GeneXpert Systems

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  • Billions of amplicon products are produced through PCR, in conventional PCR it is at this end point that PCR products are visualized, they are visualized on . . . . .
  • The Cepheid GeneXpert Diagnostic System automates and integrates sample purification, nucleic acid amplification, and detection of the target sequence in simple or complex samples using real-time PCR and RT-PCR methodologies. The system requires the use of single-use disposable GeneXpert cartridges that hold the PCR reagents and host the PCR process.
  • Smart beads are incorporated in to all Cepheid products. Utilizes proprietary dried reagent technology for ambient temp stability
  • • Utilize families of cartridges to address wide range of applications and specimen either RNA or DNA purification. We have developed assays to identify pathogens such as GBS, MRSA. For EV we purify RNA from CSF and for BCR we purify RNA from blood. Processing chambers—Hold samples, sample purification reagents, primers-probe and enzyme beads, processed sample, and waste solutions. • Valve body—Rotates and allows fluid to move to different cartridge chambers and to the reaction tube. Bacteria from the specimen are captured on a filter, washed to remove inhibitors and are ultrasonically lysed to release nucleic acid. The nucleic acid is mixed with PCR reagents (primer-probe bead and enzyme bead) and moved into the integrated reaction tube. • Reaction tube—Enables rapid thermal cycling, optical excitation, and detection of the target DNA. Advantages: Precision of microfluidics-based reconstitution of dry reagents No wet interface between instrument and cartridge to eliminate carry-over Integrated ultrasonic horn for rapid lysis of bacteria Unique filter capture/concentration technique Total internal control of reagent system – No separate external positive or negative controls required Smart fluidics Encoded software driven motors for valve movement and integral hydraulic drives Advanced micro fluidics technologies to enable complex sample prep processing protocols (many milliliters down to 10 micro liters)
  • The Cepheid GeneXpert Diagnostic System automates and integrates sample purification, nucleic acid amplification, and detection of the target sequence in simple or complex samples using real-time PCR and RT-PCR methodologies. The system requires the use of single-use disposable GeneXpert cartridges that hold the PCR reagents and host the PCR process. .
  • Cepheid offers the only platform to deliver an accurate, fast, and easy-to-use molecular solution in a single package. This unique solution is the best way for an institution to fully realize the benefits of molecular testing.
  • GeneXpert Systems

    1. 1. PAGE | PAGE | 1 Cambio de Cultura PCR en Tiempo Real ® Dra. Yamile Sandoval Pruebas diagnósticas PROMED Lic. Catherine Herrera Aplicaciones de Biología Molecular PROMED
    2. 2. PAGE | PAGE | 2 PRESENTAMOS EL LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR MAS PEQUEÑO DEL MUNDO GeneXpert® System
    3. 3. PAGE | PAGE | 3 Sistema GeneXpert® 1). Primer instrumento de diagnóstico molecular homologado por la FDA 2). El sistema GeneXpert es el único en combinar una preparación de muestra abordo con PCR en tiempo real 3). Resultados de muestras no procesadas en aproximadamente una hora.
    4. 4. PAGE | PCR EN TIEMPO REAL
    5. 5. PCR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PAGE |
    6. 6. PCR Ciclos PAGE | TARGET 8 COPIES 4 COPIES CYCLE 3 CYCLE 2 CYCLE 1 16 COPIES CYCLE N = 2 (N-1) COPIES
    7. 7. PAGE | Principios de PCR en Tiempo Real <ul><li>1). Se monitoriza ciclo a ciclo el producto amplificado, a través de una señal de fluorescencia en el momento en que se está dando la reacción de PCR </li></ul><ul><li> La región “Blanco” será amplificada en presencia de un reportero. </li></ul><ul><ul><ul><li>El Instrumento excita el reportero, detecta la señal del reportero y colecta los datos fluorescentes. </li></ul></ul></ul><ul><li>2). La señal de fluorescencia incrementa en proporción al producto amplificado </li></ul><ul><li>3). La señal fluorescente será colectada en la fase exponencial de la PCR ciclo a ciclo. </li></ul><ul><li>4). La medición puede ser graficada en forma logarítmica o lineal. </li></ul>
