba confirmatoria de otros ensayos (ELISA) y
también poder diferenciar entre positivos y falsos positivos. La combinación de antígenos
recombinantes y péptidos inmovilizados en cada tira los cuales son específicos para cierta
región en el genoma del virus la hacen una prueba de alta especificidad y sensibilidad al
diagnóstico del virus.

Otra ventaja que presenta esta prueba es que es posible volverla automatizada, así se evita
la el análisis subjetivo, esto se puede observar en el artículo presentado por el JOURNAL
OF CLINICAL MICROBIOLOGY, de Feb. 1998, p. 387–390 Vol. 36, No. 2 titulado: Automated
RIBA Hepatitis C Virus (HCV) Strip Immunoblot Assay for Reproducible HCV Diagnosis

Donde se utiliza un procesador que mide la intensidad de las bandas de control, antígeno
y péptidos, lo que hace el sistema es iluminar cada banda y medir la luz reflejada de
manera diferencial con el fondo blanco. Un algoritmo interpola valores relativos de
intensidad para cada banda las cuales tienen asignadas valores de referencia. Con esto si
en alguna tira tenemos duda ya que las bandas puede que se vean muy tenues con esto
podemos comprobar si el paciente es positivo o no (como en la tabla presentada abajo).



Figura 11. Tabal de comparación entre la prueba manual y en la que se aplica el procesador.

5. CONCLUSIONES

 El ensayo en tira inmunoabsorbente consiste en que en las tiras se encuentran
inmovilizados antígenos recombinantes y péptidos sintéticos, los cuales
representan cada banda, estos en presencia del virus darán una reacción Ag-AC.
Seguido de esto se agrega el conjugado de IgG con peróxidasa para llevar a cabo
una reacción enzimática de color azul-negro en donde haya habido unión.
 Los antígenos recombinantes y péptidos sintéticos son: c100, c33-c, c22 (p), región
NS5 del genoma del virus.
 Las muestras alas que se les aplico el procedimiento dieron iguales a las tiras de los
controles positivos lo que quiere decir que las muestras dan positivo al virus de
hepatitis C.

6. REFERENCIAS

 P. MARTIN,1* F. FABRIZI,1 V. DIXIT,1 S. QUAN,2 M. BREZINA,1 E. KAUFMAN2, K.
SRA,2 R. DINELLO,2 A. POLITO,2 AND G. GITNICK1 Automated RIBA Hepatitis C
Virus (HCV) Strip Immunoblot Assay for Reproducible HCV Diagnosis, JOURNAL OF
CLINICAL MICROBIOLOGY, 0095-1137/98/$04.0010, Feb. 1998, p. 387–390
 Theodore Sy, M. Mazen Jamal, Epidemiology of Hepatitis C Virus (HCV) Infection,
International Journal of Medical Sciences, ISSN 1449-1907 www.medsci.org 2006
3(2):41-46, 2006
 Marc G. Ghany,1 Doris B. Strader,2 David L. Thomas,3 and Leonard B. Seeff4,
Diagnosis, Management, and Treatment of Hepatitis C: An Update, AASLD PRACTICE
GUIDELINES, HEPATOLOGY, April 2009


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