Exposicion sobre herramientas de la genetica molecular utilizadas en el diagnostico de multiples enfermedades

1. HERRAMIENTAS DE DIAGNÓSTICO
HERRAMIENTAS DE DIAGNÓSTICO
HERRAMIENTAS DE DIAGNÓSTICO
EN GENÉTICA MOLECULAR
EN GENÉTICA MOLECULAR
EN GENÉTICA MOLECULAR
Ángeles López Frida Geraldine
Azcona Jiménez Emmanuel
Díaz Ibáñez Natanael Mohamed
Galicia Lopéz Jesús Imanol
Gómez Paz Francisco Samuel
Ríos Hernández Samaria
Dra. Elvira Silvet Chiñas Lopéz
Integrantes
Catedratica
Gradoygrupo

2. Es el estudio de los patrones de herencia, el
modo en que los rasgos y las características se
transmiten de padres a hijos.
Los genes están compuestos de segmentos de ADN, la
molécula que codifica la información genética en las
células.
El ADN controla la estructura, función y comportamiento de
las células, y puede crear copias exactas de sí mismo.
¿QUÉ ES LA GENÉTICA?

3. El diagnóstico genético-molecular es un análisis a mayor aumento que
requiere técnicas que examinan secuencias específicas de ADN o ARN.
Se utilizan para enfermedades en que está descrito el gen responsable o
al menos su localización y permiten identificar la mutación patogénica o el
haplotipo ligado a la enfermedad.
Existen alrededor de 8000 enfermedades genéticas listadas en OMIM (Online Mendelian
inheritance of Man), que presentan un patrón de herencia compatible con una transmisión
según las leyes de Mendel o mitocondrial
LA GENETICA COMO HERRAMIENTA DE DIAGNOSTICO

4. 1901
GRUPOS
SANGUINEOS
A, B, O
1940
FACTOR RH
1960
ESTRUCTURA Y
PRODUCCION
DE IG.
1977
SECUENCIACION
DE SANGER.
1983
DESARROLLO
DE LA PCR
2000
USO Y
DESARROLLO DE
INMUNOENSAYOS
2001
SECUENCIACION
DEL GENOMA
HUMANO
2001
MICROARREGLOS
DE ADN
2010
SECUENCIACION
DE SEGUNDA
GENERACIÓN
Predominio serológico
UN POCO DE HISTORIA
Nueva generación

5. HERRAMIENTAS DE DIAGNOSTICO
I FISH
Genoma y exoma completo
II
III
IV
V
Prueba de paternidad
Tamiz Neonatal
Microarreglos
VI
VII
Secuenciación de Sanger
MLPA

6. Detecta secuencias específicas de ADN en células o tejidos
mediante el uso de una sonda (fragmento de ADN homólogo a
la secuencia blanco) marcada con un fluorocromo.
Usa la complementariedad de unión de una secuencia diana a
una sonda
HIBRIDACION IN SITU FLUORECENTE
MOLECULAR FISH

9. La técnica de FISH ha permitido identificar entidades
clínicas causadas por microdeleciones.
Algunos ejemplos son los de Prader-Will (deleción
15q11-13), Williams (deleción 7q11.2) y DiGeorgede
(deleción 22q11.2).
La detección de una microdeleción debe realizarse mediante FISH
utilizando una sonda específica para la región implicada.
Se debe tener una sospecha previa hallada en el
entorno clínico mediante determinadas pruebas clínicas
o estudios familiares.
Aplicaciones clínicas
Diagnóstico de síndromes por microdeleción

10. Diagnóstico de síndrome de Down
El estudio FISH mediante la combinación de cuatro sondas
dirigidas a las regiones 6p25 (RREB1), 6q23 (MYB), 11q13
(CCND1) y el centrómero del cromosoma 6 (CEP6) ha sido
establecido como óptimo para el diagnóstico diferencial
Melanoma frente a Nevus (lesión melanocítica benigna).
Diagnóstico de melanoma

11. Diagnóstico de Leucemia mieloide
La principal activación de ALK se produce por la
formación de genes de fusión, habiendo más de 20
genes de fusión con ALK descritos.
Diagnóstico de cáncer de pulmón
Diagnóstico de cáncer de mama
amplificaciones del gen HER2 importante para el tratamiento
de pacientes con cáncer de mama.

