Clase dictada hasta el 2010 a los alumnos de la Fac. de Ciencias Biológicas de la Univ. Nac. Mayor de San Marcos.

1. FISIOLOGÍA Y GENÉTICA
DE LA FIJACIÓN DE
NITRÓGENO
Prof.Mag.Débora E. Alvarado
Curso: Genética Microbiana
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

2. La Fijación de nitrógeno es una
cualidad exclusiva de los
procariontes.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

3. N2 atmosférico total 1015 ton
Ciclo transforma 3 x 109 ton N2 / año
diazotrofos
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

4. Importancia de la Fijación del
Nitrógeno en la naturaleza
 El gas Nitrógeno (N2) conforma el 79% de la
atmósfera pero no es directamente utilizable
por la mayoría de organismos.
 El Nitrógeno es requerido por todos los
organismos vivos, pero solamente unos pocos
pueden fijarlo de la atmósfera.
 El Nitrógeno es con frecuencia un nutriente
limitante en los ecosistemas de suelo.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

5. Colonización de pelo radical
por Azospirillum brasilense
Microfotografía
de transmisión
Marcación con sonda alfa1b
marcado con rodamina y
microfotografía de
epifluorescencia con imagen de
rastreo confocal
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

6. Árbol NifH
mostrando
los diferentes
grupos
microbianos
diazotrofos.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

7.  Los microorganismos procariónticos
fijan el 85% del N2 atmosférico, del cual
se fijan…
– 60% en el suelo
– 40% en el océano
 15% restante es fijado por:
– Combustión
– Relámpagos
– Producción industrial de fertilizantes
(síntesis de Haber-Bosch).
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

8. Bioquímica de la Fijación de
Nitrógeno
No reactivo
__ 945 KJ/mol
__ No disponible
N __ N
metabolicamente
Altamente estable
Dinitrogenasa
N2 + 4H+ + 4NADPH + 16-24ATP → 2 NH3 + 4NADP+ + 16-24ADP + 6Pi
Fijadores de N2 Diazotrofos
Lab.Microbiol.Molecular y
Biotecnología-UNMSM

9. Complejo
enzimático
reductasa
Sistema
Nitrogenasa
Pasos para la fijación
del N2:reducción de
N2 a 2NH3

10. Versatilidad del Complejo Nitrogenasa
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

11. Bacteria Fijadora de Nitrógeno
Nitrogenase
(Fe, Mo or V)
N2 NH4+
Nitrite reductase Bacteria
(Fe) Nitrogen nitrificante
NO2- NO3-
Bacteria Nitrate reductase
denitrificante (Fe, Mo)
Las más importantes enzimas para la asimilación
del N requieren Fe.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

12. Complejo enzimático Nitrogenasa
 Éste rompe el triple enlace de la molécula N2 para
producir nitrógeno atómico y subsecuentemente NH3.
 Dos proteinas están involucradas en el complejo,
cada una con subunidades múltiples.
– Dinitrogenasa, es una proteína que contiene Molibdeno y
Fierro (2 Mo/molécula, 22-24 Fe/molécula)
– Dinitrógeno reductasa, es una proteína que contiene
Fierro y Azufre (4 Fe/molécula, 4 S/molécula).
 En células que fijan nitrógeno, 10 al 40% de las
proteinas celulares pueden ser nitrogenasas.
 El proceso es relativamente lento y requiere 1,25 seg
para formar dos moléculas NH3.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

13.  La energía requerida para romper la molécula de
N2 (16 ATP aprox), es una inversiónsignificativa
de energía por las células.
– Cerca de 15 mg N2 es fijado por cada gramo de carbono
consumido para energía.
– Los organismos aeróbicos son algo más eficientes que los
organismos anaeróbicos.
 La producción de amonio industrial requiere altas
temperaturas (500oC), alta presión (~200 atm), y
un catalizador (usualmente Niquel).
– La producción de una tonelada métrica de NH3
requiere energía e hidrógeno de combustibles tales
como gas natural (31,000 ft3 ), o petróleo (5.5 bls) o
carbón mineral (2 Tm).
 La enzima nitrogenasa funciona a temperatura y
presión ambiental.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

14. Cianobacterias y la diazotrofía
Lab.Microbiol.Molecular y
Biotecnología-UNMSM

15. Adaptaciones morfológicas y de comportamiento de
cianobacterias en relación a la fijación del N2
Berman-Frank 2003
Res Microbiol 154:157–

16. Evolución de las
vías metabólicas
de la
fotosíntesis
oxigénica y la
fijación de N2.
Berman-Frank 2003
Res Microbiol 154:157–

17. Dos árboles propuestos
Gen nif vs spp
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

18. Nódulo Legumbre/Rhizobium
Sacos vasculares
Células fijadoras de N2
Células lignificadas

19. Los nódulos proveen un ambiente para los
microorganismos. La planta provee los substratos
orgánicos necesarios y protege a los organismos del
oxígeno por la presencia de leghemoglobina (compuesto
rojo parecido a la hemoglobina).
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

20. Intercambio de
señales químicas en
la comunicación entre
la leguminosa y la
bacteria de la familia
Rhizobiaceae
Straight, 2009
Annu. Rev. Microbiol.. 63:99
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

21. Mecanismos de protección de la
nitrogenasa contra el O2
Azotobacter
vinelandii.
Sabra, 2000
Appl Environ Microbiol 66:4037

22. Vista superficial, en microfotografía electrónica, de
células de Azotobacter vinelandii crecidas a 2.5 y 20%
de saturación de aire en un quimiostato con
limitacion de fosfato. PHB, poli-b-hidroxibutirato.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

23. Genética de la Fijación de
Nitrógeno.
Lab.Microbiol.Molecular y
Biotecnología-UNMSM

24. Lab.Microbiol.Molecular y
Biotecnología-UNMSM

25. Fijación de Nitrógeno en
presencia de Oxígeno
Streptomyces thermoautotrophicus
CO O2 N2
CO e- e-
deshidrogenasa
Str2 Str1
Nitrogenasas
2NH3
CO 2 O2 - Lab.Microbiol.Molecular y
Biotecnología-UNMSM

26. Regulación de la Fijación del N2
Uridililtransferasa Efector
N alostérico
Vía de
regulación
de nitrógeno
global
NifL, regulador
negativo de expresión
Vía de genes nif (inhibe NifA)
regulación de en proteobacterias.
oxígeno global Nif A, activador
Oxida
Flavoproteina transcripcional cataliza
NifL actividad de RNA
O2 polimerasa con factor
sigma 54 (regulación
Lab.Microbiol.Molecular y
Inhibición por O2
Biotecnología-UNMSM
dual)

27. Observación
microscópica del
contenido intestinal
de termites
Filogenia de bacterias
fijadoras de nitrógeno
en Reticulitermes
speratus, utilizando
secuencias de
aminoácidos NifH.

28. Perspectivas de investigación
 Plantas transgénicas con genes de nitrogenasa,
particularmente de aquellas no sensibles al oxígeno.
 Identificación, selección y mejoramiento genético de
bacterias diazotróficas asociadas a plantas.
– Con más motilidad y con mayor capacidad de adherencia.
– Con mayor tolerancia a estreses edáficos: acidez, salinidad
y alta temperatura.
– Reto, asociación con otra flora simbionte como las
micorrizas.
 Uso de diazotrofos en la remediación de derrames de
petróleo.
 Búsqueda de nuevos productores de nitrogenasas.
– Reto, búsqueda de enzimas con menor requerimiento
energético y menor sensibilidad al oxígeno.