Impacto clínico de las nuevas técnicas de diagnóstico en el Laboratorio de Microbiología Clínica

1. Impacto clínico de la incorporación
de nuevas técnicas en el diagnóstico
microbiológico
Jesús Martínez López R4
Servicio Microbiología

2. Índice
• Definición y Objetivos Microbiología Clínica
• Perspectiva histórica
• Nuevas técnicas:
– Técnicas rápidas de diagnóstico
– Sistemas de detección multiplex
– Next-generation Sequencing (NGS)
– Proteómica: MALDI-TOF
• Desafíos y oportunidades
• Conclusiones

3. Definición
• Microbiología clínica:
– RAE: microbiología.
• (De microbio y -logía).
– 1. f. Estudio de los microbios.
“Estudio de los microorganismos (bacterias, hongos,
parásitos y virus) que afectan al ser humano”
Microbiología
clínica
Biología
Bioquímica
Epidemiología Patología
Fisiología
Farmacología
Bacteriología Virología Micobacteriología
Micología Parasitología Serología
Susceptibilidad
antimicrobiana
Microbiología
molecular

4. Objetivos
• Diagnóstico etiológico
– Muestras / Orientación diagnóstica
– Patógenos emergentes
• Tratamiento
– Análisis de sensibilidad antimicrobiana (CMI)
– Orientación tratamiento (empírico y dirigido)
– Guías clínicas de tratamiento
• Prevención
– “Centinelas” de enfermedades infecciosas (EDOS, SVE,
SAEI, SIMIC, Medicina Preventiva)
– Vigilancia de resistencias antimicrobianas (EARSS,
Medicina Preventiva) Nat Rev Microbiol 2013; 11: 574-585

5. Historia Lab. Microbiología
1610
Microscopio
óptico
1676
“Animáculos”
1876
Cultivo
1887 T.
Gram
1928
Penicilina
1968 Bactec
Radiometric
70s
ELISA,
Secuenciación,
API
1939
Microscopio
electrónico
1986
PCR
90s
Automatización
Microarrays
IC POC
MALDI-TOF
2000s
Medios
cromogénicos
Técnicas rápidas
dPCR
Piroseq
Ion torrent
Illumina
SOLiD

6. Logros
• ↓ Tiempo de respuesta
• ↑ Detección de microorganismos

7. Logros
Recepción de
muestras
Cultivo
24-48h
Identificación y
antibiograma
18h
Confirmación
resultados
18h
Bacteriología general: 2-4 días
Bacterias anaerobias y fastidiosas: 5-15
días
Virus: días –semanas
Hongos: días - semanas
Micobacterias: meses
Técnicas
rápidas
(minutos)
Microarray
PCR multiplex
(horas)
Microarray
PCR multiplex (horas)
MALDI-TOF(minutos)
NGS (horas-dias)

8. Técnicas rápidas de
diagnóstico

9. Técnicas de diagnóstico rápido
Técnicas de diagnóstico microbiológico, con relevancia en el manejo de
pacientes, cuyos resultados pueden ser obtenidos en un tiempo
inferior a los métodos convencionales
Técnicas inmunodiagnósticas
• Detección Antígeno (Ag S. pneumoniae, S. pyogenes, etc)
• Detección de Anticuerpos (VIH-1, Ac heterófilos, etc)
Resultados (min – hora)
Técnicas moleculares detección de determinantes génicos
Resultados (horas)

10. Técnicas de diagnóstico rápido
• Antígenos de Plasmodium

11. Técnicas de diagnóstico rápido
• Antígenos de Plasmodium
– “46. Lograr el acceso universal a las pruebas de diagnóstico de todos los casos presuntos de malaria.
Para confirmar el diagnóstico presuntivo de malaria en todos los casos se deben practicar pruebas de
detección del parásito, como el examen microscópico de buena calidad o una prueba de diagnóstico
rápido (…) . Lograr el acceso universal a las pruebas de diagnóstico reducirá el uso excesivo del
tratamiento combinado basado en la artemisinina, que es la pauta de primera línea para tratar la
enfermedad sin complicaciones, y también la presión selectiva de los medicamentos sobre los
parásitos.”

12. Técnicas de diagnóstico rápido
• Antígenos de Plasmodium
– Resultado rápido (5-20 min)
– Muestra: tubo EDTA
– Ag: HRP-2  P. falciparum
Aldolasa Pan-Plasmodium
Am J Trop Med Hyg. 2007;77(6 Suppl):119-27.