12. Es una prueba de laboratorio que debe
realizarse a todo recién nacido para
identificar a aquellos que están en riesgo de
padecer desórdenes metabólicos serios que
son tratables pero no visibles al momento
TAMIZ NEONATAL

13. Detectar oportunamente alguna
enfermedad o deficiencia
metabólica, antes de que se
manifieste, para proporcionar
tratamiento adecuado, limitando
el daño y sus consecuencias,
tales como: discapacidad
intelectual, retraso en el
crecimiento y desarrollo, así como
el fallecimiento.
Hipotiroidismo Congénito (TSH)
Hiperplasia Suprarrenal
Congénita (HSC)
Galactosemia (Gal)
Fenilcetonuria (PKU)
Fibrosis Quística (TIR)
Deficiencia de Glucosa 6 Fosfato
Deshidrogenasa (G6D)
Deficiencia de biotinidasa

14. A diferencia del tamiz neonatal
básico en este es posible
detectar hasta 67 padecimientos
Enfermedades de los
aminoácidos
Enfermedades de los
ácidos orgánicos
Desordenes de la
oxidación de los ácidos
grasos

15. PRUEBAS DE PATERNIDAD
Determinación de la relación genética entre dos o más
individuos, con base en los principios de la herencia
mendeliana simple de los marcadores genéticos, en los que se
establecen que los alelos se segregan en la meiosis de forma
independiente y discreta.

16. En este caso las repeticiones cortas en
tándem (STR) son los marcadores
genéticos no ligados más utilizados para la
evaluación del parentesco debido a su alto
polimorfismo. Estas se examinan por PCR
mediante plataformas comerciales de
múltiples loci de repeticiones cortas en
tándem, eficientes y con gran poder de
discriminación.

18. MICROARREGLOS
También conocidos como microarrays o chips de ADN.
Son una técnica de biología molecular que permite
estudiar la expresión de miles de genes a la vez.
Ha permitido revelar nuevos síndromes por
microdeleción ó microduplicación y diagnosticar
numerosas anomalías cromosómicas que antes eran
indetectables.
También, la capacidad de alta resolución de esta
técnicas ha permitido identificar numerosas
variaciones en número de copias (CNV), lo que ha sido
de gran utilidad para describir nuevas enfermedades
monogénicas.

19. Se marca la muestra
con fluorocromo
Desnaturalización del
ADN marcado
Hibridación de la
muestra con el
microarreglo
PROCESO DE MICROARREGLOS
Detección, captura y
análisis de las imágenes. Se
determinan que genes
estaban en la muestra.
Extracción del ADN

21. Puede detectar de manera simultánea
aneuploidías, deleciones, duplicaciones
o amplificaciones de cualquier segmento
de DNA representado en el microarreglo.
El aCGH puede detectar tanto
alteraciones submicroscópicas como
alteraciones numéricas y estructurales.
Permite una localización o “mapeo”
preciso de las alteraciones cromosómicas
El aCGH no detecta rearreglos en el que no
hay desequilibrio en la dosis de DNA, tales
como; translocaciones balanceadas e
inversiones
el aCGH detecta cambios de número de copias de
DNA, los resultados idénticos en apariencia de los
microarreglos pueden ser ocasionados por diferentes
eventos moleculares.
aCGH: Hibridación genómica comparativa
basada en microarreglos

22. MICROARREGLOS BASADOS EN SNP
Los microarreglos de Illumina son un ejemplo de microarreglos basados en
SNP
Se basan en la hibridación de un DNA desnaturalizado de cadena sencilla de un paciente
en un microarreglo con cientos de miles de sondas que contienen varios SNP por cada
laminilla.
Estos microarreglos proporcionan información sobre la variabilidad genética entre
poblaciones de individuos a gran escala, así como susceptibilidad a variantes causales de
enfermedades.

23. DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO
Las pruebas citogenéticas basadas en microarreglos se recomiendan como estudio de primera
línea en la evaluación posnatal de pacientes con trastorno del espectro autista, retraso en el
desarrollo psicomotor/ retraso mental no sindrómico en apariencia y malformaciones
congénitas múltiples no específicas de un síndrome genético bien definido
Cáncer: Los microarreglos permiten clasificar subtipos de cáncer basados en perfiles
genéticos, lo que facilita la selección de tratamientos más efectivos.
Enfermedades genéticas: Ayudan a identificar variantes genéticas responsables de
enfermedades hereditarias, permitiendo un diagnóstico temprano.
Farmacogenómica: Facilitan la personalización de tratamientos farmacológicos según el
perfil genético del paciente.

24. Rutinariamente se secuencian regiones de ADN de hasta 900 pares de
bases con un método llamado secuenciación de Sanger o método por
terminación de cadena.
Fue desarrollado por el bioquímico británico Fred Sanger y sus colegas en
1977.
En el Proyecto Genoma Humano, se utilizó la secuenciación de Sanger para determinar
las secuencias de muchos fragmentos relativamente pequeños de ADN humano.
Los fragmentos se alinearon con base en porciones que se traslapaban para ensamblar la secuencia de
regiones más grandes de ADN y, al final, cromosomas completos.
SECUENCIACION DE SANGER

25. 1. Preparación de la muestra: la muestra de ADN se combina
con cebador, ADN polimerasa, nucleótidos normales y
nucleótidos didesoxi.
2. Ciclos de Polimerización: Se realizan ciclos de
calentamiento y enfriamiento para desnaturalizarlo.
Entonces la ADNpolimerasa sintetiza una nueva cadena de
ADN.
3. Se incorporan al azos de didesoxinucleótidos
4. Electroforesis Capilar en Gel: los fragmentos cortos se
mueven más rápido que los largos. Un láser ilumina los
fragmentos al cruzar la "línea de meta".
5. Secuenciación por Detección de Pigmentos: La secuencia
del ADN original se reconstruye leyendo la secuencia de
colores de los pigmentos registrados uno tras otro en el
cromatograma, que muestra la intensidad de fluorescencia
en función de la posición en el tubo.

26. Aunque actualmente los genomas se secuencian con otros métodos que son más
rápidos y menos costosos, la secuenciación de Sanger todavía se usa
ampliamente para secuenciar piezas individuales de ADN, como los fragmentos
utilizados en la clonación de ADN o los generados a través de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).

27. alta validez analítica y clínica
Para el estudio de mutaciones
puntuales en genes conocidos, es
la técnica de elección.
puede no detectar variantes
estructurales, deleciones o
duplicaciones
tiene un coste-eficacia
relativamente bajo cuando se
requiere el estudio de un gen de
gran tamaño o de varios genes

28. Altamente paralelas: ocurren muchas reacciones de secuenciación al mismo tiempo.
Microescala: las reacciones son diminutas y se pueden hacer muchas a la vez en un chip.
Rápidas: puesto que las reacciones se realizan en paralelo, los resultados están listos mucho más rápido.
Bajo costo: secuenciar un genoma es más barato que con la secuenciación de Sanger.
Longitudes más cortas: típicamente, las lecturas se obtienen con fragmentos de entre 50 a 700
nucleótidos de longitud.
SECUENCIACION DE NUEVA GENERACIÓN
Entre las aplicaciones de la secuenciación
están la detección precoz de síndromes y de
genes asociados a enfermedades y la
identificación de personas en ciencia forense.

29. GENOMA Y EXOMA COMPLETO
El exoma y el genoma completo son
dos técnicas de secuenciación de
ADN que permiten analizar la totalidad
de los genes en un individuo, con el fin
de identificar variaciones genéticas
asociadas a enfermedades

30. El exoma se refiere a la porción de ADN que codifica
proteínas, representando aproximadamente el 1-2%
del genoma humano. Está compuesto por los exones,
que son las regiones codificantes de los genes.
El genoma completo se refiere a la secuenciación de
todo el ADN de un individuo, incluyendo exones,
intrones y regiones no codificantes.

