1. APLICACIONES CLÍNICAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO Unidad mixta CSIC/UAH Alfredo Prieto Martín Profesor Contratado Doctor de Inmunología Coordinador del programa de doctorado en Inmunología MENCIÓN DE CALIDAD MECD Universidad de Alcalá [email_address] http://www.alfredoprieto.tk www2.uah.es/problembasedlearning
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4. ¿Qué es la citometría de flujo? FSC 90º 2- 4º Columna de muestra Meeting point Láser Detectores de luz Amplificación digitalización Representación y Análisis Flujo Permite identificar células, contarlas y caracterizarlas
5. Uso clínico de los citómetros Células Citómetro Información Numérica (analizador) Células purificadas (separador) Decisión diagnóstica o terapéutica Transfusión celular
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8. Comparación con otras metodologías de análisis clínicos en células Cuantitativa Cuantitativa Cualitativa Tipo de información alta alta baja Velocidad “ Si” fraccionando No Si Localización en la célula(s) Muestra Célula Célula Unidad de la que extrae información Bioquímica Citometría de flujo Citometría de imagen
9. Medida de fluorescencia en células individuales por citometría de flujo Mide en cantidades elevadas de células Obtener conclusiones estadísticamente fidedignas objetivas y reproducibles Alta velocidad Altísima sensibilidad 1974(3000mol/cel) 2003 (300mol/cel) Es cuantitativa con un amplio rango de medida Permite estudio multiparamétrico simultáneo Es específica de color Ventajas Propiedades
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12. Estudio de la heterogeneidad celular CD19 CD19 CD3 CD3 CD56 CD56 CD4 CD4 CD8 CD8 CD2 CD2 CD45 CD14 CD45RA CD45RA CD45RA CD45RA CD45RA CD45RO CD45RO CD45RO CD45RO CD1 5 Neu Mono B NK T4 T8
17. Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular Granulocitos CD15+ Monocitos CD14+ Linfocitos CD3+ CD4+ CD8+ CD56+ CD19+ CD5+ CD5-
18. Marcaje de antígenos por inmunofluorescencia 3. Marcaje Superficial 4. Marcaje Intracelular
27. Clasificación pronóstica de los síndromes linfoproliferativos El aumento de expresión de CD38 en pacientes con Leucemia Linfática Crónica de células B (LLC-B) es signo de un mal pronóstico de evolución de la enfermedad Expression de Zap 70 correlaciona con CD38
36. Porcentaje y cifras de linfocitos T CD69+ en pacientes con sepsis de alto riesgo
37. Porcentaje y cifras de linfocitos B CD23+ en pacientes con sepsis de alto riesgo
38. Porcentaje y cifras de linfocitos T CD8+ CD62L+ en pacientes con sepsis de alto riesgo
39. Expresión de CD38 y riesgo en LLC-B Escasa Hipermutación Pregerminales ZAP-70+ Mal pronóstico Hipermutación elevada Posgerminales ZAP-70- Buen pronóstico
53. MONITORIZACIÓN DEL HISTORIAL DE DIVISIONES CON CFSE CFSE X Fluorescencia / célula X / 2 X / 4 Sin dividir Tras una división Tras dos divisiones
54. ESTUDIO DE ALORREACTIVIDAD EN TRASPLANTE CON CSFE No proliferantes Proliferantes alorreactivas
55. ESTUDIO DE LA APOPTOSIS Apoptosis correlaciona con grado de actividad de enfermedades autoinmunes Utilidad pronostica en evaluación y predicción de respuesta a tratamiento con IFN en pacientes con esclerosis múltiple
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57. APOPTOSIS vs. NECROSIS - La apoptosis es un modo de muerte celular activo y fisiológico en el que la célula ejecuta el programa de su propia muerte. - La necrosis es una muerte accidental debida a un estrés: choque térmico, hipotónico, pH... - Los métodos deben distinguirlas