13. Técnicas de diagnóstico rápido
• Antígenos de Plasmodium
– S: 90-92% , mayor para P. falciparum y
dependiente de nivel de parasitemia Un
resultado negativo no excluye malaria
– No es posible monitorizar tratamiento
– No permite estimar el grado de parasitemia
MICROSCOPíA

14. Técnicas de diagnóstico rápido
• PCR Clostridium difficile
– Diarrea asociada al uso de antibióticos en entorno
hospitalario
– Factores de virulencia:
• Toxina A y B (tcdA, tcdB)
• Toxina binaria (algunas cepas)
– Detección de cepas toxigénicas

15. Técnicas de diagnóstico rápido
• PCR Clostridium difficile
– Objetivos:
• EpidemiológicoLimitar la transmisión intrahospitalaria
• Disminuir morbimortalidad asociada a la infección por
Clostridium difficile (CDI)
– Algoritmos diagnósticos 2 pasos (Clin. Microbiol. 2009; 51:
1152-1157)
Método clásico: cultivo citotoxigénico (3-4 días)
Nuevos métodos: EIA/ICT (minutos) + PCR (horas)

16. Técnicas de diagnóstico rápido
• PCR Clostridium difficile
– Facilidad de uso muestra directa
– Rapidez en los resultados
– Economiza recursos: disminución de tratamiento
innecesario, aislamiento paciente, duración estancia
hospitalaria Infect Dis Ther. 2014 Sep 3. [Epub ahead of print]
J Clin Microbiol. 2015 Jan;53(1):332-5.

17. Técnicas de diagnóstico rápido
• Ventajas
– Facilidad de uso e interpretación
– Inicio inmediato de antibioterapia específica
– consumo innecesario de antibióticos
– presión selectiva
• Desventajas
– Pérdida de datos de sensibilidad Cultivo y antibiograma
– Contexto clínico  Portadores asintomáticos
– Infecciones mixtas  Detección de 1 patógeno

18. Sistemas de detección
multiplex

19. Qué son
• Técnicas diseñadas para diagnóstico microbiológico rápido de
cuadros clínicos con etiología diversa
• Aplicación:
 Cuadros clínicos graves (sepsis, meningitis, neumonía)
Orientación del tratamiento
 Microorganismos de crecimiento exigente / lento
(Bordetella spp, Mycoplasma spp)  Evitar demora en
resultados
 Sensibilidad baja (Cryptosporidium spp)  Evitar FN
 Virus  Rapidez en resultados – Evitar tratamiento
antibiótico innecesario

20. Paneles según clínica
• Panel de patógenos respiratorios
• Panel de patógenos entéricos
• Panel de sepsis
• Panel de meningitis/encefalitis
• Panel de ITS

21. Microarrays
● Hibridación especifica entre ácidos nucléicos
● Tipos
– Sólidos → Detección del objetivo sobre superficie
– Líquidos → Detección de objetivo mediante citometría de
flujo

22. Microarrays
● Potencial: 100 a >106 patógenos y
mecanismos de resistencia detectados/ array
● Rapidez en resultados: 1,5-2h (PCR previa)

23. Panel PCR multiplex a tiempo real
• Detección de múltiples microorganismos en
una misma muestra basada en amplificación
DNA por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) a tiempo real (rt-PCR)
• Panel de patógenos según sintomatología
clínica
 Alta sensibilidad y especificidad
 Sistemas con extracción “offline” y automatizada

24. Panel PCR multiplex a tiempo real
Extracción “offline”
 Septifast: muestras de sangre en paciente
séptico N=20

25. Panel PCR multiplex a tiempo real
 Septifast
• Sensibilidad subóptima vs hemocultivo (42-79%)*
• Confirmación por cultivo en el 67% muestras
positivas*
• Necesidad de estudios prospectivos que evalúen el
impacto en resultados clínicos
Sustituido por las nuevas técnicas multiplex
automatizadas
• Clin. Microbiol. Infect 2009; 15:544-551
Intensive Care Med 2010; 36: 241-247
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2009; 28:569-573

26. Panel PCR multiplex a tiempo real
Muestra directa
 FilmArray
 Automatización rtPCR en múltiples micropocillos
con reactivos para nPCR única / pocillo y lectura
individualizada / pocillo

27. Panel PCR multiplex a tiempo real
 FilmArray N=24+3
• Panel respiratorios, sepsis y gastroenteritis
Gram + Gram - Levaduras Resistencia antibiótica
Enterococcus A. baumannii C. albicans mecA- resistencia meticilina
L. monocytogenes H. influenzae C. glabrata van A/B - resistencia vancomicina
Staphylococcus N. meningitidis C. krusei KPC- resistencia carbapenemas
S. aureus P. aeruginosa C. parapsilosis
Streptococcus Enterobacteriaceae C. tropicalis
S. agalactiae E. cloacae complex
S. pyogenes E. coli
S.pneumoniae K. oxytoca
K. pneumoniae
Proteus
S. marcescens

