Protocolos para diagnóstico de covid

1. PROTOCOLOS PARA EL
DIAGNÓSTICO DE COVID-19
POR LABORATORIO CLÍNICO
DRA. SARA SORIA ESTRUGO
BIOQUÍMICA

2. INTRODUCCIÓN
• El laboratorio clínico es el lugar donde un equipo multidisciplinario analizan
muestras biológicas humanas que contribuyen al estudio, prevención, y hace
investigación viable para el cuerpo humano
• El laboratorio clínico constituye un servicio de mucha importancia, ya que es
uno de los servicios de apoyo diagnóstico más importante; durante el
desarrollo de esta pandemia, esto no fue la excepción.

3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
Los métodos de diagnóstico para la detección del virus SARS-CoV-2
(agente causal de la enfermedad COVID-19), son los siguientes:
• PCR
• Pruebas cuantitativas para la determinación de anticuerpos
• Pruebas rápidas para la detección de antígenos
• Pruebas cualitativas para la detección de anticuerpos

5. *MÉTODOS MOLECULARES: REACCIÓN DE LA CADENA
POLIMERASA EN TIEMPO REAL (RT-PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de
ADN. El método utiliza secuencias cortas de ADN llamados cebadores para seleccionar la parte del genoma a
amplificar. Ahora, haremos mención a todos los tipos de PCR:
• Existen dos tipos de PCR: PCR convencional y PCR en tiempo real. Ambas tienen el mismo principio de
multiplicar la región de interés, pero se diferencian en que la PCR en tiempo real es más específica debido al uso
de otros elementos denominados sondas y tiene la ventaja de que la detección se va realizando mientras
aumenta el número de copias de la región de interés, es decir que la detección se hace en tiempo real
permitiendo de esta forma, además de detectar, cuantificar la cantidad de ADN del patógeno que pueda
encontrarse en la muestra clínica.
Entre otros tipos de PCR tenemos:
• PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de millones de fragmentos, ya que se realiza
en 2 PCR consecutivas.
• PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios fragmentos de ADN a la vez, en una sola reacción
y con una sola muestra. Esto nos permite detectar varios patógenos en una sola muestra.
• PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): en este caso se extrae ARN a partir de la muestra. Luego, este ARN se
convertirá en ADN por un proceso llamado transcripción reversa. En este proceso se utiliza la enzima
transcriptasa inversa.

6. *MÉTODOS MOLECULARES: REACCIÓN DE LA CADENA
POLIMERASA EN TIEMPO REAL (RT-PCR) (CONT.)
• La PCR en tiempo real es una técnica que combina la amplificación y la detección en un mismo paso, al
correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad de
fluorescencia. (A menor número de ciclos, mayor cantidad de material genético)
• Para la amplificación por PCR en tiempo real además de los reactivos que se emplean en la PCR punto
final, es necesario emplear un fluoróforo. En algunos ensayos cuantitativos se requiere determinar el
número de moléculas ARNm, por lo que es necesario llevar a cabo una reacción de transcripción
reversa (RT) del ARNm a ADNc antes de que se aplique la PCR en tiempo real. En este caso, el ensayo se
conoce como retrotranscripción o RT acoplada a la PCR (RT-PCR), la que puede realizarse en uno o dos
pasos. Finalmente, se realiza la amplificación (síntesis) del ADN o ADNc en un termociclador acoplado a
un sistema óptico, que monitorea la señal de los fluoróforos usados para detectar el producto
amplificado. Debido a que la fluorescencia de éstos aumenta conforme el producto se amplifica, se
combinan los procesos de amplificación y detección en una sola etapa.

7. *MÉTODOS MOLECULARES: REACCIÓN DE LA CADENA
POLIMERASA EN TIEMPO REAL (RT-PCR) (CONT.)
• Los equipos para llevar a cabo la PCR en tiempo real incluyen un termociclador y una unidad capaz de
detectar señales fluorescentes (fluorómetro) para monitorear el progreso de la reacción de
amplificación, así como un Hardware y un Software para la captura y el análisis de los datos,
respectivamente. El termociclador del equipo debe ser capaz de mantener una temperatura uniforme
para todas las muestras y ser lo suficientemente rápido en la transición de temperaturas de una etapa a
otra (desnaturalización del ADN molde, alineamiento de los oligonucleótidos y síntesis). El sistema
fluorométrico consiste en una fuente de energía para excitar a los fluoróforos (a una determinada
longitud de onda de excitación) y un sistema de detección, que permita monitorear la señal emitida (a
una longitud de onda de emisión). La fuente de energía que proporciona la luz de excitación para los
fluoróforos puede provenir de una lámpara (tungsteno), una resistencia (diodo emisor de luz) o un
láser. Las diferentes longitudes de onda de emisión se detectan con dispositivos que incluyen filtros,
multiplicadores y fotodetectores.

