Este documento describe el desarrollo de paneles de SNPs autosómicos y su aplicación con fines forenses. Se seleccionaron y optimizaron dos ensayos multiplex de SNPs (52plex y 34plex) y se validaron sus frecuencias alélicas. Los SNPs demostraron ser útiles para el análisis de ADN degradado y la predicción de origen poblacional, así como en casos de parentesco complejos. El documento también compara el rendimiento de los SNPs frente a los STRs en muestras óseas antiguas y severamente degrad

1. “Desarrollo de paneles de SNPs
autosómicos y estudio de su
aplicación con fines forenses”
INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL
Manuel Fondevila Álvarez Facultade de Medicina

2. Introducción

3. INTRODUCCIÓN

4. INTRODUCCIÓN
Situación actual de la genética forense
Resistencia a degradación
* ADN MITOCONDRIAL
MUTACIONES EN LA REGION CONTROL
SNPs EN EL RESTO DE LA MOLECULA
* ADN NUCLEAR:
STRs y SPNs del Cromosoma y
* ADN NUCLEAR:
STRs y SNPs del cromosoma X
* ADN NUCLEAR:
STRs AUTOSÓMICOS
Informatividad

5. INTRODUCCIÓN
Los “Short Tandem Repeats”
STRs
ADN Repetitivo Microsatélite
Secuencias repetidas en tándem
Unidades de repetición: entre 2-7 bp
ATTACTGATCGGTAGCTGAGCCAATGGCAGTGATGG
GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA
ATGGTAGCTGAGTGCTGGACAT

6. INTRODUCCIÓN
Los “Short Tandem Repeats”
STRs
Probabilidad de coincidencia al azar:
~1 in 3 trillones con 15 STRs
Resultado obtenido en 5 horas con una
muestra de sangre del tamaño de la
cabeza de un alfiler

7. INTRODUCCIÓN
Desventajas de los STRs
SLIPAGE DE LA POLIMERASA
* Tasa de mutación de hasta 1x10-3
DEGRADACIÓN DE LA MUESTRA
* Longitud de amplicón elevada
* En condiciones de ADN degradado
el ADN de alto peso molecular es
eliminado de la muestra.

8. INTRODUCCIÓN
Necesidad de ampliar la batería de marcadores
• Metodologías de alto rendimiento para:
Bases de datos de ADN (1 millón de perfiles por año)
Necesidad de grandes estudios de mt-ADN/ cromosoma Y
Automatización-Miniaturización
• Mayor sensibilidad
• Mayor información (origen geográfico)
• Características físicas
• Análisis de ADN degradado

9. INTRODUCCIÓN
SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms
+ Coexistencia de dos o más posibilidades
nucleotídicas en un locus determinado del genoma.
+ Limitado uso en genética forense
- Estrategia de tipado mas compleja que en STRs
- Menor informatividad individual con respecto a los STRs

10. INTRODUCCIÓN
P. Gill (2005)
Para obtener una probabilidad de exclusión del 99.9%
se necesitarían 50 SNPs con frecuencias de entre
0.5-0.5 y 0.2-0.8 respectivamente

11. INTRODUCCIÓN
SNPs: Single Nucleotide Polimorphism
• Es la variación mas frecuente en el genoma humano
• Presentan una tasa de mutación baja (Mutation rate 10-9)
• Son marcadores facilmente amplificables en multiplex
• Se analizan facilmente con técnicas de alto rendimiento
• Tamaño de amplicón reducible al mínimo
G
ATTACTGATCGGTAGCTGAG CCAATGGCAGTGATGG
T
.

12. OBJETIVOS DEL TRABAJO
• SELECCIÓN DE BATERÍAS DE SNPs
DESARROLLO
• OPTIMIZACIÓN DE LOS MULTIPLEXES
DE
MULTIPLEXES • VALIDACIÓN DE LOS MULTIPLEXES
• VALIDACIÓN DE LA TECNOLOGÍA DE TIPADO
• APLICACIÓN A MUESTRAS DEGRADADAS
VIABILIDAD DE
LOS • APLICACIÓN A PREDICCIÓN DE ORIGEN POBLACIONAL
MULTIPLEXES • APLICACIÓN A CASOS DE PARENTESCO COMPLEJOS