28. Panel PCR multiplex a tiempo real
 FilmArray
• Elevada Sensibilidad y Especificidad (>91%;
>97%)*
• Cultivos polimicrobianos (S: 70%)
• 1 muestra / ensayo
• Enterococcus spp  E. faecalis >>>S E.
faecium
• Microorganismos no presentes en el panel??
*J. Clin. Microbiol 2013; 51:4130-4136
Expert Rev.Mol.Diagn. 2013; 13:779-788
J. Clin. Microbiol 2013; 51:1528-1533
Diagn. Microbiol. Infect. Dis 2014; 79:183-186

29. Conclusiones
• Ventajas
• Rapidez en la obtención de resultados (1-5h)
• Detección múltiple microorganismos en una
misma muestra (+ mecanismos de resistencia)
• Potencial : reducción de costes del manejo del
paciente, tiempo de terapia subóptima, reducción
de estancia hospitalaria, y costes globales para
pacientes infectados con SARM, Enterococcus o
Candida spp*
• Clin.Infec.Dis 2010; 51:1074-1080
J.Clin.Microbiol 2006; 44:3381-3383
Antimicrob. Agents Chemother.2008; 52:3558-3563

30. Conclusiones
• Desventajas
• Detección limitada al panel
• Resultados negativos??  Hemocultivo/Cultivo
• DNAemia = Bacteremia/Fungemia = Peor
pronóstico??
• Genotipo ≠ Fenotipo  Cultivo + sensibilidad
• Antibiograma?? CMI??
• Sistemas caros (automatizados>>manual)
Selección población diana

31. Next-Generation Sequencing
(NGS)

32. NGS
• Secuenciación paralela de miles o millones de
secuencias a la vez rendimiento coste
(€/Mb secuenciado)
• Investigación  FUTURO??

33. NGS
PROCESAMIENTO
PREVIA SEQ
AMPLIFICACIÓN Y
SECUENCIACIÓN
ACOPLADAS

34. NGS
• Aplicaciones:
o Secuenciación de productos obtenidos por PCR
o Estudios de epidemiología
(brotes, patógenos emergentes, infección nosocomial)
o Secuenciación de genomas completos
o Secuenciación de transcriptomas
o Metagenómica
o “Ultradeep Sequencing”  Virus

35. NGS
• Detección de resistencias
o Detección de SNPs asociados a R antibiótica en múltiples
loci
- M. tuberculosis: RIF + INH + FQ – rpoB, katG, gyrA
S: 96,7%, 64%, 70%; E: 97,3-100% (J.Clin.Microbiol. 2009; 47:3985-3990)
- VIH: ITIAN, ITINN, IP, (IIN)

36. NGS
• Epidemiología
o Brote E. coli (EHEC O104:H4) en Alemania (2011)
Caracterización de las cepas
mediante análisis filogenético en
genomas completos.
PLoS One. 2011;6(7):e22751

37. NGS
• Ultradeep sequencing
o Detección de poblaciones minoritarias resistentes (VIH)
- Secuenciación Sanger: límite de detección de variantes
resistentes en el 15-20% población
- NGS: <1% población
Test de resistencias previo inicio de tratamiento
Aumento de carga viral atribuible a fallo terapéutico
Clin Infect Dis. 2008 Jul 15;47(2):266-85

38. NGS
o Metagenómica: identificación de todos los
genomas de microorganismos que comparten un
nicho ecológico concreto
Esputo y aspirado bronquial
vs
BAL y biopsia bronquial en EPOC
o Coinfección
J Clin Microbiol. 2012 Nov;50(11):3562-8

39. NGS
• Conclusiones – Uso en investigación
o Identificación de patógenos específicos
o Identificación de patógenos en brotes/emergentes
o Identificación de patógenos infección nosocomial
o Identificación de subpoblaciones minoritarias
o Identificación de mecanismos de resistencias conocidos
o Limitaciones propias a las técnicas de BM (conocimiento
previo)
o Preparación pre-seq "offline” formación técnica
o Limitación nº muestras simultaneas
o Detección de genes ≠ Expresión de genes y fenotipo
o Sistemas muy caros

40. Proteómica: MALDI-TOF

41. MALDI-TOF
• Conjunto de proteínas que definen una especie
microbiana
• Matrix assisted laser desorption ionization-time
of flight
Separación de proteínas según
relación masa carga (m/z)

42. MALDI-TOF
Recepción de
muestras
Cultivo
24-48h
ANTIBIOGRAMA
10-18h
Confirmación
resultados
18h
IDENTIFICACIÓN SOBRE
CULTIVO POSITIVO
(minutos)
Identificación y
antibiograma (18h)