8. *MÉTODOS MOLECULARES: REACCIÓN DE LA CADENA
POLIMERASA EN TIEMPO REAL (RT-PCR) (CONT.)

9. *MÉTODOS MOLECULARES: REACCIÓN DE LA CADENA
POLIMERASA EN TIEMPO REAL (RT-PCR) (CONT.)
• Actualmente, la PCR en tiempo real es el método más sensible para detectar y cuantificar el material
genético del agente causal del COVID-19
• El protocolo para SARS-CoV-2 se basa en la detección de dos marcadores en el genoma del virus: el gen
E, utilizado como tamizaje, seguido de la confirmación de los positivos a este gen a través de la
detección del gen RdRP.

10. TOMA DE MUESTRA PARA LA DETECCIÓN DE SARS-
COV-2
• La toma de muestra para la detección del virus SARS-CoV-2 en muestras de hisopado nasofaríngeo o
aspirado bronquial debe ser realizada solamente por personal autorizado, ya que el personal que
realizará estos procedimientos es personal entrenado en la misma, en el cuidado propio y del paciente,
el uso correcto del equipo de bioseguridad y el transporte adecuado de las muestras.

11. PASOS A SEGUIR PARA LA TOMA DE MUESTRA PARA
COVID-19
• Primeramente, el personal debe tener todo el material preparado, y estar con la vestimenta adecuada:
a) Equipo de Protección Personal:
 Bata de laboratorio y bata quirúrgica desechable
 Barbijo N95
 Guantes de nitrilo (en caso de no tener de este material, utilizar doble guante de látex)
 Gafas de protección con cubierta lateral
 Protector para zapatos

12. PASOS A SEGUIR PARA LA TOMA DE MUESTRA PARA
COVID-19

13. PASOS A SEGUIR PARA LA TOMA DE MUESTRA PARA
COVID-19
• b) Datos del paciente:
 Nombre del paciente
 Sexo
 Dirección
 Nombre del establecimiento de salud que remite la
muestra
 Número de habitación (o si fue tomada de manera
ambulatoria)
 Nombre del médico que realizó la solicitud del
estudio
 Datos de contacto del paciente
• c) Información de la toma de muestra:
 Fecha y hora de recolección
 Sitio anatómico de la toma
 Pruebas solicitadas
 Síntomas clínicos y antecedentes relevantes del
paciente.

14. PASOS A SEGUIR PARA LA TOMA DE MUESTRA PARA
COVID-19
d) Muestras de hisopado orofaríngeo y
nasofaríngeo:
• Las muestras adecuadas para la detección de
covid-19 son:
 Muestras del tracto respiratorio inferior
 Aspirado traqueal
 En caso de no poder recolectarse estas
muestras, las muestras del tracto respiratorio
superior también son útiles
e) Conservación de las muestras:
Todas las muestras se deben conservar entre 2 y
8°C

15. PROCEDIMIENTOS PARA LA TOMA DE MUESTRA:
HISOPADO OROFARÍNGEO
• Registrar los datos del paciente en el medio de transporte
• Lavarse las manos antes de colocarse el EPP
• Comprobar que el barbijo ejerce ajuste
• Solicitar al paciente que abra la boca
• Sujetar la lengua con un bajalenguas
• Introducir el hisopo hasta la pared posterior de la garganta y tomar la muestra
de forma circular
• Luego de tomada la muestra, colocar el hisopo en el medio de transporte
• Cerrar el tubo y conservar
• Lavarse las manos en el sitio de toma de muestra
• Lavarse las manos al retirarse el EPP

16. PROCEDIMIENTOS PARA LA TOMA DE MUESTRA:
HISOPADO OROFARÍNGEO
• Registrar los datos del paciente en el medio de transporte
• Lavarse las manos antes de colocarse el EPP
• Comprobar que el barbijo ejerce ajuste
• Recostar al paciente y pedir que eleve un poco la cabeza
• Introducir por una fosa nasal el hisopo suavemente, de
manera paralela, casi en su totalidad hasta llegar a la cavidad
nasofaríngea (aprox. 2.5 cm en adultos y un poco menos en
niños)
• Rotar el hisopo y retirar sin dejar de rotar
• Luego de tomada la muestra, colocar el hisopo en el medio
de transporte
• Cerrar el tubo y conservar
• Lavarse las manos en el sitio de toma de muestra
• Lavarse las manos al retirarse el EPP

