Tecnicas de hibridacion pcr mlpa

1. Grupo: 804
UNIDAD ACADEMICA DE MEDICINA
TECNICAS DE HIBRIDACION, PCR
Alumnos:
Bermúdez García Salvador
Hernández Arteaga Karen Yareli
Tornes Suastegui Stefany
GENETICA
Dr. Arturo Vargas

2. Es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de
estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica.

3. Proceso general de Electroforesis
1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente.
5. Visualizar.

4. Elementos necesarios para la Electroforesis
• Cámara de electroforesis
Permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en el
que se depositan las muestras.
Cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía.

5. • Gel
Da soporte para evitar perturbaciones mecánicas durante la
separación.

6. Electroforesis en Gel de Agarosa
• 100pb a 25 kb
• No tóxico
• Permite analizar pesos moleculares variados
• Menor poder de resolución de la poliacrilaminda

9. 1. Tanque externo
2. Conectores tipo banana
3. Soporte para geles
4. Cuña
5. Tapa
6. Cables fijos

10. • Buffer de corrimiento
Proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y
mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento.
*En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse:
TBE TAE
Tris base, ácido bórico y EDTA, y
se maneja a un pH de 7.2.
Tris base, ácido acético y EDTA,
ajustado
a pH 8.5.

11. • Buffer de carga
Tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que
facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel.
Relación 1:3 respecto a la muestra
Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol

12. Electroforesis en ácidos nucleicos
• Las movilidad dependerá únicamente de la longitud (pb).
• Se realiza con voltajes de 25 y 100V.
• Se monitorea en avance por la visualización de los colorantes.
• molecular de las moléculas de DNA que se va a separar.
• Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb) se recomienda
usar voltajes comprendidos entre 75 y 100V.
• Para muestras de DNA genómico y plasmídico (> 2 kb) se recomienda
aplicar valores de entre 25 y 75 V.

14. Visualización de las muestras
• Utilización de bromuro de etidio
 Incorporar antes de solidificar(0.5mg/ml)
Luego del corrimientos, incubando el gel en una solución que contenga
0.5mg/ml
Emite fluorescencia naranja al exponerse a UV con longitud de absorción
de 254nm y longitud de emisión de 366nm.

16. Colorantes
• Azul de bromofenol
Por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas o que la
mayoría de moléculas de DNA (siempre que éstas sean superiores a 300
pb), es decir, marca el "frente de avance".

17. Bromuro de etidio
Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para
unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. interacciona
también con DNA monocatenario.
• Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia. Se excita con luz ultravioleta
de onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color
rosado-anaranjado.

18. Transluminador Ultravioleta

19. Southern blot
1975, Edwin Southern
Analiza ADN previamente digerido con enzimas de restricción.
Determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN en
una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos.
I. Desnaturalización o separación de las cadenas complementarias del ADN
II. Hibridación o unión de dos cadenas complementarias.
Dos procesos:

20. Procedimiento técnico
Se aísla el ADN de cualquier célula del organismo.
Se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se
separan por electroforesis en geles de agarosa.
Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse
mediante tinción con bromuro de etidio.
El ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas,
mediante un proceso químico,(tratamiento con álcalis).

21. Los fragmentos se transfieren del gel a un soporte sólido,
como membranas de nitrocelulosa o de nailon.
Para identificar uno o más fragmentos
Se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula reportera
La sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa y donde la sonda
encuentre su secuencia complementaria se pegará, proceso conocido como hibridación.
Se emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante revelado con placas de rayos X

22. Aplicaciones
• Identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética.
• Identificar mutaciones, como rearreglos, deleciones y dosis génica en caso de portadores.
• Detectar polimorfismos en los fragmentos de restricción de diversos genes

24. Northern blot
Es la contraparte del Southern blot, se utiliza ARN en lugar de ADN.
 No se utilizan enzimas de restricción
Electroforesis
Desnaturalización
Transferencia
Hibridación con una sonda
1977, James Alwine, David Kemp y George Stark en Stanford
ARN

25.  Permite observar un patrón particular de expresión genética entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo,
niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las
mismas.
 Se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores en
células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
 Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes.
 La variación en el tamaño del producto de un gen puede además indicarnos deleciones o errores en el
proceso de transcripción.
Aplicaciones

27. Dot/slot blot
 Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican directamente a la membrana.
 No se realiza electroforesis.
 La fijación se hace generalmente con vacío y en un molde cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot blot) o ser
lineal (slot blot).
Es posible realizar detecciones cualitativas y cuantitativas,
utilizando como patrón diluciones seriadas de concentraciones
conocidas del genoma que se está determinando.
Sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una
biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados
por las sondas de ADN o el anticuerpo.

