High throughput technologies in Genomics - Tecnologías de alto rendimiento en genómica. Session 1: Microarrays Course held at Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), in Barcelona, Catalonia, Spain, on October 5th, 2011.

1. 5 de Octubre de 2011

2. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIA 1. 5 de Octubre
Microarrays (Ricardo Gonzalo)
RTqPCR (Paqui Gallego)
Diseño experimental y análisis de resultados (Alex Sánchez)
DIA 2. 30 de Noviembre
Ultrasecuenciación (Paqui Gallego y Alex Sánchez)

3. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Pre-Experimento…
UCTS UEB
INVESTIGADOR

4. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MICROARRAYS
TIPOS DE ARRAYS
•Según su tecnología
•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección
•GeneTitan
•Controles de calidad

5. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MICROARRAYS
TIPOS DE ARRAYS
•Según su tecnología
•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección
•GeneTitan
•Controles de calidad

6. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de arrays de expresión según su tecnología (I)
Arrays de cDNA – 2 colores Arrays de oligos – 1 color
Impresión de la sonda síntesis de la sonda “in situ”
2 dyes fluorescentes (Cy3/5) 1 dye fluorescente (FE)
2 muestras / slide 1 muestra / slide
1 gen = pocos spots/replicados 1 gen = representado por
muchas sondas diferentes
Longitud (nt) elevada oligos de 20-25 nt
Medidas relativas medidas absolutas

7. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de arrays de expresión según su tecnología (II)
Arrays de cDNA (2 colores) Arrays de oligos (1 color)
• Más económicos
p •Chips de alta densidad
• Alta flexibilidad en el diseño
r •Muy reproducibles
o •Medidas absolutas
s
•Manejo de clones
c • Precio elevado
•Posibles hibridaciones cruzadas
o • Falta de flexibilidad en algunos
•Baja reproducibilidad
n formatos
s • Equipamiento especializado

8. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (I)
DNA ANALYSIS ARRAYS
•Genome-Wide SNP Analysis GW Human SNP array 6.0
? 1.8 M marcadores genéticos (900.000 SNP + 900.000 CNV)
•Resequencing Arrays Human Mitochondrial array
“Custom” resequencing arrays
•
Citogenética GW Human SNP array 6.0

9. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (II)
GENE REGULATION ANALYSIS ARRAYS
• ChiP-on-Chip: Estudio de interacciones entre DNA y proteínas
y modificaciones del DNA, ej.
 Sitios de unión de factores de transcripción
 Sitios de unión de histonas
 Metilación del ADN

10. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (III)
EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS (I)
3’ Expression Human U133 Plus 2.0 array
Human U219 array plate
Rat, Mouse, Porcine, Zebrafish, …
5’ 3’

11. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (IV)
EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS (II)
Gene Arrays Human, Mouse, Rat Gene 1.0 ST Array
Exon Arrays Human, Mouse, Rat Gene 1.0 ST Array
Exon Arrays
5’ 3’
Gene Arrays

12. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (V)
miRNA GeneChip miRNA 2.0 Array
•131 organisms in the array (human, mouse, rat, canine, ….)
•100% miRBase v115
•2.334 snoRNAs and scaRNAs (human small nuclear RNAs)
•Low inputs amounts (0.1 to 1 ug total RNA)
•2.202 probe sets unique to pre-miRNA hairpins
• Según el método de purificación se enriquece una fracción u otra.

13. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (VI). Resumen
RNA - 3’IVT Expression Hg U133 Plus 2.0 Formato individual o formato placa (16, 24 ó 96)
Hg U219 Formato placa
- WT-Expression Human Gene Array Formato individual o formato placa
Human Exon Array Formato individual
- miRNA miRNA Array Formato individual
DNA - Resequencing Mitochip Formato individual
“Custom” Formato individual

14. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
¿Cómo están hechos? (I). Fotolitografía

15. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
¿Cómo están hechos? (II)

16. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MICROARRAYS
TIPOS DE ARRAYS
•Según su tecnología
•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección
•GeneTitan
•Controles de calidad

17. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MATERIAL DE PARTIDA RNA TOTAL
Poli A mRNA
Células eucariótas QIAGEN
EXTRACCIÓN
Tejido TRIZOL
CALIDAD BIOANALYZER CANTIDAD

18. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (I): BIOANALYZER

19. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (II): BIOANALYZER

20. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (III): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración
RNA Area: 192.0
RNA Concentration: 150 ng/µl
Result Flagging Color: 255
Result Flagging Label: Bad RNA quality
RNA Area: 155.7
RNA Concentration: 122 ng/µl
rRNA Ratio [28s / 18s]: 1.6
RNA Integrity Number (RIN): 8.5 (B.02.08)
Result Flagging Color: 65280
Result Flagging Label

21. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (IV): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración
Not all expected ladder peaks have been found. You
should try to modify peak find settings or add peaks
using manual integration.
Issue with ladder peak detection. Please check ladder.
RNA Area: 1,653.2
RNA Concentration: 50,101 pg/µl
rRNA Ratio [28s / 18s]: 1.3
RNA Integrity Number (RIN): 7.7 (B.02.08)
Result Flagging Color: 65280
Result Flagging Label: Good RNA quality

22. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
BIOANALYZER
Chips disponibles:
RNA Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent 2100 Small RNA Kit
DNA Agilent DNA 1000 Kit Agilent DNA 7500 Kit Agilent DNA 12000 Kit Agilent High Sensitivity DNA Kit
PROTEINAS Agilent Protein 80 Kit Agilent Protein 230 Kit High Sensitivity Protein 250 Kit
CÉLULAS Agilent Cell Kit

23. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (III): RNA INTEGRITY NUMBER
0 ≤ RIN ≤ 10

24. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (IV): RNA INTEGRITY NUMBER

25. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
?
CALIDAD RNA (V): RNA INTEGRITY NUMBER
¿qué RIN es el más adecuado?
¿hasta que RIN se puede utilizar?
¿se pueden mezclar diferentes RIN?
RIN 5.0 RIN 8.0

26. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (VI): TIPO DE MUESTRA
• kits especiales extracción RNA
• extracción “genes globina”
• no trabajar con sangre total
• HABLAR CON NOSOTROS ANTES

27. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CANTIDAD RNA
• 3’ IVT ARRAYS 200 ng / 3 µL
• Exon/Gene ARRAYS 200 ng / 3 µL
• NUGEN 500 pg / 5 µL
• miRNA 1 µg / 8 µL

28. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MICROARRAYS
TIPOS DE ARRAYS
•Según su tecnología
•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
•EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección
•GeneTitan
•Controles de calidad

29. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
PROCEDIMIENTO (I)
3’IVT EXPRESS
TTTTT AAAAAA
IVT
AAAAAA TTTTTTT
RNA (150 ng) O/N cRNA (≈ 40 µg)
RNA-cDNA dscDNA
EXON/GENE
NNNNN IVT NNNNN
RNA (150 ng) O/N
RNA-cDNA dscDNA cRNA ssDNA (7 µg)

30. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
PROCEDIMIENTO (II)
NUGEN
NNNNN SPIA
TTTTT
RNA (500 pg) RNA-cDNA dscDNA ssDNA (8 µg)
miRNA
Biotin-labeled 3DNA
ATP
AAAAAA AAAAAA
RNA (1 µg) Biotin-labeled RNA

31. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
PROCEDIMIENTO (III)
3’IVT EXPRESS EXON/GENE NUGEN miRNA Resequencing
Fragmentación
O/N

32. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

33. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Y ESTO SOLO ACABA DE EMPEZAR…
.CEL
UEB

34. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIFERENCIAS ENTRE LOS KITS
3’ IVT Exon/Gene NUGEN
Oligo dT NNN oligo dT + NNN
cRNA ssDNA ssDNA
15 µg 5.5 µg 5 µg
NO MEZCLAR DIFERENTES PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN
EN UN MISMO PROYECTO…

35. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN (I)

36. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN(II)
• Formato placa: 16, 24, 96 arrays

37. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN(III)
• Formato placa: 16, 24, 96 arrays
 mayor high throughtput
reducción del tiempo de procesado
 disminución de costes
 mayor reproducibilidad (disminución de efecto batch)
 Formato cerrado (16, 24, 96)
 No todos los tipos de especies, tipo de array representados

38. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (I)

39. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (II)

40. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Puricado

41. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Fragmentado