17. CONSERVACIÓN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS
• Las muestras respiratorias deben mantenerse refrigeradas (2-8 °C) y enviarse al laboratorio donde se
procesarán dentro de las 24-72 horas de la toma. Si no se pueden enviar las muestras dentro de este
período, se recomienda congelarlas a -70 °C (o menos) hasta que se envíen (asegurando que se
mantenga la cadena de frío). Si los hisopos se colocaron en solución salina estéril en lugar de medio de
transporte viral, el envío debe ser expedito.
• El transporte debe realizarse con geles o pilas congeladas. Un aumento de la temperatura al momento
del transporte, se verá afectado el resultado, ya que puede dar falsos negativos. No procesar muestras
cuya temperatura al transporte sea mayor a 8°C
• El envío de las muestras debe coordinarse con la Unidad de Epidemiología de los SEDES
• Se debe enviar las mismas con la respectiva hoja epidemiológica

18. CONSERVACIÓN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS
• Prepare el material para realizar el empaque

19. CONSERVACIÓN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS

20. CONSERVACIÓN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS

21. CONSERVACIÓN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS

22. CONSERVACIÓN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS

23. CONSERVACIÓN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS

24. VENTAJAS DE LA TÉCNICA DE PCR
• Es una técnica bien establecida, comercializada por muchas compañías
• Adaptable a secuencias diana como sea necesario en un tiempo
relativamente corto, una vez se conoce la secuencia genómica a detectar
• Alta sensibilidad y especificidad; la especificidad aumenta porque como
es amplificación de un amplicón obtenido previamente, los cebadores
sólo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será
una única banda.
• Los ensayos de la PCR en tiempo real son entre 10,000 y 100,000 veces
mas sensibles que las pruebas de protección por ARNasa,1 1,000 veces
mas sensibles que la hibridación por Dot blot (Esta técnica permite
identificar moléculas de ARN al aplicarlas como puntos en una
membrana a través de succión con vacío, para su posterior hibridación
con una sonda marcada) y pueden detectar diferencias de una sola
copia del ADN

25. LIMITACIONES DE LA PRUEBA DE PCR
• Se necesita personal especializado
• Este personal es necesario, ya que se debe evitar en lo más mínimo la contaminación del material a
analizar, ya que si se purifica y aísla mal el material, se puede destruir el mismo y generar resultados
erróneos.
• Requiere equipos especializados y de uso exclusivo
• Requiere instrumentación especializada
• Requiere instalaciones especializadas para evitar la contaminación de las muestras.
• La técnica conlleva problemas de reproducibilidad y fiabilidad, por lo que dificulta su estandarización
• Lleva mucho tiempo procesarla (a menor cantidad de CT, mayor cantidad de material genético)
• Es muy costosa

26. PRUEBAS RÁPIDAS MOLECULARES
• Son pruebas basadas en tecnología de diagnóstico molecular (PCR), pero con modificaciones para que
el tiempo de reporte sea más rápido.
• Son de sistema cerrado, es decir que solo aceptan los reactivos propios de su línea.
• Tienen alta especificidad y sensibilidad.
• Solo dos compañías tiene aprobados estos tests, XpertXpres SARS-CoV-2 y Abbott ID Now Covid-19 test
• Estas pruebas son las que se realizan en equipos de sistema cerrado

27. PRUEBAS RÁPIDAS MOLECULARES
• Actualmente, varios de los laboratorios COVID pertenecientes al Ministerio de Salud trabajan con este
tipo de equipos
• El equipo utilizado en estos laboratorios es el GeneXpert
• Es un equipo compacto, de procesamiento rápido, no requiere de mucho procedimiento para el
procesamiento de las muestras.
• Es un equipo que se puede utilizar como “punto de cuidado” (point of care), con lo que se anula el
tiempo de procesamiento, gastos de logística y transporte de muestras.
• Se puede utilizar para hacer pruebas de emergencia para detección del virus SARS-CoV-2, ya que el
resultado sale en menos tiempo que en los equipos convencionales

28. GENEXPERT

29. GENEXPERT

30. VENTAJAS DE UTILIZAR EL EQUIPO GENEXPERT
• Pruebas diarias a demanda (no hay un límite)
• Tiempo de manipulación en menos de 1 minuto
• Compatible con cualquier volumen de laboratorio
• No requiere de salas específicas (por probable contaminación de la muestra al momento de procesarla)
• Software con interpretación de resultados
• No requiere mantenimiento diario (sin gestión de residuos líquidos)
• Se pueden realizar diferentes pruebas en la misma plataforma (no limitada a una sola, cada canal es
independiente)
• Tiempo de reacción 45 minutos

31. LIMITACIONES
• Cantidad limitada de muestras a procesar (en 6 horas solo se pueden procesar 24 muestras, comparado
con otros equipos (esto si el laboratorio cuenta con el equipo de 4 canales
• Sistema cerrado
• Los cartuchos de COVID-19 (para la determinación por separado del virus) no están disponibles para
laboratorios privados.