28. Hibridación in situ
• Es un método histoquímico
• Emplea a la biología molecular de la misma manera que la inmunohistoquímica.
• Su especificidad se basa en la unión de una sonda con una secuencia complementaria de ADN o ARN dentro de un
tejido.
• No requiere de la extracción de ácidos nucleicos
 Las sondas que se utilizan para la hibridación in situ pueden
ser radiactivas y no radiactivas.
En la actualidad, las más relevantes son las marcadas con
fluorescencia, modalidad conocida como hibridación in situ
acoplada a un sistema de fluorocromos (FISH), o con biotina, ya
que el detalle morfológico no se pierde, a diferencia de lo que
ocurre con las modalidades radiactivas.

29. • El primer paso es la preparación y fijación del tejido, en el cual deben
conservarse los ácidos nucleicos lo más íntegramente posibles,
mantener la morfología del tejido y permitir una accesibilidad
suficiente para que la sonda penetre.
• Las secciones de tejido deben adherirse al portaobjetos y no deben
desprenderse durante el procedimiento de hibridación.
• Antes de la hibridación, los tejidos se pretratan con HCl y proteinasa y
se someten a una posfijación con paraformaldehído.
Aspectos técnicos

30. Permite la localización de secuencias génicas a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras
alteraciones cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes (ARNm) a nivel celular y subcelular.
Las principales aplicaciones son la identificación de infecciones virales en tejidos, así como el mapeo cromosómico.
Aplicaciones

31. PCR

32. Técnica enzimática in vitro utilizada para amplificar una
región determinada de ADN situada entre dos regiones de
ADN, cuya secuencia se conoce, a partir de una mezcla
compleja de ácidos nucleicos.

33. Dr. Kary Mullis
1986:conceptualizó la PCR
1993: recibió el premio Nobel por su
invención
Multiplicar una hebra de ADN
millones de veces
Polymerase chain reaction
PCR
• Gran numero de copias de fragmentos específicos de DNA
Replicación exponencial de ADNg y ADNc

34. Características de la amplificación in vitro y
requerimientos necesarios para la PCR
Misma secuencia de la replicación 5`a 3`
• Se requiere ADNg y ADNc que sirva de molde
• ADN polimerasa
• Desoxinucleotidos
• Primers

35. ADN Polimerasa
• Taq ADN polimerasa enzima mas empleada
• Polimeriza una cadena tomando un molde.
• 95º C se tienen que soportar
• Aislamiento de la Taq polimerasa de la Bacteria Thermophilus aquaticus
• 1-2.5 U / Reacción de PCR
• Polimeriza en promedio 1000 nt /x min

36. ADN Molde
• Se obtiene de cualquier muestra biológica ADN
• La retrotranscripcion
• Amplificación a partir de 300 ng para ADNg y de 50-
100 ng para ADNc
CLORURO DE MAGNESIO
• El Cloruro de Magnesio actúa como cofactor de la ADN
polimerasa
• Concentración de entre 1.0 y 2.5 mM.

37. DESOXINUCLEOTIDOS
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• Forma trifosfatada
• Concentración óptima de
entre 50 y 200 μM, cantidad
suficiente para sintetizar de
6.5 a 25 μg de ADN.
AMORTIGUADOR
Concentraciones de sales adecuadas para la
correcta función de la ADN polimerasa.

38. INICIADORES
OLIGONUCLEÓTIDOS CON SECUENCIA ESPECÍFICA
• Delimitar los extremos del producto que se desea amplificar
• Su función radica en proporcionar un extremo 3’ libre al que se han de añadir
los nucleótidos consecutivos mediante enlace fosfodiéster.
A partir de ellos, la ADN
polimerasa inicia la
polimerización en
dirección 5’-3’. Los
iniciadores reciben el
nombre de sentido y
antisentido, según la
secuencia a la que dan
origen.

