El documento describe las coloraciones más comunes utilizadas en el laboratorio de microbiología, incluyendo la tinción de Gram y otras tinciones simples y diferenciales. Explica cómo estas tinciones permiten visualizar las bacterias y clasificarlas de acuerdo a su morfología y otras características. También resume los procedimientos básicos de cultivo, aislamiento e identificación de microorganismos en el laboratorio, incluyendo el uso de medios de cultivo selectivos y diferenciales y pruebas bioquímicas.

1. COLORACIONES MÁS COMUNES EN EL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGÍA
YOLANDA TAPIA MARTÍNEZ
LINA QUIÑONES GONZÁLEZ
JOSÉ BELTRÁN MÁRQUEZ
NUBIS MENCO MORALES
MARGARITA DIAZ DURANGO
UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGÍA I SEMESTRE
MONTERÍA – CORDOBA
FECHA

2. INTRODUCCIÓN
Las tinciones utilizadas generalmente en microbiología han
surgido por la necesidad de estudiar a los microorganismo y
tejidos biológicos ; microorganismos como las bacterias ya
que estas presentan una naturaleza muy peculiar , son
microscópicas y además presentan una refracción similar a la
del agua por lo que se requiere teñirlas para observar su
morfología, agrupación y clasificación según determinadas
características de su pared celular.
Las tinciones es una herramienta de coloración en la cual se
necesitan de colorantes y reactivos ´para llevarla a cabo.
1.- Visualización
Uno de los procedimientos básicos y no por ello menos importante es
la visualización del microorganismo en las muestras.

3. El microscopio óptico es el más utilizado en los laboratorios de microbiología de forma
rutinaria. También pueden emplearse el de campo oscuro, contraste de
fases, fluorescencia o electrónico.
El examen microscópico requiere la utilización del microscopio. Puede hacerse una
visualización microscópica en 2 momentos: a) directamente de la muestra clínica y b) a
partir de los microorganismos obtenidos por cultivo como primer escalón en la
identificación.
¿Cómo se pueden ver los microorganismos?

4. Puede realizarse
1-Directamente: examen en fresco. Se estudian las bacterias "al natural", sin teñir. Tiene el
inconveniente de que las bacterias tienen una densidad óptica similar a la del agua
(transparentes) por lo que es difícil examinarlas.

5. 2-Mediante una técnica denominada gota pendiente que se utiliza para observar la
movilidad.
3-Tinciones negativas (Tinta china). No son una verdadera tinción. Se llaman así porque
lo que realmente se tiñe es el fondo sobre el que están los microorganismos apareciendo los
microorganismos sin teñir. Se emplea para ver la cápsula de S. pneumoniae y Cryptococcus
neoformans en LCR.

6. 4-Tinciones. Existen muchas y en general se pueden clasificar en:
4.1. simples (utilizan un solo colorante). Por ejemplo: azul de metileno para observación de
levaduras y protozoos intestinales
4.2. diferenciales (utilizan más de un colorante y permiten la agrupación de las bacterias de
acuerdo a su diferente afinidad tintorial). Destacan la tinción de Gram que agrupa a las
bacterias en dos grandes bloques, bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas, y la
deZiehl-Neelsen utilizada, entre otros, para la tinción de micobacterias.

7. 4.3. especiales: tinciones fluorescentes, tinciones de determinadas estructuras como la
tinción del esporo, tinción de flagelos...
Tinción de Gram:

8. PASOS GRAMPOSITIVAS GRAMNEGATIVAS
Colorante
principal: cristal violeta
Violeta Violeta
Mordiente: Lugol Violeta Violeta
Decolorante: alcohol-
acetona
Violeta “Transparente”
Colorante de
contraste:safranina
Violeta Rojo
¿Cómo se ven las bacterias tras realizar una tinción de Gram?
A través de la tinción de Gram pueden valorarse la afinidad tintorial, forma y
agrupaciones de las bacterias.
-Afinidad tintorial. Permite dividir a las bacterias en 1) grampositivas (violetas)
que retienen el colorante principal tras la decoloración con alcohol o alcohol-acetona y 2)
gramnegativas (rojas) que pierden el colorante principal tras la decoloración por lo que es
necesario aplicar un colorante de contraste para visualizarlas. Esta diferencia de coloración
está basada en la diferencia estructural de la pared. En las grampositivas el colorante se fija
fuertemente al peptidoglicano que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante. En
las gramnegativas el colorante es retenido con menos fuerza al ser más delgada la capa de
peptidoglicano. Además la mayor cantidad de lípidos presentes hace que el colorante se
elimine al solubiliarse los lípidos en el alcohol.
- Pueden tener diferentes formas:
- esféricas: cocos (Streptococcus spp., Staphylococcus spp., etc)
- cilíndricas: bacilos (enterobacterias, Pseudomonasspp., etc...)
- espiroquetas: Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi
- Pueden aparecer aisladas o asociarse en parejas [diplococcos: (Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae)], cadenas (estreptococcos), tetradas, sarcinas,
racimos (estafilococos), "letras chinas" (corinebacterias), etc