59. Diferencias entre apoptosis y necrosis. Temprana Apoptosis Necrosis Programada genéticamente Accidental Se mantiene Se pierde Disminuye Aumenta Se preservan Se desintegran Condensación de la cromatina Tardía Fragmentación del DNA Tardía en fragmentos grandes . En cuerpos apoptóticos rodeados por membrana Son reconocidos y fagocitados Los contenidos de los orgánulos se liberan Inducen inflamación local Integridad de membrana Tamaño celular Orgánulos Temprana en fragmentos oligonucleosomales Fragmentación celular Restos celulares Mecanismo
60. DIAGRAMA DE LA CINETICA DE LA APOPTOSIS Sustratos de caspasas Unión de anexina V Extracción LMW DNA TUNEL Sondas catiónicas Marcaje de fragmentos Activación de caspasas Pérdida de la asimetría de la membrana Pérdida de la integridad de membrana / Fragmentación DNA Fragmentación en cuerpos apoptóticos
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64. CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA: AUMENTO DE PS (En combinación con una sonda vital) Viables Necróticas Apoptóticas tempranas Apoptóticas tardías
65. CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA: AUMENTO DE PS Ventajas: - Detecta fase temprana de la apoptosis - Se puede combinar con marcaje con anticuerpos monoclonales. - Discrimina necróticas Desventajas: - No es específico en determinadas condiciones
69. EXTRACCIÓN DE DNA DE BAJO PESO MOLECULAR Ventajas: - Simple y barato - Permite estudio de ciclo celular Desventajas: - Detecta apoptosis intermedia y tardía - Puede generar artefactos - No discrimina necróticas
70. TUNEL Marcaje de los fragmentos 3’OH con nucleósidos marcados mediante la transferasa terminal de deoxinucleótidos (TdT)
75. CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES POR BEAD ARRAYS El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante
82. Selection of reactive T cells by Cytokine secretion assays 3. Captura del producto secretado During the incubation of 45 minutes at 37°C, the secreted cytokine binds to the Cytokine Catch Reagent on the surface of the secreting cells. It is important to avoid close contact of the cells, they are kept in suspension using the MACSmix™. 1. Estimulación The cells are stimulated, e.g. with antigen, for 3-16 hours in vitro. The responding cells rapidly begin to secrete cytokines. 2. Marcaje con reactivo de captura A Cytokine Catch Reagent is now attached to the cell surface of all leukocytes via the CD45 antigen.
83. Selection of reactive T cells by Cytokine secretion assays 4. Marcaje de la citocina capturada Then the cells are stained with a fluorochrome-labeled Cytokine Detection Antibody. The cells are now ready for analysis by flow cytometry. 5. Marcaje con anticuerpos unidos a microparticulas paramagnéticas Para aislar, cytokine-secreting cells se marcan con micropartículas recubiertas de anticuerpos Anti-PE. 6. Selección de las células productoras The cytokine-secreting cells are now enriched by using a MACS Separator and MACS Columns (up to 10,000-fold).
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Notas del editor
La citometría de flujo es una metodología en la que una columna de liquido transporta en su seno a las células a analizar haciéndolas pasar alineadas por delante de una fuente de iluminación monocromática (generalmente un láser). Una serie de detectores registran la luz dispersada por las células y su emisión de fluorescencia (luz emitida con distinta longitud de onda. Mediante el marcaje de las células con moléculas fluorescentes se pueden conocer propiedades de las mismas: expresión antigénica, viabilidad, etc.