39. 1. Desnaturalización.
2. Alineamiento.
3. Extensión.
Termociclador
Es el equipo en el cual se realiza la PCR.
Los rangos de temperatura que abarca el equipo van de 4 a 96°C.
Esquema de la PCR
Desarrollada en 1986 por Kary Mullis
Tres etapas principales

40.  Desnaturalización
Temperatura de 95°C. Permite el acceso de los primers a la cadena molde
en sus secuencias complementarias.(30 s)
 Alineación o Hibridación
55 y 60°C Los iniciadores Buscan en las cadenas de ADN su secuencia complementaria
y formen los puentes de hidrógeno con la cadena molde, dejando el extremo 3’OH
disponible para la adición de los nucleótidos por la ADN polimerasa. (30 a 40 segundos)
 Extensión
Se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento de la ADN polimerasa
empleada. Taq polimerasa, la más utilizada es de 72°C, según la longitud del producto
que se va a amplificar, considerando la adición de 1000 nucleótidos en 60 segundos.
Un ciclo típico de PCR consta de las tres temperaturas siguientes:
Se repite continuamente
por 30 a 35 ocasiones.

41. Sensibilidad de la técnica de PCR
 sensibilidad y una especificidad de 100%.

42. Modalidades de la técnica de PCR
PCR convencional
Los amplicones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa.
La visualización de los amplicones se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de
agarosa expuesto a luz UV..
Los amplicones son corridos en el gel, deben ser cargados junto con un marcador molecular
que contenga un número determinado de segmentos de ADN conocidos, lo que facilita la
identificación de los amplicones.

43. PCR cualitativa
Detectar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN determinado.
PCR cuantitativa
El producto de PCR es cuantificable, lo que permite reportar en números absolutos la
cantidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una muestra.
PCR múltiple
Se realiza la amplificación de más de un fragmento de ADN en
una sola reacción de PCR con dos o más juegos de primers.

44. PCR selectiva (detecta genes silvestres o mutados)
Para la PCR selectiva se diseñan primers capaces de hibridar solamente en secuencias con presencia de
una mutación, por lo que, en caso de estar ausente, no se produce un producto de PCR.
Mayor sensibilidad, al amplificar las secuencias de ADN en dos rondas de amplificación con
distintos pares de primers en cada una.
Primero se realiza una PCR con un par de iniciadores externos para amplificar una región de
ADN extensa. Después, este producto de amplificación sirve de molde para una segunda
PCR con otro par de iniciadores internos para amplificar una región más pequeña (interna).
PCR anidada (nested-PCR)

45. Es una variante de la PCR convencional utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el
producto de la amplificación de ADN.
.
PCR EN TIEMPO REAL Russel Higuchi 1992
Mediante la detección de la fluorescencia liberada durante la reacción de amplificación puede medirse la cantidad de ADN
sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de
producto de PCR formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación
Sustancia marcada
(Fluorocromo)
La temperatura de alineación y extensión es la misma, por lo que
ambos pasos se unifican y se reduce el tiempo de reacción.

46. PCR en tiempo real empleando SyberGreen
El fluoróforo se une al ADN de doble cadena de manera
inespecífica y produce fluorescencia.
La desventaja estriba en que la unión, al ser inespecífica, será a lo
largo de toda la molécula de ADN de doble cadena, incluyendo los
dímeros de primer que pudieran formarse.

47. PCR en tiempo real con sondas TaqMan
Se lleva a cabo en un termociclador que realiza, a la vez, la detección de fluorocromos mediante luz láser.
La sonda tiene acoplado un fluorocromo en su extremo 5’, silenciado por otro fluorocromo o quencher

48. PCR en tiempo real con primers LUX
Uno de los iniciadores se encuentra marcado con un
fluoróforo; cuando el iniciador hibrida con la
cadena blanco, el fluoróforo es excitado, lo que da
como resultado un incremento significativo de la
señal de fluorescencia que el láser detecta.

49. Semicuantificación en tiempo real con el método 2DDCt
En la PCR en tiempo real la concentración relativa se obtiene
interpolando todas las muestras en un punto umbral ciclo de
corte o cyclethreshold (CT).
El CT permite discriminar el comportamiento de las muestras,
ya que a un menor valor de CT existe mayor cantidad inicial de
moléculas del gen de interés en una muestra.
El CT lo determina un software a un umbral de fluorescencia
fijo (threshold) seleccionado por el analista.
Estos valores pueden relacionarse con una curva estándar para
determinar la cantidad de moléculas de ADN existentes
(cuantifi cación absoluta) o con un grupo de referencia (cuantifi
cación relativa).

