ADN: Estructura y Fuerzas Estabilizantes. 3

1. ADN: Estructura y Fuerzas
Estabilizantes
Dr. Daniel Corach
Elementos de genética y Biología Molecular
11 de Agosto de 2008
Curso EGBM 2008

2. La Cinética de
Reasociación mide la
Complejidad de las
Secuencias

3. Cinética de Reasociación
• Genoma Procariótico
• Curva de reasociación
simple.
• La reacción se
completa en un rango
de Cot reducido (2
ordenes de magnitud)

4. Reasociación, Annealing, Hibridación
de Acidos Nucleicos: Curvas Cot
Co x t1/2
Reasociacion más Lenta
• Las primeras en encontrar su complentarias y asociar son secuencias simples de ADN.
• Cinética de 2° orden, la asociación más rápida se produce entre las secuencias simples.
• La Clase más lenta la constituyen el ADN de copia única que constituye la mayoría de los
genes.
• Cot refleja la cantidad de una familia de secuencias en el genoma.

5. Experimentos de Reasociación
revelan 3 fracciones principales en el
ADN eucariótico.
• ADN Copia Unica (50-60%)
• Contiene la mayoría de las secuencias codificantes.
• ADN Moderadamente-repetido/repetición-
intermedia(25-40%)
• Incluye elementos mobiles de ADN.
• ADN altamente repetido/Secuencias simples/ADN
Satélite (10-15%)

6. Tipos de ADN en cada componente cinético
ADN Genómico Humano
0
”Plegadoquot;
Más de 106 de secuencias de ADN satélite
Alrededor de 1 million de copias de repeticiones Alu, c/u 0.3 kb
fracción reasociada
0.25 Alrededor de 50,000 copias de repeticiones L1
(longitud: 0.2 a 7 kb), más 1000 a
10,000 copias de al menos10 otras
familias de repeticiones dispersas
intermedias de ADN
0.50
Miles de repeticiones de genes de rRNA
0.75
Entre 50,000 at 100,000 genes ”cpia únicaquot;
1.00
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5
Cot

7. Cinética de Reasociación
1.0
Fracción AND Procariota
que
Permanec AND
Repetido Unique
e Mono Secuencia
Cadena 0.5 compleja
ADN Eucariota
(C/Co) de ADN
0
10-4 10-3 10-2 10-1 1 101 102 103 104
Cot (mole x seg./l)

8. Cinética de Reasociación
1.0
Fracci Mayor valor
ón que
Perma
de Cot1/2
nece indica mayor
Mono complejidad
Caden 0.5
a Cot1/2 genómica
(C/C0)
0
10-4 10-3 10-2 10-1 1 101 102 103 104
Cot (mole x seg./l)

9. ADN Repetido
Organism % ADN Repetido
Homo sapiens 21 %
Ratón 35 %
B. taurus 42 %
Drosophila 70 %
Trigo 42 %
Arveja 52 %
Maiz 60 %
Saccharomycetes cerevisiae 5%
E. coli 0.3 %

10. ADN satélite
• Más 1 x 106
copias/genoma,
• Unidades de
repetición cortas
aprox. 100pb.
• Sin función
conocida.
• Organizados en
tandem

11. Complejidad de Secuencia no
es lo mismo que longitud.
• Complejidad es el número de pares de bases de
una secuencia de ADN única no repetida.
• Ejemplo:. considere ADN de 1000 pb.
• 500 pb: secuencia a, presente en copia única.
• 500 pb secuencia b (100 bp) repetida 5X
a b b b b b
|___________|__|__|__|__|__|
L = longitud = 1000 pb = a + 5b
N = complejidad = 600 pb = a + b

12. ADN menos complejo reasocia
más rápido
Sea a, b, ... z una cadena de pares de bases en un ADN que puede hibridar.
Para simplificar,asignaremos 10 pb por letra.
ADN 1 = ab. Muy baja complejidad de secuencia, 2 letras o 20 bp.
ADN 2 = cdefghijklmnopqrstuv. 10 veces más complejo (20 letras o 200 pb).
ADN 3 =
izyajczkblqfreighttrainrunninsofastelizabethcottonqwftzxvbifyoudontbelieveiml
eavingyoujustcountthedaysimgonerxcvwpowentdowntothecrossroadstriedtoc
atchariderobertjohnsonpzvmwcomeonhomeintomykitchentrad.
100 veces más complejo (200 letras o 2000 pb).