Hay dos tipos de citómetros
Las técnicas de inmunofluorescencia permiten el marcaje de moléculas celulares mediante anticuerpos que las reconocen con gran especificidad y emiten una fluorescencia proporcional a la cantidad de la molécula reconocida presente en la célula. Existen moléculas cuya expresión es especifica de linaje celular y su expresión celular puede ser empleada para la caracterización y enumeración de estos tipos celulares mediante el uso de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a estas moléculas. Así mediante el análisis multiparamétrico de la expresión antigénica se pueden cuantificar las cifras sanguíneas de células pertenecientes a distintas poblaciones normales y también detectar fenotipos aberrantes correspondientes a células leucémicas. La ausencia o disminución muy pronunciada de poblaciones normales permite el diagnóstico de inmunodeficiencias. Esto es importante en el diagnóstico de inmunodeficiencias primarias debidas a alteraciones en la diferenciación celular de los linfocitos y también en el seguimiento de la evolución de inmunodeficiencias secundarias a la infección por HIV mediante la monitorización de las cifras de linfocitos CD4. La detección de poblaciones expandidas con fenotipos anormales ha permitido utilizar la citometría de flujo para el diagnostico de leucemias, así como la monitorización del efecto del tratamiento antileucémico sobre las células malignas. Así mismo en los últimos años la monitorización de células T activadas o capaces de producir determinadas citocinas han mostrado su utilidad para medir el grado de activación del compartimento linfocitario sanguíneo en patologías infecciosas y autoinmunes. La enumeración celular exacta de las cifras sanguíneas se ha utilizado en la detección de enfermedad mínima residual y en el seguimiento de las cifras de linfocitos CD4 de pacientes afectados por el síndrome de abstinencia. Nuestro laboratorio es pionero en la aplicación de estas técnicas a la enumeración de células en cultivo in vitro. El estudio de la apoptosis de células sanguíneas es uno de los temas de estudio que están empezando a aplicarse con objetivos clínicos como la monitorización de enfermedades autoinmunes y la vigilancia del efecto de los tratamientos inmunoterapéuticos sobre su evolución. En nuestro laboratorio estamos desarrollando metodologías para el estudio de la apoptosis linfocitaria y las estamos aplicando al estudio del efecto de la terapia con interferón beta sobre la apoptosis de linfocitos de pacientes con esclerosis múltiple. La solicitante se incorporara a la ejecución de un proyecto ya en marcha.
Cluster Designation Numbers : Researchers in many scattered laboratories painstakingly identified many lymphoid surface antigens and developed antibodies to them. Every so often, in world congresses, it would become apparent that antibodies originating from different labs and bearing different names were marking the same antigen/molecule. At that point, the antigen would be assigned a cluster designation , or CD number, meaning that a known cluster of antibodies were binding to this known antigen. Any of these antibodies might be referred to by one of several idiosyncratic laboratory names or by the CD number of the antigen. For example, antibodies that recognize CD20, a characteristic B-cell molecule, might be called alternatively L26, B1, or, by association, CD20. This is very confusing and is one reason why hematopathologists keep lots of aspirin in their desks. Nonetheless, if you study lymphomas, you will have to know at least the basics of this scheme. Here are the basics: All lymphoid cells (well, almost all): Lymphoid cells are reactive for CD45 (leukocyte common antigen, or LCA). B-cells : Almost all of these are reactive for CD19 , CD20 and CD22 . Certain low-grade B-cell lymphomas are reactive for two markers otherwise usually found on T-cells: CD5 and CD43 . Follicular center cell lymphomas (as well as very different fish, lymphoblastic lymphomas) are frequently CD10 (+). T-cells : Pan T-cell markers (present on almost all T-cells) include CD2 , CD3 , CD5 , and CD7 (the early childhood markers). Most T-cells mark with either CD4 (helper cells) or CD8 (suppressor cells or cytotoxic cells). Natural-killer cells : These tough guys are frequently associated with CD16 , CD56 , or CD57 . Several test panels are available to facilitate the clinician in evaluating a patient’s immunological status. Helper/Suppressor Cell Panel: Consists of evaluation (% positive and absolute numbers) of total T cell (CD3), helper cell (CD4), suppressor cell (CD8), total B cell (CD19), CD4/CD8 ratio, Natural Killer Cells as well as WBC and absolute lymphocytes. T and B Cell Leukemia/Lymphoma Panel: Enumeration of all lymphocytes and subsets as an aid in distinguishing leukemia/lymphoma from benign lymphocytosis. Panel consists of various differentiation markers found on T and B cells that can be used to detect monoclonicity or abnormalities associated with leukemia/lymphoma. Acute Leukemia Panel: Enumeration and identification of blasts with T cell , B cell, and myelo/monocytic cell markers. To be used in conjunction with morphological diagnosis and/or special histochemical stains. Transplantation Panels: CD3 Lymphocyte Levels: Immunosuppressive therapy, used in solid organ transplants, causes a disappearance of CD3 T cells. Failure to respond to therapy is demonstrated by a slow but steady rise in the CD3 T. CD34 (Human Progenitor Cell Antigen) Levels: The CD34 antigen is expressed on stem cells that are necessary for reconstituting the bone marrow. Bone marrow transplant patients undergo a series of procedures that enhance as well as collect enriched CD34 specimens, destroy the diseased bone marrow and then return the CD34 enriched products back to the patient. Flow cytometry monitors the efficiency of these procedures by determining CD34 levels.
