Es un técnica en el àrea de Tecnología en la elaboración de medicamentos.

1. LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE

2. Extracto de las
células sanguíneas
del cangrejo
herradura que forma
un coágulo en
presencia de
endotoxinas
INTRODUCCIÓN
Lisado de Amebocitos de Limulus
LAL

3.  Las preparaciones de uso parenteral deben
elaborarse por procedimientos que eviten la
presencia de pirógenos.
 La presencia de éstos en un preparado parenteral
puede desencadenar reacciones febriles,
acompañadas de escalofríos, aceleración del pulso,
disnea, cefaleas y mialgias hasta shock séptico.
 1876 Burdon-Sanderson utilizó por primera vez el
término “pirógeno” para designar toda sustancia
productora de fiebre. Noventa años después
Seibert estableció la relación entre la fiebre y las
sustancias de orígen bacteriano.

4. En los últimos años, los principales organismos
reguladores de productos farmacéuticos
(Farmacopeas) exigen cada vez más en sus
monografías la aplicación del método LAL para la
determinación de pirógenos en productos
parenterales terminados.
El análisis de pirógenos constituye uno de los
principales ensayos en el Control de Calidad de la
fabricación de inyectables por su repercusión en la
salud humana, puesto que la presencia y
administración de los mismos, es capaz de
provocar una serie de respuestas fisiológicas, en su
mayoría de carácter perjudicial y en casos
extremos, la muerte del paciente.

5.  Son termoestables y resisten la esterilización
en autoclave, pasan a través de la mayoría de
los filtros de profundidad.
 Actúan a dosis muy bajas, del orden del
microgramo. Son solubles en agua e insolubles
en solventes orgánicos. Estables alrededor de
largos periodos de tiempo.
 En el ser humano el tiempo de latencia luego
de inyectar una solución con pirógenos es de
(+/- 15 min) antes de que aparezca un pico
febril, en el conejo el tiempo de latencia es más
corto, pudiendo aparecer 2 o más picos
febriles.

6. Limulus poliphemus
• Método LAL, es un método in vitro que detecta con alta sensibilidad la
presencia de endotoxinas bacterianas.
• Reactivo LAL, es el extracto acuoso de amebocitos extraidos de la sangre del
cangrejo de herradura

7. El cangrejo de herradura presenta en su hemolinfa azul unas células únicas
llamadas amebocitos que contienen los elementos responsables de la
coagulación inducida por endotoxinas que son de naturaleza enzimática.

8. Palabras claves:
 Pirógeno ….. es cualquier agente productor de
fiebre.
Son sustancias que actúan sobre los centros
termorreguladores del hipotálamo produciendo
un aumento de temperatura (fiebre). Por lo
general son moléculas de alto peso molecular y
de naturaleza polímera.
 Endotoxina… es un componente de la pared
celular de las bacterias Gram negativas
constituida por lípidos y polisacáridos (LPS).

9. Otra palabra clave es:
 Lipopolisacáridos (LPS)… son polímeros complejos
con restos de ácidos grasos como parte lipófila y
cadenas características de oligosacáridos y
polisacáridos, que forman la mayor parte de la capa
externa de la membrana externa de bacterias Gram
negativas.
 Qué reacción existe entre el reactivo LAL y los LPS?

11.  Durante la preparación de inyectables,
los pirógenos pueden ser incorporados a
la formulación por el disolvente
(generalmente agua que es el foco de
orígen más común de endotoxinas
bacterianas), por las sustancias disueltas
(activo y auxiliares de formulación) y por
el material.
 Para evitar la incorporación de pirógenos
a través del agua es aconsejable:

12. -Utilizar agua no pirogénica desde el
inicio del proceso de elaboración de
productos estériles (agua que
contiene menos o igual que 0.5
EU/mL)
-No almacenar agua
innecesariamente
-Evitar en el diseño de canalizaciones
y depósitos los puntos en que
puedan producirse estancamientos

13. -Limpiar regular y rigurosamente todas las
canalizaciones con soluciones
antisépticas o vapor sobrecalentado
 Resulta más sencillo conseguir productos
químicos de síntesis libres de pirógenos,
pero resulta más difícil en el caso de
químicos producidos por fermentación
(dextrosa, fructuosa,aminoácidos,
algunos antibióticos), se recomienda que
sean elaborados como libres de
pirógenos si no resisten altas Tº.

