Tema 13 el adn y la ingeniería genética

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  • INSULINA: Una de las primeras aplicaciones prácticas de la ingeniería genética fue la utilización de bacterias de crecimiento fácil para producir proteínas, como por ejemplo la insulina , vital para la regulación del metabolismo de los glúcidos en el organismo. La diabetes, una enfermedad que se caracteriza por la disfunción en la producción de insulina, afecta a millones de personas. El tratamiento de esta enfermedad se realizaba utilizando insulina comercializada, procedente del páncreas de terneros o de cerdos, que no es tan efectiva como la humana. Además, el proceso de aislamiento es caro y complejo. Actualmente se produce insulina humana utilizando microorganismos: La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), codificados por partes separadas de un mismo gen (conectados por puentes disulfuro), y que codifica la preproinsulina, un polipéptido más largo que contiene una secuencia señal, los polipéptidos A y B de la molécula de insulina activa, y un polipéptido de unión que está ausente en la insulina madura. La producción de insulina humana en bacterias se realiza siguiendo dos caminos: 1. Producción de proinsulina y conversión en insulina por métodos químicos. 2. Producción de las cadenas A y B, en dos cultivos bacterianos separados, y unión de ambas cadenas por procedimientos químicos. Debido a que la molécula de insulina es bastante pequeña, en cualquiera de los dos casos resulta más conveniente sintetizar químicamente la secuencia adecuada de ADN que intentar aislar el gen de la insulina a partir de tejido humano.
  • Tema 13 el adn y la ingeniería genética

    1. 1. EL ADN Y LA INGENIERÍA GENÉTICA TEMA 13
    2. 2. Tema 13.- El ADN y la ingeniería genética• 11.- Concepto de organismo transgénico.• 12.-Construccción de un ADN recombinante.• 13.- La clonación del ADN. Vectores (plásmidos)• 14.-Ingeniería genética: Agricultura y Medio Ambiente.• Producción de Plantas transgénicas: transformación (Agrobacterium) y regeneración. Resistencia a herbicidas.• Bacterias transgénicas: biorremediación (degradación de vertidos de hidrocarburos del petróleo).• 15.- Ingeniería genética y Medicina.• Obtención de insulina.
    3. 3. INGENIERÍA GENÉTICA• Bajo la denominación de Genética molecular se engloban procesos y fenómenos relacionado con el material genético como son la replicación, transcripción, traducción, el código genético y las mutaciones.• En 1970 Smith y Wilcox descubren las enzimas de restricción, Temin y Baltimore descubren la retrotranscripción, en 1983 K.B Mullis desarrolla la PCR, se desarrollan técnicas de secuenciación de ADN, y otras muchas más.• Todas estas técnicas constituyen la Ingeniería Genética (= Manipulación genética) que permitir manipular el genoma de un ser vivo.
    4. 4. INGENIERÍA GENÉTICA• Esta manipulación consiste en: – Introducir genes (normalmente de otro ser vivo) en un genoma. – Eliminar genes. – Modificar su secuencia de bases – Secuenciar genes – Clonar genes• Realmente habría que denominar a dichas técnicas Tecnología del ADN Recombinante, ya que con ellas se obtienen nuevos ADN que no existían.
    5. 5. INGENIERÍA GENÉTICA• Si aplicamos estos métodos y técnicas a los seres vivos para obtener un producto o servicio, hablamos de BIOTECNOLOGÍA.• La Ingeniería Genética se sitúa entre la Genética Molecular y la Biotecnología.
    6. 6. TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA• TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA o TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE.• Sus ventajas, frente a los procedimientos clásicos son muchas: – Mucho más rápido y preciso. – Se transmiten sólo los genes deseados. – Obtención de productos en mucho mayor cantidad.
    7. 7. TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA• Podemos obtener fragmentos de ADN idénticos en cantidades ilimitadas (clonación), determinar la secuencia de los genes, alterarlos, insertar genes de una especie en otra distinta, bien en sus células somáticas o germinales.
    8. 8. TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA• Algunas de estas técnicas son: • Tomar o aislar fragmentos específicos de ADN de un organismo, para ello se cortan en puntos concretos. Es decir, fragmentar o cortar el ADN. • Unión de fragmentos de ADN. • Clonación del ADN, para tener suficientes copias y estudiarlo mejor, o para que se exprese su proteína en grandes cantidades. Se utilizan VECTORES DE CLONACIÓN. También se puede hacer con la técnica llamada PCR (Reaction Chain Polymerase = Reacción en cadena de la Polimerasa.)