13. INTRODUCCIÓN
UTILIDADES DE LOS SNPs EN GENÉTICA FORENSE
* ADN severamente degradado
* Predicción de origen poblacional
* Casos de parentesco complejos

14. INTRODUCCIÓN
UTILIDADES DE LOS SNPs EN GENÉTICA FORENSE
* ADN severamente degradado
* Predicción de origen poblacional
* Casos de parentesco complejos

15. INTRODUCCIÓN
ADN severamente degradado
Tras la muerte actúan sobre el ADN una serie de proceso acumulativos
que conducen a la degradación de la molécula:
* Fragmentación enzimática aleatoria
* Daño oxidativo
* Acumulación de sustancias inhibidoras

16. INTRODUCCIÓN
ADN severamente degradado
* Cuanto mayor es el fragmento de ADN, menores son las probabilidades de
encontrarlo íntegro y útil
* Las reacciones de PCR de amplicón reducido, aumentan la posibilidad de
hallar los fragmentos de interés intactos
SNP 1
SNP 2
SNP 3
SNP 4
SNP 5
SNP 6
SNP 7

17. INTRODUCCIÓN
UTILIDADES DE LOS SNPs EN GENÉTICA FORENSE
* ADN severamente degradado
* Predicción de origen poblacional
* Casos de parentesco complejos

18. INTRODUCCIÓN
Determinación de origen geográfico y poblacional

19. INTRODUCCIÓN
DIÁSPORA ANCESTRAL DE LA
HUMANIDAD

20. INTRODUCCIÓN
Fuerzas evolutivas
La migración: como un factor
homogenizador, introduciendo
cambios antes inexistentes, o
aumentando su frecuencia.
La deriva génica se debe al
emparejamiento al azar en la
población. En general actuará
aumentando la varianza entre
grupos y disminuyendo la varianza
intragrupal.
La mutación ocurre con una
determinada probabilidad en
cada posición, de forma que es
muy probable que aparezca un
cambio en una población y no en
otras.

21. INTRODUCCIÓN

22. INTRODUCCIÓN
UTILIDADES DE LOS SNPs EN GENÉTICA FORENSE
* ADN severamente degradado
* Predicción de origen poblacional
* Casos de parentesco complejos

23. INTRODUCCIÓN
Casos de parentesco complejos
Los individuos emparentados tienen una alta probabilidad de que su
perfil presente identidad por descendencia
Tendencia a aumentar la
resolución con mas marcadores
Mayor número
de reacciones
Riesgo de Riesgo de
contaminación error humano
Excesivo gasto
de muestra

24. INTRODUCCIÓN
Distribución de SNPs en el genoma
• Amplia distribución de marcadores en el genoma
• Mayor número de marcadores en una única reacción
• Mayor posibilidad de captar diferente pauta de recombinación

25. Resultados y Discusión

26. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Bloque 1: Método, selección y optimización del tipado
Bloque 2: Aplicación a casos de ADN degradado
Bloque 3: Aplicación a predicción de origen poblacional
Bloque 4: Aplicación a casos de parentesco complejos

27. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Método, selección y optimización del tipado
Se ha desarrollado y optimizado con éxito el tipado multiplex de
dos ensayos de SNPs
Human Identification 52plex Population Specific 34plex
PCR 52plex o 23plex-Auto1 & 29plex-Auto2 PCR 34plex
Tipado 23plex & 29plex Tipado 34plex
Auto1-23plex Auto2-29plex Pop.Spec.34plex

28. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Selección de SNPs
Uso de bases de datos on-line
Calidad de secuencia
flanqueante
African Asian European
0.92 - 0.08 - 0.45 - 0.55
0.90 - 0.10 0.50 - 0.50 0.50 - 0.50
0.91 - 0.09 0.59 - 0.41 0.79 - 0.21
0.92 - 0.08 0.92 - 0.09 0.57 - 0.43
Selección de marcadores bien
Adecuada distribución de
espaciados en el genoma
Ausencia de amplificación frecuencias
inespecífica

29. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Selección de SNPs para identificación humana
Human Identification 52plex
• Frecuencia del alelo mínimo al menos 0.3 en
un grupo poblacional
• Frecuencia del alelo 0.2, en máximo 2 de los
grandes grupos
• Posibilidad de diseño de amplicón menor de
120bp
• Baja interacción entre primers

30. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Selección de SNPs: Frecuencia alélica mínima
La informatividad esperada no cae significativamente hasta valores
de 0.3

31. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Validación de la selección de SNPs del multiplex
• Se ha realizado un tipado masivo de muestras de poblaciones de
distribución mundial
• Los datos de número creciente de nuevas poblaciones, se añaden a una
base de datos on-line
www.snpforid.org
SNPforID frequency browser

32. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Validación del Human specific 52plex: Frecuencias observadas
• Las frecuencias observadas coinciden con las esperadas
• Alta informatividad en los tres grandes grupos
• La informatividad decrece ligeramente en población Africana

33. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Tecnología SNaPshot: El método de tipado
Reproducibilidad
La tecnología SNaPshot cumple
Exactitud
con estos requerimientos
Sensibilidad necesarios para la adecuación
forense del método
Adaptación a ensayos multiplex

34. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Original
Concentración
20ng
Dilución
1:8
Dilución
1:32
Dilución
1:132
50pg

35. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Desventajas del método de SNaPshot
Derivan de la detección mediante marcaje fluorescente diferente para
cada base
• El desequilibrio entre señales de
los heterocigotos (1)
• Y la pérdida alélica (2) presentan
mayor dificultad
• La aparición de bandas
inespecíficas (3) tiene solución

36. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
El método de Genplex: Estrategia alternativa
Análisis por clusters de datos El método de Genplex añade
altamente reproducibles.
estas ventajas a las
Lectura en la misma longitud características ya mostradas
de onda de ambos alelos. por el SNaPshot
Mayor constancia de la ratio de
señal en los picos de
heterocigotos

37. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
GENPLEX: Análisis de mezclas
• ADN extraído de toma de muestra postcoital
• Diferentes tiempos de toma de muestra tras el coito
• Comparación con los perfiles individuales de los sujetos

38. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 1:
Método, selección y optimización del tipado

39. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2:
Aplicación de los SNPs a casos de ADN
severamente degradado
* Se ha realizado un estudio
comparativo de los métodos de
análisis disponibles, mediante el tipado
de una colección de restos óseos.
* Centrando parte de la atención en la
resolución de casos de ADN
extremadamente degradado, en los que
solo el genotipado de SNPs
autosómicos dio resultado.

40. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
Métodos de STRs utilizados
PowerPlex16 system AmpFlSTR Identifiler
AmpFlSTR Minifiler NIST’s MiniNC01

41. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
Métodos de SNPs utilizados
Human identification 52plex
* 52plex PCR
* Dos reaciones de extensión en tandem:
Auto1 (23 SNPs)
Auto2 (29 SNPs)
* Posibilidad de usar dos PCR iniciales
separadas Auto1&Auto2 – Mejora los
resultados
Population Specific 34plex
* 34plex PCR
* 34plex reacción de minisecuenciación

42. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
SELECCIÓN DE MUESTRAS
* 15 muestras analizadas: 6 juegos de dientes y 9 fémures.
* Se analizaron parientes vivos.
* Todas la muestras eran de origen caucásico, de procedencia del nordeste
de la península ibérica.
* Las condiciones climáticas de este área se caracterizan por precipitaciones
frecuentes durante todo el año, temperatura suave y suelos ricos en materia
orgánica y de pH ácido.

43. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
Extracción de ADN
* Método 1:
Extracción por el método de Fenol-Cloroformo
Purificación con Millipore Centricon
* Método 2:
Lalueza-Fox C et al. (2000)
Modificación para ADN antiguo por Nuria Naverán
Método de cuantificación:
Applied Biosystems’ Quantifiler Human DNA quantification kit

44. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
RESULTADOS DE CUANTIFICACIÓN * Valores de IPC mayores de 28 indican la
Internal
Cycle Concent
presencia de inhibidores.
PCR
Muestra threshold ración
control * Un resultado indeterminado generalmente
IPC Ct (ng/ul)
significa una concentración desconocida pero
70-06 Undet 37 0.04 elevada de inhibidores.
78p03 Undet 36.45 0.533
* los inhibidores pueden afectar a la
71p04 28.03 29.1 0.666
cuantificación.
126p04 28.43 28.45 1.03
122p04 Undet 25.79 5.88 * En casos de ADN degradado, una alta
23p04 27.73 33.63 0.034
concetración no implica presencia de ADN de
alto peso molecular .
72p03 31.69 29.26 0.599
60
77p04 28.56 28.64 0.902
50
50p04 27.76 31.75 0.117
40
12p05 28 31.31 0.156
IPC
cycle
45p04 28.12 28.99 0.717 30 Ct
Qty
24p05 28.3 28.51 0.981 20
11p05 35.55 26.85 2.93 10
105-05 35.15 25.21 8.63
0
5p04 35.49 23.97 19.51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
sample

45. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
uncorrected ordered by Powerplex/Qty
RESULTADOS DEL
TIPADO 120
100 powerplex
identifiler
80
% success
auto1
60 auto2
34plex
40
NC01
20 Minifiler
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
sample
ordered by powerplex/Qty
120
100 powerplex
identifiler
80
% success
auto1
60 auto2
34plex
40
NC01
20 minifiler
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
sample

46. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
uncorrected ordered by Powerplex/Qty
120
100 powerplex
identifiler
80
% success
auto1
60 auto2
34plex
40
NC01
20 Minifiler
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
sample
* Los sistemas de amplicón largo parecen ser afectados con una
mayor agresividad por la inhibición.
* Los SNPs muestran una elevada resistencia a la inhibición.
* Una mayor concentración de ADN diana, polimerización más corta,
y secuencias flanqueantes no repetitivas pueden ser las
explicaciones mas plausibles para este fenómeno.

47. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
Inhibición
Sin inhibición
Powerplex Identifiler Minifiler Auto1 34plex Auto2 NC01
* tasa media de éxito antes y
después de aplicar las
medidas contra la inhibición.
* Los resultados corregidos
muestran una tendencia, cuanto
mayor el amplicón, mayores las
posibilidades de fallo.

48. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
DEGRADACIÓN EXTREMA
70-06
• 10 años enterrado en un bosque
• Descubierto tras un incendio forestal
• Restos calcinados
78p03
• 35 Años de degradación
• Ambiente de degradación agresivo
• Abundante crecimiento de mohos
• Epífisis ausentes y tejido pulverulento
Se aplicaron ambos métodos de
extracción a estas piezas.
70-06 78p03

49. Identifiler Powerplex 16
70-06
Identifiler Powerplex 16
78P-03

50. Reduced amplicon STRs SNPs
Mini-Filer Auto 1
Success 50% Success 100%
NC01:3 STRs Auto 2
success 100% Success 100%
70-06
Mini-Filer Auto 1
Success 30% Success 100%
NC01:3 STRs
Auto 2
success 100%
Success 100%
78P-03

51. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs
RESOLUCIÓN DE LOS CASOS
STRs +SNPs
19años 9/17 52/52
P: 98.28 99.9983
20p07
10años 0/17 52/52
P: - 99.993
70p06 4/8 MiniFiler
3/3 Mini-NC01
1/6 Mini-SGM

52. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
PREDICCIÓN DE ORIGEN GEOGRÁFICO Y POBLACIONAL
Enviado a PloS-One, in press

53. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
SNPs INCLUIDOS EN EL MULTIPLEX
Búsqueda en bases de datos on-line
34 SNPs Frecuencias alélicas
• SNPs específicos de población 14
• AIMs 15
• SNPs no binarios 2
• SNPs fijados 3
Selección en base a:
•La adecuada distribución de frecuencias interpoblacionales
• Calidad de secuencia flanqueante

54. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
Pool de SNPs seleccionados
Multiplex optimizado Utilidad matématica on-line
operativo en ADN degradado para el cálculo estadístico

55. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
GENOTIPADO DE MUESTRAS POBLACIONALES: VALIDACIÓN
• El 34plex distingue Europeos/africanos/asiáticos
• Clasifica con un error Cercano a 0
• Se puede asociar con SNPs para identificación
• Alta sensibilidad y robustez
• Conocimiento preciso de un mayor número de poblaciones
Muestras analizadas.- 34SNP plex
SET INICIAL BOOTSTRAPPING SET DE CHEQUEO
Mozambique Muestreo CEPH PANEL
Somalia sintètico
Galicia
Dinamarca
China
Taiwan
120 muestras 1000X1000 1048 muestras
de cada grupo

56. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
Utilidad matemática: Resultado de salida
Pigmeos (Blaka) – perfil completo
Incluso los pigmeos que no
forman parte de los grupos
conocidos se clasifican sin
error como africanos

57. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
Utilidad matemática: Resultado de salida
Mozambiqueño: 14 SNPs, 18 gaps
Aún con 18 gaps si tenemos
una muestra de un africano la
clasificación es correcta (con
error 0)

58. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
Clasificación en poblaciones con mestizaje: Posible fuente de error
Africa
Cerdeña
Europa Asia
Europeo (Cerdeña) – perfil completo
La población Sarda se clasifica
correctamente pero con una LR mas
baja.
Esto sugiere la influencia de la
emigración norte africana a Cerdeña

59. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
Problemas cuando se analizan poblaciones similares
Africanos
Africanos Este Asia (Chinos)
Europeos Sur Asia
(Bengalíes)
Europeos Asiáticos
2 poblaciones similares pueden erosionar la clasificación

60. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
Población mestiza: Genotipado de población Afro-
americana
•El tipado de muestras de población afro-americana revela que para
esta población mestiza, la predicción sigue siendo fiable en un
altísimo número de casos
• Solo tres individuos clasifican como europeos
• La historia sociopolítica de estas poblaciones y la auto-designación
del origen étnico dificultan la correcta valoración de estos resultados

61. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
34plex: Aplicación real
Enviado a PloS-One, in press
•7 perfiles de STRs no se corresponden con
los sospechosos
• Pregunta.- Son norte-Africanos o Europeos?
- Poblaciones geográficamente próximas
- Historia reciente común
- Cierto grado de mestizaje con población
sub-sahariana

62. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional

63. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional
3 muestras clasifican como norte-africanas
RESULTADO DE
1 clasifica como europea
LA PRUEBA
3 no dan una estima con suficiente confianza
El test y su aplicación matemática, ofrecen para el
trabajo de rutina forense un sistema de clasificación
efectivo

64. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 4: Parentesco Complejo
Bloque 4: Casos de parentesco complejos
Los SNPs autosómicos, ofrecen una serie de ventajas
que explican su mayor efectividad en este campo:
• Reducida tasa de mutación
• Posiciones genómicas bien espaciadas en el genoma
• Resistencia a la degradación

65. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Bloque 4: Parentesco Complejo
Un número creciente de casos de aplicación exitosa
STRs +SNPs
39p04 21/21 52/52
P: 99.799 99.994
51p08 STRs +SNPs
21/21 52/52
P: 98.3 99.98
Debido a los casos resueltos con éxito gracias a la incorporación de SNPs
autosómicos, se puede asegurar que su adición constituye una solución
adecuada para este tipo de casos.

66. Conclusiones

67. CONCLUSIONES Conclusiones BLOQUE 1:
1.-Sobre la adaptación forense del tipado de SNPs
La reproducibilidad, exactitud, robustez, la sensibilidad y la informatividad nos permiten
llegar a la conclusión de que la adecuación del tipado de SNPs al trabajo forense queda
probada.
1.1.- Sobre la selección de los marcadores.-
* El grado de información suministrada por los dos multiplexes de SNPs permite realizar
con la suficiente confianza el cálculo probabilístico aún con los exigentes requerimientos
del trabajo forense.
1.2.- Sobre el método de SNaPshot en casuística forense.-
* El estudio demuestra que es posible y operativo el diseño de reacciones multiplex
de alto rango (mas de 50 SNPs) para muestras forenses.
* La sensibilidad del método de SNaPshot y su robustez quedan demostradas
* La existencia de una serie de desventajas inherentes a la técnica de SNaPshot nos
llevan a concluir que su substitución por otra alternativa, como el Genplex, podría ser
beneficiosa.