    8. 8. ENSAYO Taqman ® PRINCIPIO USADO EN LA PCR EN TIEMPO REAL PAGE |
    9. 9. Curva de Amplificación de PCR en Tiempo Real PAGE | BASELINE LOG-LINEAR PLATEAU EXPONENCIAL
    10. 10. CICLAJE Threshold (Ct) PAGE | (fluorescence units) CYCLE THRESHOLD THRESHOLD LINE END POINT FLUORESCENCE 178
    11. 11. <ul><li>Tecnología GeneXpert </li></ul>
    12. 12. Sistema de Diagnóstico GeneXpert ® <ul><li>Componentes del Sistema </li></ul><ul><li>GeneXpert </li></ul><ul><ul><li>Módulo </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Precisión de las fluídicas </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sistema térmico / Óptico </li></ul></ul></ul><ul><li>Cartucho </li></ul><ul><ul><li>Contenedor seguro, y de un solo uso </li></ul></ul><ul><li>Reactivos </li></ul><ul><ul><li>Secos y Húmedos </li></ul></ul><ul><li>Computadora </li></ul><ul><ul><li>Software, código de barras, impresora, UPS </li></ul></ul>PAGE |
    13. 13. Tecnología de Reactivos Cepheid <ul><li>Perlas enzimáticas </li></ul><ul><ul><li>Taq Polymerase </li></ul></ul><ul><ul><li>Componentes Generales de PCR </li></ul></ul><ul><li>Perlas TSR </li></ul><ul><ul><li>Primers y sondas dirigidas a las regiones blanco y secuencias conocidas </li></ul></ul><ul><li>Perlas SPC </li></ul><ul><ul><li>Bacillius globigii (Bg) </li></ul></ul><ul><ul><li>Control Interno Cepheid (CIC) </li></ul></ul>PAGE |
    14. 14. GeneXpert ® Módulo PAGE | Motor de la Jeringuilla Tarjeta Madre I-CORE Uniframe Motor de la válvula Horno Ultrasónico Puerta del Módulo
    15. 15. Cartucho GeneXpert ® PAGE | CÁMARAS DE PROCESAMIENTO TUBO DE REACCIÓN CUERPO DE LA VÁLVULA
    16. 16. GeneXpert ® : Un laboratorio de Biología Molecular en un cartucho <ul><li>Contiene todos los reactivos para una prueba en particular </li></ul><ul><li>Control de contaminación: </li></ul><ul><ul><li>Ni la muestra ni el reactivo salen del cartucho </li></ul></ul><ul><li>Preparación universal de la muestra </li></ul><ul><li>Corre nested PCR </li></ul><ul><li>Capacidad de tests reflejo </li></ul><ul><li>El material biológico se desecha fácilmente </li></ul>PAGE | Cartridge Body with Multiple Reagent Reservoirs PCR Reaction Tube Ultrasonic Interface Rotary Valve
    17. 17. I-CORE Modulo I ntelligent C ooling/Heating O ptical Re action Module PAGE |
    18. 18. PAGE | PAGE | 60 Kit GeneXpert
    19. 19. GeneXpert ® 6 Canales PAGE | Channel Excitation Range Emission Range Dyes 1 375-405 nm 420-480 nm CF1 2 450-495 nm 510-535 nm FAM 3 500-550 nm 565-590 nm Alexa Fluor® 532 4 555-590 nm 606-650 nm Texas Red® 5 630-650 nm 665-685 nm Alexa Fluor® 647 6 630-650 nm >700 nm CF6
    20. 20. PAGE | REPORTES SENCILLOS Y CON ACCESO A SISTEMAS LIS DEL LABORATORIO
    21. 21. PAGE | CUALIDADES DEL SISTEMA
    22. 22. PAGE | PAGE | 5 GeneXpert® PCR en tiempo real 1). Extracción automatizada de ADN o ARN de una muestra biológica 2). Cartucho cerrado de un solo uso
    23. 23. GeneXpert ® Escalas posibles del sistema PAGE | GX-I GX-IV GX-XVI GeneXpert Infinity Series GeneXpert Module
    24. 24. PAGE | Simple, Fácil, Walk-away
    25. 25. PAGE |
    26. 26. PAGE |
    27. 27. PAGE |
    28. 28. PAGE |
    29. 29. PAGE | Xpert MTB/RIF – Romain Prieur FÁCIL Uso RÁPIDO Respuestas CONFIABLES Resultados Pruebas Moleculares en corto tiempo y con resultados confiables
    30. 30. PAGE | PAGE | 4 GeneXpert® PCR en tiempo real Sources: Eveillard et.al., J Hosp Infect (v. 59, 2005); Salgado et.al., SHEA 2003, abstract 28, p. 61; Bhalla et a, Infect Control Hosp Epidemiol (v. 25, 2004) – Special thanks to Becton, Dickinson and Company. Los cultivos de bacteriología solo captan “ la punta del Iceberg” La transmisión se da no solo por pacientes infectados, sino también por pacientes colonizados
    31. 31. GeneXpert® PCR en tiempo real <ul><li>PRUEBAS DISPONIBLES </li></ul><ul><li>Análisis Clínicos (IVD-Enfermedades virales e infecciosas) </li></ul>PAGE |