13. ADN menos complejo reasocia
ADN 1
más rápido ADN 3
ADN 2
ab ab ab ab ab
ab ab ab ab ab cdefghijklmnopqrstuv
ab ab ab ab ab cdefghijklmnopqrstuv
ab ab ab ab ab
cdefghijklmnopqrstuv
ab ab ab ab ab
cdefghijklmnopqrstuv
ab ab ab ab ab
ab ab ab ab ab
ab ab ab ab ab
etc.
izyajczkblqfreighttrainrunninsofastelizabethcottonqwf
tzxvbifyoudontbelieveimleavingyoujustcountthedaysi
mgonerxcvwpowentdowntothecrossroadstriedtocatch
Para una igual masa/vol: ariderobertjohnsonpzvmwcomeonhomeintomykitche
ntrad
Concentración Molar de cada secuencia:
150 microM 15 microM 1.5 microM
Velocidad relativa de Reasociación
100 10 1

14. Cinética de Reasociación es una
Reacción de 2ndo orden.
nucleación “zippering”
+
2ndo 1er
orden orden
lento ,rápido
ADN desnaturalizado Un pequeño ADN reasociado
dos cadenas separadas duplex se forma en (2 cadenas en duplex)
una región
complementaria

15. Ecuaciones que describen la
Reasociación
Sea C = concentración de ADN monocatenario a tiempo t
(expresado como moles de nucleotidos por litro).
La velocidad de desaparición de ADN monocadenas(mc)
durante la reasociación está dada por la ecuación de 2do orden
− dC dC
= kC 2 or 2
= −kdt
dt C
Resolviendo la ecuación diferencial tendremos:
C 1
=
C 0 1 + kC 0 t

16. El tiempo requerido para alcanzar el 50% de
reasociación es inversamente proporcional a la
constante de velocidad de la reacción
C 1
=
C 0 1 + kC 0 t
Reasociación 1/2, C
= 0.5, and t = t 1/ 2
C0
1
C 0 t1 / 2 =
k
k en litros (mole nt)-1 seg-1

17. Constante de Velocidad es Inversamente
Proporcional a la complejidad de
secuencia
L L = longitudh; N = complejidad
k α
N
Empiricamente, la constante de velocidad k es medida como:
5 L
k = 3 × 10
N
En 1.0 M Na+ a T = Tm - 25oC

18. El Tiempo requerido para la Reasociación 1/2 es
directamente proporcional a la complejidad de
secuencia.
N
C0 t 12 α (4)
L
Para una medida de reasociación, normalmente se rompe el
ADN hasta una longitud de fragmentos cosntante L (v.g. 400 bp).
Entonces Lno es más variable y
C0 t 1 2 α N (5)
N
desconocido C0 t 12desconocido
standard
= standard
(6)
N C0 t 12
V.g. E. coli N = 4.639 x 106 pb

19. El Tiempo de Reasociación es Proporcional a la Complexidad del genoma
Tamaño
1 10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010
del genoma
0
Fracción reasociada
Poli U/ Satélite MS2 T4 E. coli Vaca
0.5 Poli A De ratón
1.0
10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 10 100 1K 10K
c0t (mole/L • segc)
Tiempo creciente de reasociación

20. Secuencias Repetidas Invertidas

21. Formación de Tallo-Rulo
(Stem-loops)

22. Secuencias Repetidas Agrupadas
Idiograma de
Cromosomas Humanos
Con bandeo-G
Repeticiones en
Tandem sobre
todos los cromosomas:
Telomeros
Centromeros
5 clusters de repeticiones de genes de ARNr:
Brazos cortos (p) de cromsomas: 13, 14, 15, 21, 22

23. Genoma
• El genoma es todo el ADN de una célula.
– Todo el ADN de todos los cromosomas.
– Incluye genes, secuencias intergénicas y
repetidas.
• Es todo el ADN de una organela.
• Los Eucariotas pueden tener 2-3 genomas
– Genoma Nuclear
– Genoma Mitocondrial
– Genoma de los Plástidos
– Si no se especifica , “genoma” habitualmente se refiere al genoma nuclear .