68. CONCLUSIONES Conclusiones BLOQUE 1:
1.3. - Sobre la tecnología Genplex como sucesora al SNaPshot.-
* Este método de análisis presenta una enorme reproducibilidad, lo que
permite la comparación de múltiples grupos de datos, incluso entre diferentes
laboratorios.
* El método Genplex es robusto y exacto permitiendo el correcto tipado de
muestras problemáticas aunque muestren relaciones de intensidad de señal inusuales
* El método de Genplex permite una mejor valoración de perfiles de mezclas
biológicas ya que presenta un elevado grado de exactitud, y una relación correcta
entre intensidad de señal y cantidad de producto
* Sin embargo este método aún no se encuentra lo suficientemente optimizado
para ofrecer una alternativa al SNaPshot en la rutina forense.

69. CONCLUSIONES Conclusiones BLOQUE 2:
2.- El uso de SNPs en muestras altamente degradadas.
La posibilidad de diseño de reacciones de PCR multiplex de amplicón corto hace suponer
que el tipado de SNPs presentará una mayor tasa de éxito, en relación al tipado de STRs,
en muestras de ADN altamente degradado
2.1.- Sobre el efecto de las sustancias inhibidoras de la PCR en muestras
degradadas.-
* La presencia de inhibidores en el extracto juega un papel crítico en la dificultad del
trabajo con muestras degradadas, y debe ser contemplado incluso por encima de
la degradación enzimática
* El tipado de SNPs muestra una clara capacidad para soportar los efectos inhibitorios
en la PCR. La mayor concentración inicial de ADN blanco sin degradar es la
explicación más probable para esta observación
* La inhibición de la reacción de la PCR puede ser limitada a través de la correcta
preparación de la muestras y de la elección adecuada del método de extracción.

70. CONCLUSIONES Conclusiones BLOQUE 2:
2.2.- Sobre el efecto de la fragmentación del ADN en la PCR de muestras
degradadas
* Dependiendo del estado de degradación, el volumen del extracto, y los resultados
de cuantificación, el método de análisis deberá ser seleccionado entre STRs, SNPs o
ADN mitocondrial.
* Se ha comprobado que excepto en los casos de degradación más agresiva,
fragmentos de hasta 300bps pueden ser amplificados con éxito con todos los
sistemas. Sin embargo los SNPs ofrecen una mayor tasa de éxito si el ADN está
severamente degradado.
* La aplicación del tipado de marcadores de amplicón reducido, como los SNPs y los
miniSTRs, a muestras degradadas ha demostrado ser una solución adecuada para
los problemas que acarrea el trabajo con este tipo de muestras.
* Para la elección de los marcadores se ha de tener en cuenta la informatividad del
análisis, por lo que se recomienda el tipado de SNPs sobre el de miniSTRs.

71. CONCLUSIONES Conclusiones BLOQUE 3:
3.- La aplicación del tipado de SNPs a la predicción de origen geográfico
Los individuos pertenecientes a varias poblaciones que fueron tipificados con el multiplex
Pop.Spec.34plex, resultaron clasificados correctamente. El grado de clasificación errónea del test
es cercano a cero.
El test y su aplicación matemática, ofrecen para el trabajo de rutina forense un sistema de
clasificación efectivo, por lo que es razonable esperar que pueda encontrar un lugar entre las
aproximaciones disponibles para la asignación de ancestralidad poblacional.
3.1- Sobre la capacidad de discriminación entre poblaciones geográficamente
próximas
* La comparación enfrentada, por pares de poblaciones, constituye una
estrategia válida para la asignación del origen de una muestra entre poblaciones
geográficamente próximas.
* Sin embargo cabe destacar que esta comparación depende del que entre las
poblaciones a comparar exista una cierta diferencia en las frecuencias génicas de los
marcadores implicados, entre las poblaciones.
* La selección de marcadores con la distribución de frecuencias adecuada podría
permitir una separación mas fina incluso entre poblaciones con una historia común
reciente, sin embargo el hallazgo de tales marcadores se presenta como una difícil
empresa

72. CONCLUSIONES Conclusiones BLOQUE 4:
4.- La resolución de casos complejos mediante el uso de SNPs
Habida cuenta de los casos resueltos con éxito gracias a la incorporación de los multiplexes
de SNPs al pool de marcadores forenses, se puede asegurar que, constituye una solución
adecuada para el trabajo forense, rápida y fiable

73. AGRADECIMIENTOS
“Generally, I dislike fixedness in both long swords and hands. Fixedness
means a dead hand. Pliability is a living hand. You must bear this in
mind.”
Miyamoto Musashi (1584-1645)