    32. 32. PAGE | PAGE | 19 GeneXpert® PCR en tiempo real Xpert® vanA/vanB Xpert® MRSA complete Xpert® MRSA/SA SSTI Xpert® MRSA/SA Nasal Xpert® MRSA/SA BC Xpert® MTB/RIF Xpert® C. Difficile Xpert® GBS Xpert® EV Xpert® Flu A Panel Xpert® HemosIL® FII & FV Xpert® BCR-ABL
    33. 33. PAGE | PAGE | 20 GeneXpert® PCR en tiempo rea l <ul><li>Xpert® MTB/RIF </li></ul><ul><li>Prueba de PCR en tiempo real que permite detectar cepas del complejo M. Tuberculosis y de las cepas resistentes a la Rifampicina </li></ul><ul><li>Permite un análisis semicuantitativo in vitro de muestras de esputo y concentrado de lavado bronquial </li></ul><ul><li>Preparación : 2 minutos </li></ul><ul><li>Tiempo de incubación :15 minutos </li></ul><ul><li>Resultado: 90 minutos vs 1-2 sems en cultivos líquidos y 4-6 sems en los sólidos </li></ul>
    34. 34. PAGE | PAGE | 22 MTB/RIF - Xpert® permite 1- La detección del ADN del complejo MTB en muestras de esputo o sedimento concentrado ya sea de esputo o LBA, BAAR + o BAAR - 2- La detección de la mutación del gen rpoB /región 81bp que esta asociada a la resistencia a la rifampicina en pacientes de alto riesgo 3- La prueba MTB/RIF-Xpert® esta indicada en pacientes con sospecha clínica de TBC y en pacientes que no han recibido tratamiento, pacientes con menos de 7 días de tx. o pacientes que no han recibido tx en los últimos 60 días Cepheid Confidential & Proprietary GeneXpert® PCR en tiempo real
    35. 35. PAGE | Sensibilidad de las Pruebas de susceptibilidad Genotípicas Droga Blanco Sensibilidad Rifampicina rpoB 98% INH (katG), inhA 85% PZA pncA Etambutol emB
    36. 36. GeneXpert ® PCR en tiempo real PAGE |
    37. 37. PAGE |
    38. 38. PAGE | PAGE | 26 GeneXpert® PCR en tiempo real <ul><li>Xpert® vanA/vanB </li></ul><ul><li>Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico </li></ul><ul><li>Detección de los genes VanA y VanB que confieren al enterococcus la resistencia a la Vancomicina </li></ul><ul><li>1:8 de las infecciones hospitalarias son por enterococcus y de estas 30% resistentes a la Vancomicina </li></ul><ul><li>Pacientes de mayor riesgo UCI e inmunocomprometidos </li></ul><ul><li>Resultado: 45 minutos </li></ul><ul><li>Tipo de muestra: hisopado rectal y perianal </li></ul>
    39. 39. PAGE | PAGE | 28 GeneXpert® PCR en tiempo real <ul><li>Xpert® SA/MRSA complete </li></ul><ul><li>Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico </li></ul><ul><li>>60% de las infecciones hospitalarias son por staphilococcus aureus </li></ul><ul><li>Alta mortalidad </li></ul><ul><li>Ha demostrado tener una mayor sensibilidad diagnóstica que los métodos de cultivo cromogénico </li></ul><ul><li>Resultado: 56 minutos </li></ul><ul><li>Muestra: Hisopado nasal </li></ul>Pruebas que demandan en Control de Infecciones Nosocomiales
    40. 40. PAGE | PAGE | 30
    41. 41. PAGE | 26 GeneXpert® PCR en tiempo real
    42. 42. GeneXpert ® PCR en tiempo real PAGE | <ul><li>Causa la mayor morbilidad y mortalidad neonatal 1 </li></ul><ul><ul><li>Afecciones neurológicas </li></ul></ul><ul><ul><li>Fatal en el 5% de los infantes infectados </li></ul></ul><ul><li>Las guías del CDC especifican que se debe hacer la prueba a todas las pacientes embarazadas </li></ul><ul><li>La única prueba aceptada hasta el momento ha sido el cultivo </li></ul><ul><ul><li>Los cultivos toman tiempo – no es una opción para los nacimientos antes de término, ni para las mujeres sin control del embarazo o cuando los resultados no están disponibles (15 al 30% de los nacimientos) </li></ul></ul><ul><ul><li>Antibióticos profilácticos — la resistencia cada vez es mayor </li></ul></ul>Xpert® GBS
    43. 43. PAGE | BOX 2. Procedures for processing clinical specimens for culture of group B Streptococcus (GBS ---Detection of GBS can be determined directly from broth media using latex agglutination, probes or nucleic acid amplification tests (NAAT) such as PCR . Comprison of culture and 2 real-time polymerase chain reaction assays to detect group B Streptococcus during antepartum screening. Diagn Microbiol Infect Dis 2007;59:17–22. Block T, Munson E, Culver A, Vaughan K, Hryciuk JE.