Linfocitos: Células morfologicamente iguales pero que podemos diferenciar mediante la expresión de proteinas de membrana diferentes tipos y en distintas condiciones fisiológicas. 1. Descripción microscópica de las células observadas Cúbicas, prismáticas, irregulares. Presencia o no de orgánulos intracelulares y de que tipo. Estudio morfológico y microscopico de la complejidad celular=heterogeneidad celular 3. Criterios químicos: según reaccionan con determinados compuestos, se describen las células Ejemplo: Neutrófilos: Diferentes neutrofilos según la forma del núcleo: Callados, segmentados Marcajes como el Giemsa, Tricromico, azul de tripan, hematoxilina eosina 4. Uso de pruebas específicas. Ej: Anticuerpos Monoclonales.
Me sirve también para hablar de la diversidad tecnológica Celulares Morfología al microscopio. Moleculares Genotípico Concepto de diferenciación genética asociación de elementos reguladores al DNA. Expresión de determinados RNA, unos y no otros nos dicen como va a ser la expresión fenotípica. La expresión diferencial del DNA nos caracteriza el fenotipo de una célula y por tanto su función Proteoma: Conjunto de proteinas que caracterizan una célula. Fenotípico Concepto de expresión de RNAs traducción a proteínas. Los antígenos de superficie pueden ser utilizados como marcadores especificos de lineas, tipos y subtipos celulares. Tambien pueden emplearse para este fin proteínas intracitoplásmicas o de secrección que sean producidos especificamente por determinados tipos celulares ej. IL-4 y IFN , perforinas.
Podamos estudiar la célula individual. Podamos estudiar varias cosas a la vez. Podamos estudiar su distribución espacial. Podamos estudiar muchas iguales: sacar números representativos: mayor numero de celulas estudiadas menor es el error experimental, y más nos acercamos a la realidad Podamos procesar la informacion para sacar conclusiones
B-Cell Neoplasms I. Precursor B-cell neoplasm: a. Precursor B-lymphoblastic leukemia/lymphoma II. Mature (peripheral) B-cell neoplasms B-cell chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma B-cell prolymphocytic leukemia Lymphoplasmacytic lymphoma Splenic marginal zone B-cell lymphoma (+/- villous lymphocytes) Hairy cell leuekmia Plasma cell myeloma/plasmacytoma Extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue type Nodal marginal zone lymphoma (+/- monocytoid B-cells) Follicle center lymphoma, follicular, Mantle cell lymphoma Diffuse large cell B-cell lymphoma • Mediastinal large B-cell lymphoma • Primary effusion lymphoma Burkitt's lymphoma/Burkitt's cell leukemia T-Cell and Natural Killer Cell Neoplasms I. Precursor T cell neoplasm: a. Precursor T-lymphoblastic lymphoma/leukemia II. Mature (peripheral) T cell and NK-cell neoplasms T cell prolymphocytic leukemia T-cell granular lymphocytic leukemia Aggressive NK-Cell leukemia Adult T cell lymphoma/leukemia (HTLV1+) Extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type Enteropathy-type T-cell lymphoma Hepatosplenic gamma-delta T-cell lymphoma Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma Mycosis fungoides/Sézary's syndrome Anaplastic large cell lymphoma, T/null cell, primary cutaneous type Peripheral T cell lymphoma, not otherwise characterized Angioimmunoblastic T cell lymphoma Anaplastic large cell lymphoma, T/null cell, primary systemic type Hodgkin's lymphoma (Hodgkin's Disease) Nodular lymphocyte