9. - Tamaño: las bacterias se miden en µmetros (1µmetro = 10-3 mm) y, en general y como
ejemplo, las bacterias esféricas tienen un diámetro de 1µm y las bacterias alargadas 1.5-8
µm de longitud, aunque este parámetro varía en función de los diferentes géneros
bacterianos.
Cocos grampositivos
Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos

10. Visualización de la tinción de Gram
2.- Aislamiento en cultivo y posterior identificación por sus características fenotípicas
(morfología, características metabólicas -pruebas bioquímicas y enzimáticas-, etc.)
¿Cómo se cultivan en el laboratorio?
Se utilizan medios de cultivo compuestos por una mezcla de nutrientes (proteínas,
hidratos de carbono, minerales, oligoelementos...) que permiten el crecimiento de las
bacterias en el laboratorio, in vitro.
Los medios de cultivo pueden clasificarse atendiendo a varios parámetros:
a) Según su origen pueden ser 1) naturales: constituidos por sustancias naturales de
composición compleja y en ocasiones variable (extracto de carne, extracto de levadura,
patata...), 2) sintéticos o químicamente definidos en los que se conoce la participación
exacta de hidratos de carbono, aminoácidos.... y 3) semisintéticos.
b) Según su consistencia pueden ser 1) líquidos, 2) sólidos: son medios líquidos a los que
se les añade para darles consistencia una sustancia gelificante (agar-agar) obtenida de algas
marinas y 3) semisólidos: líquidos a los que se les añade menor concentración de agar que a
los sólidos.
Cada uno tiene sus finalidades. En la superficie de los medios sólidos es posible ver
las colonias resultantes de la multiplicación bacteriana. Los medios líquidos facilitan el
crecimiento de las bacterias pero en ellos no se ven colonias, el crecimiento suele detectarse
por turbidez. Los medios semisólidos suelen utilizarse para valorar la movilidad de los
microorganismos.
c) De acuerdo a su finalidad y aplicación pueden ser:
1.- Básicos: aquellos que llevan todos los elementos básicos para el desarrollo de los
microorganismos no exigentes.
2.- Enriquecidos: incorporan diferentes sustancias para permitir el crecimiento de
microorganismos más exigentes. Ej.: agar sangre, agar chocolate,...

11. 3.- Selectivos: medios a los que se añaden diferentes sustancias (colorantes, sales biliares,
antibióticos...) que son capaces de inhibir a determinados microorganismos y permitir el
crecimiento de otros. En general se utilizan para inhibir el crecimiento de la flora
acompañante y permitir el crecimiento del patógeno. También colaboran en la
identificación pues proporcionan un parámetro más: “no se inhibe por...”
4.- Diferenciales: se les añade un hidrato de carbono y un indicados de pH de forma que si
el microorganismo es capaz de utilizar ese hidrato de carbono se produce un cambio de pH
que hace que el indicador cambie de color y evidencie la reacción. Así las colonias son
fácilmente reconocibles por su color.

12. 5.- Otros medios: de enriquecimiento (son medios líquidos a los que se les añades
sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos acompañantes favoreciendo el
crecimiento de otros (los patógenos buscados), de transporte, etc.
Siembra de los medios de cultivo
Lo primero que hay que hacer es sembrar la muestra en los medios de cultivo
reseñados. Una vez cultivada se procede al aislamiento en cultivo y posterior identificación
por sus características fenotípicas (morfología, características metabólicas -pruebas
bioquímicas y enzimáticas-, etc.).
Prodecimientos de siembra 1
Procedimientos de siembra 2
Esquemas
Cuando la siembra se realiza a partir de un cultivo debe obtenerse una pequeña porción del
mismo.
Condiciones de cultivo

13. -Temperatura: la mayoría crecen bien a temperaturas entre 35-37ºC aunque hay
excepciones
-Tiempo de incubación: depende del tiempo de generación (tiempo requerido para que el
número de bacterias se duplique) de cada microorganismo. Generalmente 18-24 h. Otros
requieren más tiempo de incubación: Brucella spp. , M. tuberculosis.
-Atmósfera de incubación. Los microorganismos respecto al tipo de respiración pueden
ser:
1.- Aerobios: requieren la presencia de oxígeno molecular.
2.- Anaerobios facultativos: pueden vivir y multiplicarse en presencia o en ausencia de
oxígeno.
3.- Anaerobios: el oxígeno libre es tóxico para ellos (algunos son aerotolerantes).
4.- Microaerofilos: necesitan la presencia de oxígeno libre pero a una concentración menor
que la atmosférica (2-10%).
Este hecho tiene como consecuencia que haya que incubarlos en estas condiciones.
Otros hay que incubarlos en una atmósfera con un 5-10% de CO2 (no es tipo de respiración
sino un requerimiento): se denominan capnófilos

