Seminario de Biología Molecular

1. MUTATION OF RUBIE, A NOVEL LONG NON-CODING RNA LOCATED
UPSTREAM OF Bmp4, CAUSES VESTIBULAR MALFORMATION IN
MICE
Kristina A. Roberts, Victoria E. Abraira, Andrew F. Tucker, Lisa V. Goodrich, Nancy C.
Andrews
Andrea Pérez Jaramillo
Anny Sarria Mena
3rd Semester Students
Molecular Biology

2. INTRODUCTION
VESTIBULAR FUNCTION
APPARATUS SENSING MOTION AND
HEAD POSITION
SEMICIRCULAR
CANALS
DYNAMIC BALANCE
CRISTAE
AMPULLARES RESPONDS TO THE
ROTATIONAL
MOVEMENTS
In the ECL mice, a
• Debilitating dizziness . malformation of the
VESTIBULAR • Imbalance in human. lateral semicircular canal
ABNORMALITIES • Circling behavior in brings circling and
mice. hyperactivity result.

3. Epistatic
RUBIE
MUTATION Circler
ECL
CIRCLING
Complex mouse
mutant discovered in Interaction of: C57L alleles at
a multi-generation • RECESSIVE modifier loci on
intercross population Chromosome 14 chromosomes 3 and
derived from SWR 13 increase the
wildtypes SWR/J and • DOMINANT circling risk.
C57/J mice. Chromosome 4=
C57L

4. Mouse chromosome Essential gene for proper
substitution strain that vestibular development and It
genetically resembles ECL , and is located upstream of bone
exhibits similar behavioral and morphogenetic protein 4.
structural abnormalities.
Bmp4
It isn’t an ECL candidate, but a Is regulating for the novel
long, non-coding RNA (ncRNA) ncRNA , its expression is
It is co-expressed with this in disrupted by a SWR-specific
developing semicircular canals. endogenous retrovirus.

5. GENERAL OBJECTIVE
Identify the genes that are
involved in the generation
of three- dimensional
structures in the inner ear
and explain their
functions to better
understanding the inner
ear mophogenesis highly
process.

6. MATERIALS AND METHODS
ÉTICA
La experimentación se llevó a cabo de
acuerdo con los protocolos aprobados por el
Hospital Infantil de Boston , de la Universidad
Institucional Cuidado Animal Duke y de los
Comités de Uso (protocolo A091-11-04), de
acuerdo con las directrices nacionales e
internacionales de animales:. CSS-14 el
desarrollo de la cepa se realizó en base a
honorarios por servicio de Laboratorio Charles
River (CRL).

7. CLONACIÓN POSICIONAL
Estrategia para la identificación de enfermedades genéticas que localiza al
gen responsable basándose únicamente en su posición cromosómica.
ANÁLISIS DE LIGAMENTO Identificar y estrechar intervalo que alberga el
gen enfermo en un cromosoma.
• Se relaciona n las transcripciones llevadas a cabo dentro del intervalo
con la enfermedad en cuestión
• Indentificar el cromosoma 14 del cual se deriva el gen recesivo SWR/J por
medio del CSS-14 que es un ratón desarrollado por sustitución de cepas que
tiene un gen SWR/J en el cromosoma 14 y un gen C57BL/10J .
• El intervalo se encuentra arriba de la morfogénesis de la proteína 4 (Bmp4) que
contiene una secuencia no codificada de ADN conocida como RUBIE (RNA
upstream of Bmp4 expressed in inner ear).

8. DESARROLLO DE CEPAS POR MARCADORES DE ADN NUCLEAR
1. MICROSATÉLITE UTILIDAD
Se tomaron dos generaciones N2 y N5 que fueron una alta tasa de
genotificadas usando un marcador de panel mutación y naturaleza
microsatélite 99 que contenía D14Mit 126, codominante, permite
D14Mit60, D14Mit157 and D14Mit228. identificar la diversidad
genética dentro y entre
N2-N5 A cada una se le escoge un ratón razas, además de la
reproductor de todas las generaciones de hijos que mezcla genética entre
llevan un gen SWR/J no recombinado en el razas aún cuando esten
cromosoma 14 y entrecruzamiento de C57BL/10J. estrechamente
• Otro entrecruzamiento fue llevado a cabo fuera emparentadas.
de la colonia antes de la experimentación.

9. DESARROLLO DE CEPAS POR MARCADORES DE ADN NUCLEAR
2. SNP= POLIMORFISMO DE UN UTILIDAD
SOLO NUCLEÓTIDO Con el SNPs de puede hallar
cuantitativamente (100%) la
El análisis de 455 SNPs confirmó probabilidad de que una sustitución
de bases en un fragmento de ADN en
que los antecedentes genéticos el gen C57BL/10J pueda estar
del CSS-14 fue del 100% derivado estrechamente relacionado con la
de C57BL/10J y que la respuesta a la enfermedad en
introgresión genética de SWR/J en cuestión, además en cuanto a la
el cromosoma 14 abarca un introgresión genética en el gen SWR/J
hay un intervalo que es mínimo
intervalo mínimo de 92,8 Mb, que donde puede haber alguna
se extiende desde dbSNP infiltración de genes de una población
rs3710916 (8.8 Mb) para hacia otra de diferente especie.
rs6179144 (101,6 Mb).