predominance Hodgkin's lymphoma Classical Hodgkin's lymphoma •Nodular sclerosis Hodgkin's lymphoma •Lymphocyte-rich classical Hodgkin's lymphoma •Mixed cellularity Hodgkin's lymphoma •Lymphocyte depletion Hodgkin's lymphoma In addition, multiple subcategories are offered for several of these diseases. Table of Contents | Next section | Previous section Immuno- and Genophenotype: With few exceptions B-cell lymphomas express the pan-B cell antigens: CD19, CD20, CD22. As B-cells reach their final goal (the plasma cell stage), paradoxically they tend to lose these markers, and so do their malignant counterparts. Thus multiple myeloma cells are negative for these antigens. CD5 and CD43, most frequently found on T-cells, are detected in small lymphocytic lymphoma and mantle cell lymphoma. Small lymphocytic lymphoma is also reactive for CD23. CD10 is found in many cases of very different types of lymphomas: follicular center cell lymphomas, B-cell lymphoblastic lymphomas, and Burkitt's lymphomas. Most follicular lymphomas, especially low grade ones, rearrange the BCL-2 gene, t(14;18). Most Burkitt's lymphomas rearrange the MYC gene, t(8;14). Most mantle cell lymphomas rearrange the BCL-1 gene, t(11;14). Table of Contents | Next section | Previous section
sindrome
Celula del manto, celula folicular, linfoplasmacitoide
<400
Enumeración celular
Functional parameters of lymphocytes contain predictive information for individualized risk assessment in septically admitted IC patients already on the day of admission immunophenotype parameters indicate SLE activity better ( fig.2A ) than the clinical and clinical chemistry parameters or all parameters togetherincreased frequency of CD19pos, CD27highpos/CD20neg and absolute counts of CD27highpos/CD20neg peripheral blood B-cells in conjunction with decreased frequency and absolute counts of CD27neg/CD20pos B-cells Jacobi A.M., M.Odendahl, K.Reiter, A.Bruns, G.M.Burmester, A.Radbruch, G.Valet, P.E.Lipsky, Th.Dörner: Correlation between circulating CD27high plasma cells and disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism 48 :1332-1342, (2003)
CD23 marcador de activación por antígeno de células B
Flow Cytometric Analysis of Cellular DNA Clinical Significance:
Cells in different phases of the cycle have different but predictable amounts of DNA content which can be measured rapidly by flow cytometry.
Proliferation activity (%S) and a DNA Index (DI) will be reported along with a pathologist’s interpretation.
Cell cycle analysis quantitates the distribution of cells in each phase of the cell cycle. The %S is indicative of how fast a tumor is dividing. The DI indicates if a tumor is diploid (normal) or aneuploid (adnormal) in DNA content when compared to a normal standard control. Cell cycle analysis can indicate tumor aggressiveness and has prognostic implications in some malignancies.
![APLICACIONES CLÍNICAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO Unidad mixta CSIC/UAH Alfredo Prieto Martín Profesor Contratado Doctor de Inmunología Coordinador del programa de doctorado en Inmunología MENCIÓN DE CALIDAD MECD Universidad de Alcalá [email_address] http://www.alfredoprieto.tk www2.uah.es/problembasedlearning](https://image.slidesharecdn.com/citometriadeflujo-linfomasyleucemias-100908063735-phpapp02/85/Citometria-de-flujo-linfomas-y-leucemias-1-320.jpg)
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