24. Genoma Humano
• 22 pares autosomas +
2 cromosomas
sexuales
• 3 mil millones de pb en
el genoma haploide
• Donde y cómo están
los 30,000 a 40,000
genes?
Del NCBI web site, foto de T. Ried,
Natl Human Genome Research Institute, NIH

25. Componentes del Genoma
Humano
• El Genoma Humano tiene 3.2 X 109
pares de bases en el DNA
• Aproximadamente el 3% codifica para
proteinas
• Entre 40-50% es repetido, originado por
(retro) transposición
• Cuál es la función del 50% restante?.

26. Gran Parte del ADN en Eucariotas
es no-codificante
• Los genomas complejos tienen alrededor de 10x a 30x más
ADN que el requerido para codificar todos los ARNs o proteinas
de un organismo.
• Secuencias que contribuyen con las no codificantes::
– Intrones en los genes
– Secuencias reguladoras
– Copias multiples silenciosas de genes, incluyen
pseudogenes
– Secuencias Intergenicas
– Repeticiones dispersas.
– ADN satélites

27. Existen Varios Tipos de ADNs, Muchos
de los Cuales No se Transcriben
Clasificación del ADN Eucariota
• ADN Codificante
• ADN No Codificante

28. Existen Varios Tipos de ADNs, Muchos
de los Cuales No se Transcriben
ADN Codificante
• Genes Codificantes de Proteinas
– Genes solitarios
– Genes duplicados y divergentes (familias
génicas funcionales y pseudogenes no
funcionales)
• Genes Repetidos en Tandem codificantes de
ARNr, 5S ARNr, ARNt e Histonas.

29. Existen Varios Tipos de ADNs, Muchos de
los Cuales No se Transcriben
ADN NO Codificante
• ADN de secuencia simple (ADN satélite)
• ADN moderadamente repetido (elementos de
ADN móbiles)
– Transposones.
– Retrotransposones virales.
– Elementos dispersos largos (LINES) retrotransposones no-
virales.
– Elementos dispersos cortos (SINES) retrotransposones no-
virales
– Espaciadores no clasificados

30. La Mayoría de los Elementos
Transponibles de Mamíferos Caen en
una de 4 Clases

31. Elementos Interdispersos Repetidos Cortos:
SINEs
• Ejemplo: Repeticiones Alu
– Repeticiones muy abundantes en primates
– Cortos, aproximadamente 300 pb
– Alrededor de 1 million de copias.
– Posiblemente derivado del gen codificante del 7SL ARN
– Causa nuevas mutaciones en humanos.
• Son retrotranposones
– Segmentos de ADN que se mueven via ARN intermediario.
• MIRs: Repeticiones Dispersas de Mamiferos
– SINES hallados en mamiferos
• Retroposones cortos Analogos se hallaron en genomas de todos los
vertebrados

32. Elementos Repetidos Dispersos Largos:
LINEs
• Repeticiones largas moderadamente abundantes
– Familia LINE 1: más abundante
– Hasta de 7000 pb de longitud
– Alrededor de 50,000 copias
• Retrotransposones
– Codifican para transcriptasa reversa y otras enzimas necesarias
para la transposición.
– Sin repeticiones terminales largas (LTRs)
• Pueden producir nuevas mutaciones en humanos.
• Repeticiones homologas se hallan en todos los mamiferos
y muchos otros animales.

