Este documento presenta un resumen del seminario sobre la técnica de RTqPCR realizado en 2012. Describe las diferentes etapas de un experimento de RTqPCR, incluyendo la definición de la técnica, la terminología asociada, el flujo de trabajo con etapas como el diseño experimental, la preparación y extracción de muestras, la transcripción reversa, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y la validación y análisis de los resultados. El documento proporciona información fundamental sobre esta importante técnica de biolog
1. Programa del Seminario RTqPCR-
2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
2. Definición de la Técnica
PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR
UNG
A G CU
T (opciona
Taq Ácido Tampón de l)
polimeras nucléico Cebadores dNTPs reacción
a
ROX
Agentes Sonda
R Q Termociclador
intercalantes
con sistema de detección
http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr
3. Definición de la Técnica
PCR Convencional RT-qPCR
Semi-cuantitativa: Cualitativa y cuantitativa.
Rango dinámico pequeño ›2 logs Cuantificación Absoluta
Baja Precisión; baja resolución y A tiempo real
(fase exponencial) Cuantificación Relativa
poco Sensible.
Manipulación post-PCR .
A tiempo final Plus/Minus
Baja Resolución
(fase plató) Discriminación Alélica
No-automatización
Discriminación basada sólo en
tamaño Elevado rango dinámico de
Los resultados no están detección
expresados en números. Capaz de detectar cambios 2-fold.
El BrET no es muy cuantitativo No requiere procesado post-PCR
4. Programa del Seminario RTqPCR-2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
5. Terminología asociada a qPCR
Escala semi-
logarítmica
a l Plató
Line
ial
Fluorescence
nc
ne
Rn
Log
po
Threshold
Ex
Baseline
Ct value= 15.5
Cycle Number
6. Terminología asociada a qPCR
ROX (6-carboxy-X-rhodamine) como referente pasivo
+ ROX - ROX
Desv St= ± 0.306
Desv St= ± 0.059
Δ Rn
Ciclos Ciclos
Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado
para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y
Stratagene.
7. Terminología asociada a qPCR
Aplicaciones 3´oligo
5´oligo
RTqPCR
Proteína
Tejido Target
mRNA
miRN
Célula RNA A
Eucariota ncRN
A
siRNA
Análisis en Células Stem Validación Microarrays
saRN
Análisis en célula Única
A
CNA
SNP
DNA
Bacteria CNV
Micoplasma Mutaciones
Patógenos en la comida Virus Análisis
Metilación
8. Programa del Seminario RTqPCR-2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
12. qPCR Workflow: Diseño
experimental
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
Definir el experimento y los grupos control
Número muestras de cada grupo
Réplicas Experimentales (Biológicas y Técnicas)
Distribución de placa (genes vs muestras)
15. qPCR Workflow: Preparación de la
muestra
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
Descripción de la muestra (Microdisección o macrodisección)
Manipulación (si congelación o FFPE; cómo, que y cuando)
Condiciones de almacenamiento
16. qPCR Workflow: extracción de ác.
nucléicos
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
Método de extracción
Tratamiento con DNasa
Calidad (Pureza & Integridad) & Cantidad
Almacenamiento (-80ºC)
17. qPCR Workflow: extracción de ác.
nucléicos
Como afecta el método de extracción de RNA a los resultados qPCR
18. qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos
PUREZA: Libre de contaminación por:
Proteínas, sales caotrópicas y fenoles (Absobancia A260/A280 >1.8-2.0; A260/A230=2)
gDNA (Tratamiento con DNAsa
Inhibidores (SPUD assay (Nolan, 2006)
INTEGRIDAD: No degradado
rRNA (28S:18S=2:1)
RIN (Fleige & Pfaffl, Mol. Aspects Med. 27(2006): RIN › 5)
PCR test: Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica elevada integridad; ›5 degradado)
CANTIDAD: Usar el mismo método de cuantificación en muestras que se quieren comparar.
(Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005))
do
da t o
ra c
Deg Inta
28S
18S
2:1
20. qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos
Inhibición de la RT-qPCR en qué muestras
Material de partida:
Muestras fecales
Cartílago, hígado. Córnea, etc...
Sangre total: heme
Anticoagulante: Heparina
Causada por el método de extracción/protocolo erróneo:
Etanol en el eluido por una insufiente centrifugación en el
segundo lavado puede inhibir las reacciones de RT y qPCR
cDNA o gDNA demasiado concentrado:
Más del 10% de cDNA, gDNA en la qPCR inhibe la
reacción.
23. qPCR Workflow: Transcripción
Reversa
DNA
Muestra Producto
RNA cDNA
Amplifica
do
Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis
qPCR
Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
Es la etapa mas variable de todo el proceso
One-Step vs Two Step
Cantidad de RNA y vol de reacción
CDNA Priming
Transcriptasa Reversa y concentración
Pérfil Térmico
Controles
Réplicas
24. qPCR Workflow: Transcripción
Reversa
One-Step RT- Two-Step RT-PCR
PCR
RT
Descripción RNA cDNA
RT qPCR
RNA cDNA Amplicón qPCR
cDNA Amplicón
Minimiza tiempo de preparación y el Posibilidad de almacenar cDNA para la
riesgo de contaminación. cuantificación de varios tragets.
Pros
Menos Background en ensayos Más eficiente porque se pueden usar
SYBRGreen Random primers y oligo(dT) a la vez.
Más flexible (Permite la optimización por
separado de ambas reacciones.
No es posible la optimización por
separado de ambas reacciones
Contras
AmpErase UNG, para prevenir
contaminación, no se puede usar
Elevado Background en ensayos
Menos sensible debido a la menor SYBRGreen
eficiencia de la actividad RT de la
polimerasa
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
27. qPCR Workflow: qPCR
MFOLD
Las secuencias de los oligonts y del
amplicón tienen que ser únicas.