    9. 9. TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA• Algunas de estas técnicas son: 4. Insertar un gen en el ADN de otro ser vivo para que se exprese en él, o incluso en sus células germinales para que se transmita a la descendencia. Es la transformación, y el ADN es recombinante. Así se obtienen ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE ( = O.M.G.) o TRANSGÉNICOS. Para insertarlo en la célula huésped primero se inserta en unos VECTORES DE TRANSMISIÓN = DE EXPRESIÓN. 5. Identificación y secuenciación, y modificación para mejorar el producto, si su producto tiene interés industrial, farmaceútico, agrícola, etc.
    10. 10. TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA• Para manipular el ADN se utilizan herramientas fundamentales: – Las enzimas de restricción o restrictasas (cortan) – Las ligasas (unen) – Los vectores de transmisión (transportan genes y los insertan en ADN distintos, es decir, de otras especies)
    11. 11. 1.- OBTENCIÓN DEFRAGMENTOS DE ADN. CORTE DEL ADN• Se puede hacer utilizando dos tipos de enzimas: – Las enzimas de restricción – La retrotranscriptasa.
    12. 12. Enzimas de retricción Se denominan enzimas de restricción, restrictasas o endonucleasas de restricción. Reconocen puntos concretos del ADN (secuencias palindrómicas o capicúas) y lo cortan ahí. Actúan como tijeras moleculares. Se conocen más de 100 distintas y cada una corta en una secuencia específica a cada hebra de ADN.• El corte puede ser de dos tipos y así se originan: – Extremos romos o lisos. – Extremos cohesivos o pegajosos o escalonado, así puede unirse a otros trozos que sean complementarios.
    13. 13. Enzimas de retricciónEnzima Bacteria Tipo de extremoEco RI Escherichia coli cohesivosEco RII Escherichia coliBam HI Bacillus amyloquefaciens cohesivosHae III Haemophilus aegyptius romosHind III Haemophilus influenzae Rd cohesivosKpn I Klebsiella pneumoniae cohesivosSma I Serratia marcenscens romosBsu RI Bacillus subtitlis
    14. 14. Enzimas de retricción
    15. 15. Enzimas de retricciónAl cortar una molécula de ADN con distintas enzimas derestricción se obtienen una mezcla de fragmentos dedistinto tamaño. Los fragmentos obtenidos se puedenseparar por un método llamado electroforesis,basándose en la capacidad de desplazamiento en uncampo eléctrico según su tamaño y de carga eléctrica.Las pequeñas recorren una distancia mayor y las largasmenor. Los fragmentos se mueven sobre una lámina degel de agarosa. Después se tiñen con un colorante y seobtienen una bandas. Cada banda corresponde a untamaño medido en pares de bases.El tamaño de los fragmentos se suele expresar enKILOBASES (1000 nucleótidos) si son cadenasmonocatenarias, o 1000 pares de bases si se habla debicatenarias. Si el tamaño es inferior a 1000 bases sehabla de bases o pares de bases.
    16. 16. Ligasas• Las enzimas ligasas hacen lo contrario, a las enzimas de restricción, unen los extremos “pegajosos” de hebras de ADN con secuencias complementarias.
    17. 17. Transcriptasa inversa• También se puede obtener el fragmento de ADN, en este caso ADN estructural, es decir, que codifica una proteína o enzima, si se conoce su secuencia de aminoácidos o la de su ARNm (éste se sintetiza “in vitro” o se aísla de la célula por hibridación).• Una vez aislado, la transcriptasa inversa lee este ARNm y sintetiza el ADN que lo codifica, llamado ADNc o complementario, que es un ADN sin intrones.• Este método es muy importante si el gen que se introduce es de eucariontes y se introduce en una bacteria. El gen introducido no tiene intrones.
    18. 18. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS• Por medio de la hibridación de ácidos nucleicos podemos localizar genes en el ADN.• Hibridamos el ARNm sin intrones con el ADN y con fluorescencia o autorradiografía (isótopos) localizamos el gen en el cromosoma.
    19. 19. CLONACIÓN DEL ADN• Para manipular el ADN es necesario disponer de una gran cantidad de moléculas. Esto se consigue con la clonación.• Se puede hacer de dos formas: – Clonación molecular o génica, utilizando células. – Amplificación por PCR, sin utilizar células.
    20. 20. Clonación molecular o génica• La clonación molecular se hace utilizando células hospedadoras, bacterias normalmente. Es decir, se inserta el ADN deseado en su ADN y cuando la bacteria se reproduzca hará múltiples copias de ese ADN.• Para ello, una vez aislado el ADN hay que insertarlo en el ADN bacteriano.• Para ello se utilizan los vectores de clonación o de clonado. Estos vectores son pequeños moléculas de ADN que tienen capacidad de autorreplicación independientemente del ADN de la célula huésped, como plásmidos, bacteriófagos y cósmidos. El gen deseado hay que insertarlo primero en estos vectores.