33. Otras Repeticiones Dispersas
Comunes en Humanos
• Retrotransposones conteniendo-LTR
– MaLR: retrotransposones con LTR de mamíferos
– Retrovirus Endógenos
– MER4 (Medium Reiterated repeat, familia 4)
• Repeticiones que se parecen a transposones de
DNA
– MER1 and MER2
– Repeticiones Mariner

34. ADN Móvil
• Secuencias moderadamente repetidas, y de ADN móvil estan
dispersas en todo el genoma de procariotas, plantas y
animales.
• Estas secuencias varian en tamaño de cientos a unos pocos
miles de pb de longitud.
• Las secuencias son copias insertadas en un nuevo lugar del
genoma mediante un proceso de transposición.
• Estas secuencias no parecen participar en función alguna.

35. Elementos de ADN Móvil Probablemente
Tengan una Influencia Importante en
Evolución
• Mutaciones espontáneas pueden resultar de la inserción de un elementos móvil
de ADN en o próximo a una unidad de transcripción.
• La recombinación homóloga entre elementos móviles de ADN puede contribuir
con la duplicación génica y otros reordenamientos, incluyendo duplicación de
intrones, recombinación de intrones para crear nuevos genes, y controlar la
expresión génica.
• Alrededor del 50% del genoma humano deriva de elementos transponibles,
aunque su movilidad sea muy limitada.

36. Reordenamientos Funcionales en el ADN
Cromosómico
• En tanto que la transposición de elementos móviles no parace
brindar una función directa inmediata al organismo, varios tipos
de reordenamientos son beneficiosos al organismo que lo
experimenta.
• Ejemplos incluyen inversión y deleción de segmentos de ADN
así como amplificaciones de ADN.
• Estos reordenamientos funcionales se dan tanto en Procariotas
como en Eucariotas.

37. Definición Molecular de Gen.
• Un gen es la secuencia nucleotídica
completa que es necesaria para la
síntesis de un polipéptido funcional.
• Región de ADN que codifica para
moleculas de ARN tales como ARNt y
el ARNr son también consideradas
genes.

38. Los Operones Bacterianos producen ARNm
policistrónicos en tanto que la mayoría de los
ARNm eucariotas son monocistronicos y
contienen intrones

39. Una Pequeña Proporción del ADN Genómico
Codifica para Productos Génicos

40. Los Genomas de eucariotas
superiores contienen mucho ADN
‘no-funcional’
En eucariotas, el contenido de ADN celular no se correlaciona con la filogenia.
Esto constituye la “Paradoja del valor C”

41. Organización del Núcleo y del
Genoma

42. Vista de tandem génicos de rRNA
transcribiéndose en forma contínua y
ensamblando ribosomas.
Fin de la unidad de transcripción
Extremo 5’ con ensamblaje de
Inicio de las
proteinas ribosómicas
unidades de transcripción

43. Núcleo Celular
Una célula humana contiene alrededor de 2 metros de ADN
contenidos en un núcleo de 2-3 de diámetro.

44. La Heterocromatina esta constituida por
Regiones Cromosómicas que no se
desenrollan.

45. Tres Elementos Funcionales son Indispensable
para la Replicación y Herencia Estable de los
Cromosomas Eucarióticos.
• Las secuencias que determinan el origin de replicación del ADN.
• El centrómero
• Los dos extremos (telómeros)

46. Las Funciones de los Tres Elementos de
Secuencia de ADN necesarios para producir un
cromosoma eucariótico lineal estable.

47. La Telomerasa provee el extremo con
función de templado a los extremos
del cromosoma

48. Estructura del Telómero
• Los telomeros son quot;capuchonesquot;
protectores ubicados en los
extremos de los cromsomas
• consistentes en secuencias
repetidas en tandem ricas en GC
con unidades de repetición de 5 a 8 Telomero Centrómero Telomero
pb.
• Evitan que los extremos se
fusionen y determinen
• reordenamientos cromsómicos

49. Cómo asegura la célula que el ADN sea
replicado una vez cada ciclo celular?

50. Fin