No deben tener estructuras
secundarias.
Los oligonts no deben amplificar DNA Efecto de la Tª de anillamiento sobre la estructura
secundaria del amplicón: El análisis de la secuencia del
(diseño en la zona exon/exon) amplicón mediante el MFOLD predice elevada estructura
secundaria a 60ºC y baja a 65ºC.
Idealmente, deberían testarse dos Amplicón
parejas de oligonts. 75-150 bp.
50-60% contenido en GC.
Oligonts
TM= 55-65ºC.
50-60% contenido en GC.
Evitar homopolímeros, sobretodo
de G.
Los 5 nts en el extr3¨no deben ser
más de 2 G y/o C.
28. qPCR Workflow: qPCR
Aplicación
Método de Normalización
Química de detección:
Sondas específicas marcadas con fluorocromos
Agentes Intercalantes
Fluorocromos unidos a primers
Reactivos:
Core kit vs Master Mix
dNTPs/dUTPs y UNG enzyme
ROX como referente pasivo
Termociclador:
Formato
Número de canales de detección
Software de análisis
Duración del programa
Precio y flexibilidad de la oferta
29. qPCR Workflow: qPCR
Perfil térmico qPCR que incluye paso de Activación UNG
1.- Activación UNG
2.- Activación Taq y desnaturalización UNG
3.- Desnaturalización del dsDNA
4.- Anillamiento y extensión primers
30. qPCR Workflow: qPC
Estrategias de Normalización qPCR
Normalización respecto a la masa total de RNA exraído
(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)
Normalización respecto al volumen/masa de la muestra
( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)
Normalización respecto al número de células
( moléculas/célula)
Normalización respecto a un gen endógeno no regulable
(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)
Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3)
geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology)
BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004)
Normfinder
Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome
Biology)
Genes and Immunity (2005) 6, 279-284.
Review
BMC Bioinformatics 2009, 10:110
31. qPCR Workflow: qPC
Genes de Referencia
Los genes de referencia tienen que:
ser de expresión constante
No ser regulados por las diferentes condiciones experimentales
Suficientemente abundantes entre los diferentes tejidos y tipos celulares.
Se recomienda el uso de al menos 3 genes de referencia para la normalización de
datos de qPCR.
EL gen de referencia “Perfecto” NO existe.
Softwares: genNorm
Normfinder
32. qPCR Workflow: qPC
Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una
muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante
para medir la variabilidad inter-ensayo.
Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las
réplicas difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes
los duplicados biológicos.
Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté
más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para
evitar contaminación cruzada.
Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se
manipule el cDNA.
Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la
preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente
ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de
ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas.
Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar
marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad
33. Programa del Seminario RTqPCR-2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
34. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP
Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)
Controles qPCR
NEGATIVOS
NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación
NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas
No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico
POSITIVOS
Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para
normalizar.
Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos
Spiking Control Detecta presencia de inhibidores
Curva de Disociación (SYBR Green)
Curva Estándar
Linealidad de los datos
Distancia entre las curvas de amplificación
Eficiencia de amplificación
35. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP
Eficiencia Convertir E en
Pendient Amplificación Porcentaje
Curva e
(E= 10-1/slope) %E= (E-1)100%
Estándard:
-3,0 2,2 115
R2 ›0.98 o r › 0.99
-3,1 2,1 110
Slope= -3.73
-3,2 2,1 105
-3,3 2,0 101
-3,32 2,0 100 OK
-3,4 2,0 97
-3,6 1,9 90
-3,7 1,9 86
-4 1,8 78
2n=Factor de
dilución
Factor
n=LG(Factor
Dilució
Dil.)/LG(2)
n
2 1,00
5 2,32
10 3,32
36. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP
Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen
EC
Slope
R2
(Ct gen Target – Ct gen Endógeno)
Y = 0.0471x + 3.0178
R2 = 0.2315
ΔCt=
Log Diluciones
38. Programa del Seminario RTqPCR-2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
39. Servicio de RTqPCR en la
UCTS
7000 SDS 7900HT Fast SDS LightCycler 480
Tiras de 8 Tubos
Formato
Microfluidicas Placas-384 White Plates-384
Placas-96
(Arrays de baja densidad)
Ref. Pasivo ROX Ninguno
ROX
Formato 384-p: FAM, TAMRA, Filtros/canales detección:
Química FAM, TAMRA, VIC, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.
JOE, NED, SYBR, ROX 500, 533, 568, 610, 640, 670
Formato LDA: FAM, VIC, ROX. nm
mode 9600 Emulation/Standard Fast
9600 Emulation /Standard
Fast
Softwares V1.2.3f2 con RQ study SDS 2.4.1
RQ Manager 1.2 SW 1.5
Primer Express 2.0
40. Servicio de RTqPCR en la
UCTS
Elección en el software del ensayo a realizar
Software qPCR Plantilla para el Run Análisis
1.-Absolute Quantification Absolute Quantification
(Standard curve) (Standard curve)
7000 SDS de ABI
2.-Relative Quantification
Relative Quantification
7000 SDS 1.1 RQ Study (ddCt) Plate (ddCt) Study
7900 SDS de ABI 1.- Standard Curve (AQ)
2.- ΔΔCt
LighCycler480
42. Programa del Seminario RTqPCR-2012
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
qPCR Workflow
Validación de un ensayo de qPCR
Servicio de qPCR en la UCTS
Bibliografía muy recomendada
43. Direcciones de interés relacionadas con
qPCR
http://qpcr.gene-quantification.info/
http://genex.gene-quantification.info/
http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-
machines.html
qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)
http://www.eurogentec.com
http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html