50. Retrotranscripción como paso previo a la PCR
Se lleva a cabo antes de una PCR, cuando se pretende analizar secuencias de ARN.
Se basa en el uso de transcriptasa inversa de los retrovirus.
No se requieren ciclos, y basta con una hora a la temperatura óptima de la enzima para realizar la conversión
Los pasos de que consta esta reacción son:
• Desnaturalización del ARN a 70°C por 10 minutos para
eliminar estructuras secundarias
• Alineación de los hexámeros por 10 min a 25°C
• Polimerización por la retrotranscriptasa a 37°C por una
hora.
Una vez obtenida la cadena de ADNc, ésta se emplea
como molde para la técnica de PCR.

51. Los productos de PCR pueden utilizarse para:
Secuenciación, detección de patógenos infecciosos (virus bacterias, hongos), amplificación de segmentos para su análisis, o
huella deADN, en medicina forense, detección de mutaciones, análisis de la expresión génica o determinación de carga
viral, entre otras muchas aplicaciones.
Aplicaciones de la PCR
 Con ella se pueden amplificar segmentos que contienen una mutación conocida (diagnóstico) o bien mutaciones
desconocidas que se secuenciarán y determinarán después de una PCR.
 Ha sido de gran ayuda para el diagnóstico y la correlación de variaciones génicas con enfermedades.
 En cuanto a las enfermedades adquiridas, la detección de genomas de patógenos es la aplicación diagnóstica más
empleada de la PCR.
 Debido a su alta sensibilidad, permite la detección aun de pocas copias del genoma, lo que suele suceder en los
periodos iniciales de la infección; por lo tanto, la PCR permite un diagnóstico temprano.
Diagnóstico como aplicación de la PCR

54. MLPA
MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION
Multiplex ligadura-dependiente de la sonda de amplificación
La técnica está diseñada y usada por laboratorios para
detectar problemas genéticos que van desde un número
anormal de cromosomas, supresiones, duplicaciones y
expansiones de genes, utiliza la ortografía de los pares de
bases para determinar si las porciones de los cromosomas o
genes han cambiado o mutado.

55. Pasos:
1. Comienza con las sondas que se conectan a los
pares de bases de los genes y los cromosomas en
una ubicación específica. Así contar el número de
mitades de sonda la cuales tan hechas en
diferentes longitudes. Y sirven cuando se han
montado correctamente en su gen o localización
cromosómica entre si.
2. Reacción en cadena de polimerasa (PCR) se
utiliza para hacer muchas copias de las mitades
de la sonda correctamente emparejados y
adjuntos.

58. Secuenciación de ADN
Determinación del orden de los nucleótidos
Aplicaciones
Investigación básica de los procesos biológicos fundamentales
Investigación forense
Conocer mutaciones somáticas, sustituciones de bases
En los decenios de 1960 y 1970
• Sanger y Alan Coulson
• Alan Maxam y Walter Gilbert

59. Didesoxinucleótidos trifosfatados (ddNTP)
Carecen de hidroxilo en el carbono 3’ de la desoxirribosa
Se incorporan a una cadena de ADN en crecimiento por medio de la ADN pol
se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar; este ADN se
desnaturaliza y se emplea una sola hebra en la secuenciación.
iniciador o primer marcado radiactivamente
Complejo iniciador-molde
Con estas mezclas se preparan cuatro tubos de reacción
En cada una se producirán cadenas de ADN de distintas longitudes,
terminando todas en el lugar en el que se incorporó el “didesoxi”
Método de Sanger

60. Las cuatro mezclas son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida-
urea en condiciones desnaturalizantes (acrilamida 12% con urea 8 M).
Visualizar mediante autorradiografía cuando se utiliza marcaje radiactivo,
ya sea en el iniciador o en alguno de los dNTP.
El tiempo de exposición de la placa de rayos X sobre el gel varía de 20 a
30 horas y se expone a temperatura ambiente.
 Marcas quimioluminiscentes (fluorescentes) para evitar el manejo de
radiactividad.
 En este caso el marcaje es con fluorocromos en el extremo 5’ del iniciador.
Cadenas de longitud variable con terminación T en su extremo 3’,
pero todas con el mismo extremo 5’ (el extremo 5’ original del iniciador).

62. Bibliografía
• Voet;Voet.(2011).Biochemistry.4th Edition.USA, JOHN WILEY &
SON,INC.
• Salazar; Sandoval; Armendáriz (2016)Biología Molecular.
Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud.2
Edición.McGrawHillEducation.
• Pérez, D. M. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida:
fundamentos,. Obtenido de
bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.pdf
• Wink. (2009)An Introduction to Molecular Biotechnology.
Fundamentals, Methods and Aplications.2 Edition.Willey-Blackwell