14.  Si en la etiqueta de un producto estéril
declara como libre de pirógenos o no
pirogénico significa que el producto ha
sido evaluado y encontrado que contiene
menos o igual que 0.5 EU/mL.
 En este tipo de poductos el riesgo de una
reacción pirogénica está basada en la dosis
a ser administrada y la velocidad de
administración por hora.
 Si la cantidad de endotoxinas del producto
excede el límite de 5 EU/Kg/hr, el
producto o el lote debe ser rechazado.

15.  En 1984 los límites de endotoxínas bácte-
rianas fueron asignados a cinco productos de
agua USP:
 agua para inyección
 agua estéril para inyección y
 agua estéril para irrigación
 agua bacteriostática para inyección
 agua estéril para inhalación

16.  Existen productos que no tienen
que estar libres de pirógenos , solo
ser no pirogénicos, pueden
contener un nivel de pirógenos por
debajo de 5 EU/ Kg/hr que al ser
inyectado a un paciente no causa
una reacción pirogénica.

17. Existen 3 que son los mas conocidos:
 Método de coagulación ó Gel-clot, es el mas utilizado y
sencillo, establecido por la USP y la EP. También el
menos costosos.
 Métodos turbidimétricos, se fundamentan por el
aumento de la turbidez en la mezcla de reacción
provocado por el incremento de la concentración de
coagulina insoluble, la cual se monitorea
espectrofotométricamente.
 Métodos cromogénicos, se fundamentan en el empleo
de un sustrato cromogénico sintético incoloro que
desarrolla un color amarillo en presencia de
endotoxinas.

18. • Medicamentos parenterales
• Dispositivos médicos
• Productos biológicos
• Medios de cultivo para células
• Soluciones de hemodiálisis
• Agua ultra pura para la industria
• Endotoxinas ambientales y transportadas por
el aire

19.  Líquidos
 Polvos (solubles en agua, estables después
de la rehidratación)
 Dispositivos médicos (cortar ó desarmar,
extraer, enjuagar a presion, tiempo de
exposicion, temperatura, volumen de
extracto o enjuague se obtienen de la FDA)

20. • Seguir una técnica aséptica (mantener la esterilidad
de objetos estériles)
• Mantener los recipientes cerrados
• Transferir materiales estériles a recipientes
estériles
• Proteger los recipientes abiertos del polvo sin tocar
• Colocar barreras físicas
• Utilizar materiales de uso exclusivo para la Prueba
LAL (despirogenizados con calor seco)
• No mover los tubos de reacción mientras se lleva a
cabo la reacción.

21. Los recipientes y aparatos de transferencia
deben:
 Estar libres de niveles detectables de
endotoxinas
 No adsorventes
 Sin “extractables que causen interferencia”

22. Que es?
Es el proceso controlado por tiempo y temperatura por
el cual se destruye o eliminan por incineración
pirógenos, en particular endotoxinas bacterianas Gram-
negativas (pirógeno mas significativo)
El ciclo de despirogenización estándar es de no menos
de 250 ºC por 30 minutos ó 3 horas a no menos de 180
ºC
Se han descrito otros ciclos en cuanto a tiempo y
temperatura pero se demostraron que por debajo de
180 ºC la despirogenización puede ser incompleta
incluso después de largos períodos.

23. Cuales son los factores mas importantes?
 Los factores mas importantes son la temperatura y
el tiempo del proceso.
 Deben ser seleccionados con mucho cuidado en
funcion al tipo de estufa.
 Se puede agregar un factor de seguridad ya sea al
tiempo o a la temperatura

24. Se requieren dos fases:
1. Establecer características físicas del
calentamiento del horno e identificar los
puntos fríos. (Config. común sondas en
forma de X).
2. Después del ciclo propuesto debe ser
puesto a prueba con endotoxinas

25. 1.- Confirmación de la Etiqueta
λ Sensibilidad del reactivo LAL
λ = 0.125 EU ml
Curva de calibración que se hace
diariamente:
2λ λ 1/2λ 1/4λ Control
Neg.