31. Extracción
de ADN
Fragmentación
de ADN
Captura de
exones
Amplificación y
clonación
Secuenciación
Análisis de
datos
Identificación
de variables
Análisis
funcional e
interpretación
Informe clínico

32. La mayoría de las variantes patogénicas
asociadas con enfermedades están
ubicadas en las regiones codificantes de los
genes.
Ventajas
Costo-efectivo
Mayor probabilidad de encontrar
mutaciones causantes de enfermedades
Ejemplos de Aplicaciones
Identificación de variantes responsables de
enfermedades monogénicas (por ejemplo, la
fibrosis quística).
Ventajas
Proporciona una visión más completa de la
variación genética, incluyendo regiones reguladoras
y no codificantes
Ejemplos de Aplicaciones
Identificación de variantes en regiones no
codificantes asociadas con riesgos de
enfermedades complejas (como la diabetes tipo 2).
Análisis de predisposición genética a ciertas
enfermedades (como el cáncer)
La secuenciación de genoma completo ha proporcionado
una visión detallada de la información genética de un
individuo, lo que ha llevado a avances significativos en la
comprensión y el dx de enfermedades genéticas.

33. Definición
Variante de la PCR, puede amplificar diferentes secuencias
de DNA en una reacción usando un par de cebadores.
Puede amplificar regiones génicas para identificar pacientes
afectados de deleciones o duplicaciones grandes en
múltiples loci. Esto es útil porque las mutaciones pueden
ocurrir en diferentes partes del genoma.
Inventada por Jan Schouten, un científico holandés.
MLPA

34. Usos
Puede ser complementaria al estudio de secuenciación para
incrementar la certeza diagnóstica en algunas entidades
mendelianas, como por ejemplo el síndrome de Rett.
En poblaciones distintas del origen judío asquenazí o del norte de
Europa, la secuenciación automatizada del gen CFTR (fibrosis
quistica) identifica cerca de 99% de las mutaciones responsables,
pero <1% se debe a deleciones grandes que pueden ser
identificadas por MLPA.
Las deleciones en el gen BRCA1 se encuentran presentes hasta en 20
a 30% de los casos de síndrome de cáncer de mama y ovario
familiar de origen holandés. Este tipo de mutación pasa inadvertido
en el estudio de primera línea (secuenciación automatizada) por lo
que en un resultado negativo está indicado el estudio de MLPA.
MLPA

35. Usos
Identificación de mujeres portadoras o heterocigotas para deleciones en el
gen DMD.
Las duplicaciones en exones de este gen provocan de 6 a 8% de
distrofinopatías, pueden identificarse con MLPA en ambos sexos.
MLPA

36. Los extremos de las sondas tienen una secuencia complementaria a unos cebadores
universales para permitir su amplificación por PCR
1. La secuencia blanco es reconocida por una sonda formada por 2 mitades (sonda 5´ y sonda
3¨) que se unen a la secuencia de ADN en estudio y a una secuencia específica para un par
de cebadores universales (primers X y Y).
2. Las 2 mitades de la sonda se unen al ADN desnaturalizado
3. Si la secuencia de reconocimiento está en el ADN, las sondas 5´ y 3´ quedan adyacentes, se
unen por la ligasa, forman una sonda única
MLPA

37. 4. Las sondas son amplificadas por PCR con el uso de un par de cebadores
universales
5. Los productos de la PCR se analizan por electroforesis capilar y se comparan con
un control normal para saber si existen deleciones o duplicaciones en estado
heterocigoto
MLPA

39. El avance de las técnicas de análisis genético ha transformado el diagnóstico de
enfermedades genéticas. A pesar de la utilidad de estas técnicas, es crucial
contar con asesoramiento genético antes de realizar pruebas, asegurando la
comprensión de sus implicaciones, posibles resultados y manejo. Profesionales
capacitados deben discutir detalladamente el proceso, incluyendo la posibilidad
de hallazgos incidentales o inciertos. La importancia de proporcionar
información por escrito y obtener un consentimiento informado firmado
también se destaca en este contexto.
CONCLUSIÓN

40. Lewis, T. (14 de abril de 2013). Human genome project marks 10°
anniversary (El Proyecto Genoma Humano cumple su décimo
aniversario). En LiveScience.
Ng, S.B., et al. (2009). Targeted capture and massively parallel
sequencing of 12 human exomes. Nature, 461(7261), 272-276.
Manolio, T.A., et al. (2009). Finding the missing heritability of complex
diseases. Nature, 461(7265), 747-753.
BIBLIOGRAFIA