10. GENOTIPIFICACIÓN DE CSS-14
PREPARACIÓN DEL GENOMA
QIAGEN Dneasy Blood SSLP: POLIMORFISMOS DE
&Tissue Kit LONGITUD DE SECUENCIA
Purificación de ADN SSLP se encontraron
a partir de muestras entre C57BL/10J y Mantenimient
de tejidos o sangre SWR/J.
o de las cepas
en este caso de cola
y la posición
de ratón, este ADN
de la
esta libre de
SSLP se encontraron clonación.
inhibidores de la PCR
entre D14Mit129 y
para futuras D14Mit60.
investigaciones.

11. FIJADOR BODIAN
5% Ác.acético glacial
5% Formalina
75% Etanol
15% Agua
12.25 EMBRIONES Y LAS DURANTE LA NOCHE
HEMIDISECCIONES DE CABEZAS A 4°C
LATEX DESHIDRATAR EN ETANOL AL ETANOL
100% DURANTE LA NOCHE A
BLANCO T° AMBIENTE Y ACLARAR
DILUÍDO CON SALICILATO DE METILO 100%
A 0.025%
LAVAR DURANTE 10 MINUTOS
SALICILATO DE METILO

12. EXPRESIÓN Y ANÁLISIS DE RUBIE
• RNA STAT-60 Extracción de ARN del tejido congelado.
1 • El ARN esta libre de proteínas y de contaminación de ADN.
• Tratamiento con DNAasa I para remover el DNA genómico contaminado, a partir de la muestra de ARN.
2
• EXTRACCIÓN CON FENOL CLOROFORMOObtención de ADN libre de proteínas y enzimas.
3
• RT-PCR (Reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa) Amplificación y formación de ADNc (ADN
complementario).
• Técnica de cebadores aleatorios Obtención de segmentos cortos de ADN de cadena simple y saber las posibles
4
combinaciones de base que se pueden hacer.
•PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Realizar muchas copias de un segmento de de ADN a partir de una
5 cantidad muy pequeña de éste, en la cual los cebadores o iniciadores son Rubie y Actb.
•Tratamiento con gel de agarosa en Electroforesis.
•QIAGEN Gel extraction Kit Purificación de productos PCR >100 pb eliminando impurezas de la muestra de ADN
6
•Secuenciación

13. HIBRIDACIÓN IN-SITU
Se realizó en pequeñas secciones (10-12 µm) de las cabezas
de embriones E11.5.
La sonda Rubie fue amplificada de la plantilla del clon
RIKEN F930028D17 usando cebadores en exones 2 y 5.
La sonda Bmp4 fue generada usando una plantilla que
corresponde a las primeras 293pb del exon 4.

14. Colocar células en filtro Lisar células para liberar DNA
específico.
Desnaturalizar el DNA
Añadir la
sonda
marcada.
Hibridar sonda con DNA desnaturalizado Detectar señal emitida por la sonda

16. MATERIALES Y MÉTODOS
INSERCIÓN DE MAPEO DE RUBIE Y ANALISIS DE SECUENCIACIÓN
1. La inserción de retrovirus endógenos en el
intron 1 de Rubie, fue respresentada por
analisis de PCR del DNA genomico de
SWR/J y C57BL/10J.
2. En cada PCR, se evaluó la amplificación en
SWR/J y C57BL/10J como presente o
ausente por medio de electroforesis con gel
de agarosa.
3. Amplificacion por medio de Long PCR
System (Roche), que permite:
• Amplificar secuencias largas y precisas a
partir de una plantilla de ADN mediante
PCR.
• Lograr un mayor rendimiento y fidelidad
• Mejorar la eficiencia de la PCR.

17. MATERIALES Y MÉTODOS
SECUENCIACIÓN
SWR/J PCR C57BL/10J PCR
• Bandas purificadas por • Fueron secuenciados
QIAGEN Gel Extraction Kit. directamente.
• Fueron clonados dentro del
vectorpCR-XL-TOPO
• Secuenciación por “Primer
Walking”
Secuencias largas de ADN se
fragmentan, el ADN de interés
es el producto del PCR.

19. ANÁLISIS DE EMPALME
INICIADORES
2. Primers en
AMPLIFICACION dirección
Realizado en el 1. Primers en contraria
DE ADN
cDNA del oído el exon 1 de específico para
MEDIANTE
interno. RUBIE retrovirus
SEMIENCAJE PCR
endógeno ETnII-β
AMPLIFICACIÓN

20. RESULTADOS

21. Generación de una Cepa de
Cromosomas Sustituidos que muestra un
Comportamiento Circular
SWR/J (Chr 14
14) + R hetero.
C57BL/10J CSS-
(B10) (Chr14B10/
SWR fondo
B10/B10)
C57BL/10J-
Chr14SWR/
J (CSS-14) No mostró anormalidades en
la conducta.
Muestran hiperactividad y círculos bidireccionales que eran
evidentes antes del destete y se mantuvo durante toda la vida.