    44. 44. PAGE | Para que una prueba sea considerada clinicamente útil en el período intraparto como método de tamizaje para GBS debe poder ser realizada de manera sencilla al lado de la cama del paciente, ya sea por el personal de la sala de labor o parto, deben obtenerse resulatdos en menos de 30 min y debe poseer una sensibilidad y especificidad >90% Revisión de las Guías CDC, 2010 Preparación : 2 minutos Resultado: 30 minutos Muestra: hisopado vaginal y rectal
    45. 45. PAGE | PAGE | 31 GeneXpert® PCR en tiempo real <ul><li>Xpert® C. difficile </li></ul><ul><li>Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico </li></ul><ul><li>Prueba diagnóstica rápida ~56 min. </li></ul><ul><li>Detección de cepas toxigénicas y epidémicas de Clostridium difficile 027/NAP1/B1 </li></ul><ul><li>Pacientes de riesgo: hospitalizados, exposición a AB, edad avanzada </li></ul><ul><li>Tipo de muestra: heces fecales </li></ul>
    46. 46. PAGE | PAGE | 31 GeneXpert® PCR en tiempo real
    47. 47. PAGE | PAGE | 20 GeneXpert® PCR en tiempo rea l <ul><li>Xpert® EV </li></ul><ul><li>Diagnóstico molecular rápido de meningitis causada por enterovirus </li></ul><ul><li>GeneXpert – Test de 2 horas </li></ul><ul><li>Puede reducir la necesidad de otras pruebas y el uso de antibióticos </li></ul><ul><li>Acceso a la prueba 24/7 </li></ul><ul><li>Tipo de muestra: LCR </li></ul><ul><li>Volumen de muestra 140µL </li></ul><ul><li>Preparación: 5 minutos </li></ul><ul><li>Resultado: 2.5 horas </li></ul><ul><li>***Detectará 60 serotipos de Enterovirus </li></ul><ul><li>La secuencia Target está en el 5’ UTR del RNA del enterovirus </li></ul>
    48. 48. PAGE | PAGE | 34
    49. 49. PAGE | PAGE | 35 GeneXpert® PCR en tiempo real <ul><li>Xpert® Influenza </li></ul><ul><li>Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico </li></ul><ul><li>Prueba diagnóstica rápida ~menos de 1 hora, resultados en tiempo real STAT </li></ul><ul><li>Detecta especímenes Flu A y H1N…diseño múltiplex </li></ul><ul><li>Mejor desempeño que pruebas rápidas EIA, que no detectan hasta 70% de las infecciones </li></ul>
    50. 50. PAGE |
    51. 51. PAGE | PAGE | 39 <ul><li>Poca manipulación de las muestras: no más de 6 minutos </li></ul><ul><li>Aprobación del FDA </li></ul><ul><li>Aprobación CE (Comunidad Europea) </li></ul><ul><li>Resultados: entre 30 minutos a 2 horas dependiendo de la prueba </li></ul><ul><li>No se requiere de espacios especiales </li></ul><ul><li>No se requiere de personal especializado en biología molecular </li></ul><ul><li>Descarte de material biológico sin riesgo de contaminación </li></ul>Sistema GeneXpert®
    52. 52. PAGE |
    53. 53. PAGE | PAGE | 41 Cambio de Paradigma Sistema GeneXpert® GRACIAS

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