14. Identificación
Se valoran entre otros parámetros:
1) morfología y aspecto de las colonias (masa constituida por bacterias que es
visible a simple viste en la superficie de los medios sólidos).
2) capacidad de crecer a una determinada temperatura
3) crecimiento en medios selectivos y diferenciales

15. 4) presencia de hemólisis que en los medios con sangre da lugar a la aparición de un
halo alrededor de la colonia. Puede ser transparente (hemólisis total o ß-hemólisis), verdoso
(hemólisis parcial o α-hemólisis o no aparecer (no hemolíticas o γ–hemólisis)
5) pruebas bioquímicas y enzimáticas adecuadas para la bacteria que se sospeche
por las pruebas preliminares

16. 6) movilidad

17. 3.- detección de productos estructurales: antígenos (reacciones antígeno-anticuerpo),
ácidos nucleicos (hibridación, PCR, etc)

18. 3.1. detección de antígenos se verán con más detalle al estudiar las reacciones antígeno-
anticuerpo
3.2. técnicas genéticas de detección de ácidos nucleicos: hibridación, Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR), etc.
3.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
En 1983, Kary Mullis dio a conocer la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
que es una técnica para la síntesis in vitro de secuencias específicas de DNA evitandop de
esta forma uno de los principales problemas que se planteaban que era la insuficiente
cantidad de ADN para realizar ciualquier procedimiento de laboratorio.
La técnica se basa en la replicación del ADN inducida por la DNA polimerasa, enzima que
es capaz de real9izar una síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5´->
3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para
crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una
pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de
los extremos 3´ del fragmento de ADN que se desea amplificar.
Partiendo de este principio, la PCR se basa en la repetición de ciclos que están formados
por tres etapas:

19. 1.- Desnaturalización del ADN doble cadena: la doble hélice de ADN se separa en dos
hebras. Para ello se realiza una incubación de lamuestra a altas temperaturas (93-97ºC). La
renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
2.- Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras: los
cebadores, iniciadores o primers se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el
fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º
C).
3.- Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa (elongación): se produce la
síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la
complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual
incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde.
Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador que realiza los ciclos en
los tiempos y temperaturas programadas.
Esquemas de trabajo

21. Elementos químicos necesarios para realizar la PCR

22. Termociclador
Carga de un gel de agarosa

23. Lectura de un gel de agarosa, teñido con bromuro de etidio, bajo la luz ultravioleta
3.2.2. Hibridación
La hibridación o renaturalización de ácidos nucleicos (ARN o ADN) es un proceso por el
cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases
complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble
hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.
Se utiliza una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea
radiactivo o con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida
y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de
secuencia parecida.
En el esquema está representado el fundamento de la técnica.

24. Para saber más
4.- detección de productos metabólicos: Cromatografía (anaerobios, micobacterias), ATP
bacteriano (bioluminiscencia), toxinas, etc.
4.1. cromatografía se basa en la identificación de microorganismos a partir de productos
de su metabolismo (alcoholes, ácidos grasos) o de componentes de la pared celular. Se
emplea sobre todo para la identificación de micobacterias y anaerobios.

25. Algunas de estas técnicas como la PCR pueden utilizarse para realizar el
diagnóstico directamente sobre la muestra clínica sin necesidad de hacer un cultivo previo.
REACCIONES ANTÍGENO ANTICUERPO
Son estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción antígeno-
anticuerpo producida en el laboratorio ha tenido lugar. Se basan en la especificidad de la
reacción, es decir, en que un anticuerpo sólo reaccionará con el antígeno que haya dado
lugar a su formación.
Pueden utilizarse para realizar tanto diagnóstico directo como indirecto. Si
conocemos el anticuerpo (están disponibles en el laboratorio, por ej. anticuerpos
monoclonales) podremos identificar el antígeno (en la muestra clínica) que reacciona
específicamente con él: diagnóstico directo.
Ejemplo de identificación serológica de estreptococos del grupo A (parte 1)
Ejemplo de identificación serológica de estreptococos del grupo A (parte 2)
La inmunofluorescencia es una técnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos.
Los fluorocromos son moléculas que al ser excitadas con la energía de una determinada
longitud de onda son capaces de emitir energía de una longitud de onda mayor.
Una de las técnicas más utilizadas es la Inmunofluorescencia Directa que permite la
detección de antígenos en un paso. Utiliza anticuerpos conjugados a isotiocianato de
fluoresceína. La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia, que emite luz
ultravioleta de una determinada longitud de onda.
Reacción positiva
Reacción negativa
La inmunofluorescencia indirecta permite la detección de anticuerpos circulantes. Si el
antígeno es conocido (disponible en el laboratorio), detectaremos los anticuerpos que se
encuentran en la muestra clínica y por tanto son desconocidos y que reaccionan
específicamente con ellos: diagnóstico indirecto.

26. Otras técnicas que se emplean en el diagnóstico microbiológico directo son: detección de
antígeno capsular mediante técnicas de aglutinación con anticuerpos unido a partículas de
látex, CIE, RIA y EIA. La descripción de estas técnicas se verán en la práctica 5.