22. CSS-14 Circular.
Prueba de la malformación del canal
semicircular lateral
Se visualiza el oído interno de los cachorros de
Chr14B10/SWR Chr14SWR/SWR en el día
postnatal 0 (P0) con técnica Paint Fill
estándar muestran la morfología normal con
LSC intactos.
Confirma que el CSS-14 y ECL círcular son
causados ​por el mismo tipo de malformaciones
estructurales y se apoya la conclusión de
que tanto el ratón modelo como el CSS-14 es
resultado del mismo defecto genético.

23. Figura 1
CSS-14 exposición
de la malformación
circular del canal
semicircular
lateral.

24. Rubie es una Larga Cadena de ARN no
codificado expresado en el
desarrollo Canales Semicirculares
• BY232928 se encuentra arriba de
Bmp4, dentro de una región
genómica se demostró que
es importante para la expresión
Bmp4 en el desarrollo del
oído interno.
• Se confirmó la expresión
de Rubie en embriones
y postnatales (P6) oído interno por
RT-PCR

25. • Rubie es una transcripción empalmada y poliadenilato,
que se cree funciona como un ARNm (ncRNA) , pero se
presenta una falta de características, por tanto se define
por su incapacidad para exhibir las proteínas que
codifican estas características.
• Está involucrado en la regulación de la expresión génica
y el desarrollo del oído interno.

26. Figura 3.
Secuencia y análisis de expresión de Rubie.

27. Un Retrovirus Endógeno ROE-
específico, interrumpe la expresión y el
Splicing del Rubie
• Rubie se expresa en el desarrollo de los canales
semicirculares. Se ha descubierto que el alelo SWR / J
de Rubie se ve interrumpido por un retrovirus
endógeno intrónico que causa un aberrante Splicing y
una poliadenilación prematura de la transcripción.
• Inserciones de Intronic ETnII-beta, se ha demostrado que
alteran la transcripción de dos formas:
 Por la aberrante secuencia de ERV de empalme en la
transcripción.
 El acoplamiento de aberrante empalme con el splicing de
poliadenilación en el ERV.

28. Figura 5.
La interrupción de Rubie por
un retrovirus endógeno SWR-específica

29. RESULTADO GENERAL
• Bmp4 es esencial para un
desarrollo vestibular adecuado, se dice
que Rubie es el gen mutado en los
ratones Ecl, que está implicado en la
regulación de la expresión de Bmp4 oído
interno, y que la expresión aberrante
de Bmp4 contribuye al fenotipo de ECL .

30. DISCUSSION
Author’s Name ¿What the author said? Is it related with the study
YES NOT
Pregizer S, Mortlock Bmp4, like other BMPs, regulates
DP, et al. many developmental processes
and displays numerous
spatiotemporal-specific
expression patterns throughout
development, are controlled by
multiple tissue-specific, which are
often located far from the coding
regions and promoters of the
genes they regulate.

31. -Chang W, Lin Z, The expression patterns
Kulessa H, Hebert of Rubie and Bmp4 are nearly
J, Hogan BL, et al. identical in developing inner ears
-Vervoort R,
and the anatomical phenotype of
Ceulemans H, Van
mice haploinsufficient
Aerschot L,
D'Hooge R, David for Bmp4 is indistinguishable
G, et al. from that of Ecl mice and CSS-14
circlers.
Chandler KJ, While global Bmp4 deletion
Chandler RL, causes embryonic lethality, it has
Mortlock DP, et al. been suggested that genetic
variation within cis-regulatory
elements might affect tissue-
specific Bmp4 expression and
result in tissue- or organ-
restricted developmental defects.

32. Cowan CA, It remains to be determined
Yokoyama N, Bianchi whether the chromosome
LM, Henkemeyer M, 4 Ecl gene influences BMP
Fritzsch B, et al.
signaling or operates through a
parallel pathway also necessary
for canal morphogenesis.

33. CONCLUSIONS
• It is very important to understand the auditory functions,
elucidate how these may be affected and that brings
consequences each polymorphism within the inner ear, since
being an organ as sensitive and important, is very susceptible
to injury, leaving serious disorders balance and proprioception.
• It is crucial to understand the process by which retroviruses and
other pathogens attack, and in this way to create technical and
/ or drugs to combat and help so many people to have a good
quality of life.

34. • And not only pathogens but also embryonic malformations,
since this problem has a fairly high incidence worldwide, for
that reason correct his condition would be very important for
the whole population.
• It should also into account, the characteristics of each
strain to identify where and how to fix the damage, because
all have different patterns that determine the expression of
genes and development.

35. MAPA CONCEPTUAL

36. MAPA CONCEPTUAL