26. 0.25 0.125 0.06 0.03 C Neg
+ + - -
La sensibilidad se elige de acuerdo al producto o sobre la base de
los requerimientos
Concentraciones de Estandar (EU/ml)
•El punto final confirma la sensibilidad de la etiqueta
•El error del ensayo es +/- un tubo de dilución

27.  Se ha establecido que el limite pirogénico
para seres humanos es aproximadamente 5
EU por K de peso de cuerpo por hora.
 Esto significa que concentraciones de
endotoxinas de 5 EU/K/hr o mayores pueden
generar una reacción pirogénica.
 Este límite se ha fijado para la mayoría de
productos inyectables

28.  El límite de endotoxinas esta representado
por la letra K .
 El valor de K es 5 EU/Kg/hr para inyectables.
 Para aquellos que se administran en forma
intratecal K es 0.2 EU/Kg/hr.
 El peso promedio de un individuo es 70 Kg, la
cantidad maxima de endotoxinas que puede
ser administrada a un paciente, al que se la
ha dado un producto no intratecal , no puede
exceder los 350 EU/hr (70 x 5EU/hr)

29.  El límite de la USP para PGV es 0.5 EU/ml y se
ha derivado de una dosis de un conejo de 10
ml/Kg para el test de pirógenos.
 Un típico PGV administrado a 700 ml/hr
tambien da un límite de 0.5 EU/ml.
 El límite de endotoxinas para agua API es de
0.25 EU/ml .
 Para aparatos médicos es de 20 EU/aparato, y
2.15 EU/aparato pasra artefactos que entran
en contacto con el fluido cerebroespinal

30.  El objetivo de la prueba es asegurar que la
muestra que se esta probando no entregue
mas de 5 (ó 0.2) EU/Kg/hr de endotoxinas a
un paciente.
 El límite de endotoxinas para un producto
específico depende de la dosis máxima del
producto que el paciente podría recibir.
 Entre mas pequeña sea la dosis del producto
por Kg, mas alto será el límite de endotoxinas
por unidad de dosis del producto

31.  La letra M es usada para expresar la dosis
maxima.
 Cuando se calcula el límite de endotoxinas en
productos, si la dosis es expresda para todo
el cuerpo (adulto) primero se divide por 70
Kg para expresar en Kg.
 Despues se divide K ( 5 EU/Kg, 0.2EU/Kg)
para dar el límite de endotoxinas por unidad
peso/volumen/unidades internacionales etc.

32.  Ejemplo: El producto A tiene una dosis para seres
humanos (todo el cuerpo) de 1.0 g
 Dosis por Kg=
1𝑔
70𝐾
=0.0143g/Kg = 14.3 mg/Kg
𝐿𝑖𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑑𝑜𝑡𝑜𝑥𝑖𝑛𝑎𝑠 =
𝐾 = 5 𝐸𝑈/𝐾𝑔
𝑀 14.3 𝑚𝑔/𝐾𝑔
= 0.35 𝐸𝑈/𝑚𝑔

33.  Usar la concentración del producto (la
potencia en el producto final) para convertir
el límite de endotoxinas en EU/ml.
 Usando el ejemplo anterior, si la
concentración del producto en el envase es
de 100 mg/ml, o si la mayoria del producto
es disuelto para dar 100mg/ml:

34.  Límite de endotoxinas
 L de E= 0.35EU/mg x 100 mg/ml= 35 EU/ml
 Convertir el límite a EU/ml porque esas son
las unidades de los estándar de endotoxinas
en las pruebas LAL

35. CARACTERISTICAS:
~ Diseñado especialmente para probar aguas.
~ Pyrosate es un producto nuevo y muy fácil de
usar en la determinación de endotoxinas.
~ No requiere un entrenamiento previo para su
uso.
~ Pyrosate fue diseñado de tal forma de evitar
diluciones de la muestra.

36. CARACTERISTICAS:
~ El nuevo kit de Pyrosate es un ensayo gel-clot
cinético.
~ Resultados en menos de 30 minutos.
~ Tiene una sensibilidad () de 0.25 EU/ml que
puede lograrse en menos de 30 minutos.
~ Acorta la prueba gel-clot tradicional en la
mitad.

37. ~ No se requiere conocimiento técnico.
~ Tiempo de ensayo más corto - 0.25 EU/ml en
menos de 30 minutos.
~ Formulación específica para endotoxinas.
~ No se requiere diluciones u otros reactivos.
~ Incluye un control positivo específico de 2.
~ Viales muy fáciles de abrir.