43. MALDI-TOF
• Espectro de masas único para cada especie microbiana
o BBDD: 30,000 espectros para 750 especies (648 B/MB + 109 H)
o "Aprendizaje"  desarrollo continuo de la BBDD
• Equipos ID tradicionales:
- Dependiente del crecimiento y metabolismo bacterianoBacterias
aerobias metabolismo no exigente
• MALDI-TOF:
- Bacterias aerobias
- Bacterias anaerobias
- Micobacterias
- Hongos levaduriformes
- Hongos filamentosos

44. MALDI-TOF
• Identificacion a partir de colonia
• Disminución radical en el tiempo de respuesta ID
Sistemas automatizados enz (18h)  minutos /colonia
Concordancia 90-95% (16S)
Ahorro ID
PLoS One 2011;6:e16424
J.Clin.Microbiol.2011;49:887-892
J.Clin.Microbiol.2012;50:3301-3308
Mínimo: 1,5 x 105 ufc
muestra
Colonias aisladas

45. MALDI-TOF
• Identificación bacteriana en muestra directa
• Muestras de hemocultivos positivos
 Hemocultivo monomicrobiano
 Tiempo de respuesta: 2h
 Permite el inicio de terapia antimicrobiana  E. local
 Impacto manejo paciente: tiempo para terapia
antimicrobiana óptima y mortalidad 30 días
• Muestras de orina
 Orina >105 UFC/mL de una especie microbiana
 Tiempo de respuesta: 1h
 Guía terapia empírica  Epidemiología local
Clin.Infect.Dis 2013;57:1237-45
Arch.Pathol.Lab.Med
2013;137:1247-54

46. MALDI-TOF
• Identificación de resistencias antimicrobianas
Detección antibiótico degradado en el
espectro
• Resistencia mediada por mecanismos
enzimáticos
• Tiempo de respuesta: 1-3 h
• Laborioso
• No aplicable a otros mecanismos de
resistencia
J.Clin.Microbiol 2012; 50:2241-43
J.Clin.Microbiol.2012;50:927-37

47. MALDI-TOF
• Identificación de resistencias antimicrobianas
Detección de cambios en el espectro de masas
gracias a un marcador de crecimiento bacteriano
(aa marcado) en presencia del antibiótico
• Marcador: aminoácido marcado con isótopos
estables (13C6
15N2-L-Lys)
• Tiempo de respuesta: 2,5 h
• Detección de resistencia «fenotípico», basado
en el crecimiento, válido para cualquier
mecanismo de resistencia
• Muy laborioso
J.Clin.Microbiol 2013; 51:3741-48

48. MALDI-TOF
• Ventajas / Desventajas
- Reducción en el tiempo de respuesta para identificación de
bacterias, micobacterias y hongos (muestras positivas, TRAS
CULTIVO)
- Tratamiento dirigido según epidemiología local
- Identificación económica
- Facilidad de procesamiento
- No es posible identificar microorganismos en la mayor parte de
muestras directas
- No es posible identificar múltiples microorganismos en
muestras complejas
- E. coli ≠ Shigella spp , S. mitis ≠ S.pneumoniae  Revisión
software y picos específicos
- No Antibiograma  Epidemiología local

49. Conclusiones

50. DESAFÍOS Y OPORTUNIDADES
● Incremento infecciones asociadas a cuidados sanitarios y de las
resistencias a antimicrobianos
– Optimización de los recursos, diagnóstico rápido y eficaz de los
mecanismos de resistencia antimicrobiana, PROA, CMI -
tratamientos basados en PK/PD
● Consumismo creciente
– Diagnóstico microbiológico con técnicas rentables y selección de
pacientes
● Seguridad alimentaria
– Identificación y vigilancia de brotes alimentarios (E.coli O104:H4)
● Cambio climático
– Identificación y vigilancia de enfermedades emergentes y
reemergentes

51. DESAFÍOS Y OPORTUNIDADES
● Centralización
- Nuevos medios de transporte y sistemas de comunicación adecuada para la
información rápida y útil de los resultados obtenidos a los clínicos
● Incremento de información generada
– Correlación de la información genética obtenida con los resultados clínicos
asociados
● Validación de nuevos ensayos para uso clínico
– Organismos internacionales que definan estándares de validación de las
nuevas técnicas
● Disponibilidad nuevas técnicas (espacial/temporal)
– Disponibilidad del beneficio de estas técnicas (sistemas multiplex)
independientemente del tamaño del hospital

52. CONCLUSIONES
● Disminución en el tiempo de respuesta
– Identificación
– Mecanismos de resistencia
● Aumento del espectro de microorganismos detectados con mayor sensibilidad y
especificidad
● Objetivo: ganar tiempo para el manejo adecuado del paciente →Cuanto antes mejor.
– Reducción estancia hospitalaria
– Reducción uso de antibióticos  Reducción presión selectiva
– Reducción en los costes globales

53. CONCLUSIONES

54. FIN