    21. 21. Vectores de clonación• Son los medios biológicos que se emplean para introducir material genético en una célula.
    22. 22. Clonación molecular o génica• Para insertar el ADN en los vectores, se cortan éstos con la misma enzima de restricción con la que se obtuvo el ADN.• Los extremos del ADN y del vector tienden a unirse.• Una enzima ligasa los unirá.• Así obtenemos un ADN recombinante o quimera.
    23. 23. Clonación molecular o génica• Para clonar genes en células eucariotas se recurre a:• Para células vegetales: – Bacteria Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido que puede insertarse en cromosomas de las células vegetales. Induce tumores en las plantas. – Plásmidos de algunas levaduras.• Para células animales: – Retrovirus modificados – Inyección directa de ADN en ovocitos.
    24. 24. Vectores: plásmidos• Fragmentos de ADN bacteriano con su propio origen de replicación por lo que se replican de manera independiente al ADN bacteriano.• Una bacteria puede tener muchos plásmidos (20 a 50).• Muchos de ellos poseen genes de resistencia a antibióticos (plásmidos R).
    25. 25. Vectores: plásmidos
    26. 26. Vectores: bacteriófagos• Los fagos son virus que infectan bacterias.• Se pueden manipular eliminando parte de su ADN y reemplazándolo por un ADN extraño.• Al infectar una bacteria introducen el ADN insertado y al multiplicarse, también se multiplica la secuencia insertada.• El más empleado es el fago lambda.
    27. 27. Vectores: cósmidos• Tipos de plásmidos que contienen los extremos complementarios del genoma del fago lambda (extremos COS).• Se introducen el la cápsida del fago y pasar al interior de la bacteria.
    28. 28. Clonación molecular o génica• Estos vectores llevan además unos genes llamados marcadores que sirven para detectar o identificar las células que han incorporado los vectores. Estos marcadores son genes de resistencia a antibióticos (si se inserta en una bacteria) o genes de bioluminiscencia (si se inserta en una eucariota). Los plásmidos naturales no tienen estos marcadores, sino que se añaden artificialmente.
    29. 29. Clonación molecular o génica• ¿Cómo se inserta el vector en el ADN de la célula huésped? Se corta el ADN del vector y el que contiene el gen deseado con la misma restrictasa y luego se unen con la ligasa. Así tenemos un ADN recombinante, ya que procede de dos moléculas distintas.• La introducción de un ADN extraño en bacterias, ya sea de forma natural o por vectores, se llama transformación. Si el vector es un virus, la transformación se llama transducción.• Si se hace en eucarionte se llama transfección, y si se inserta en las células germinales de estos se llama transgénesis y los descendientes de estos organismos, transgénicos o modificados genéticamente (OMG). Por ejemplo, uno de los vectores más utilizados en plantas es la bacteria Agrobacterium tumafaciens, y en células animales, el virus SV40.
    30. 30. Manipulando los genes uno a unoBiotecnología Aquí tenemos un gen que interesa insertar en un plásmido Una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta recombinante procedencia
    31. 31. Clonación molecular o génica• Una vez que las bacterias se han transformado, se las pasa a un medio de cultivo para que se multipliquen. Al mismo tiempo se replican los vectores de clonado y así se obtienen múltiples copias del gen deseado.• Cada grupo de bacterias que procedan de una sola, llevarán ese vector y ese gen, constituye un clon. Así se obtienen tantos clones como fragmentos de ADN se hayan insertado en las bacterias.• El conjunto de clones obtenido se llama biblioteca genómica o genotecas.
    32. 32. SELECCIÓN DE CLONES o TRANSFORMANTES• De todos los clones obtenidos sólo uno portará el gen deseado. ¿Cómo se localiza o se extrae de la biblioteca genómica?. Es decir, hay que localizar un fragmento de ADN, que está dentro de una célula. El método depende del vector utilizado: – Transfiriendo los clones a cultivos con antibióticos. El que sobreviva es el que porta el marcador de resistencia. – Otro método muy usado es la hibridación de ácidos nucleicos, utilizando una sonda.
    33. 33. Manipulando los genes uno a unoBiotecnología El ADN recombinante se introduce en una bacteria que es usada como “factoría”, como fábrica de una proteína humana y no de una proteína bacteriana. El ADN recombinante se copia porque las bacterias se dividen. Procedimiento de inserción de un gen en un plásmido y amplificación del ADN clonado. Tanto el plásmido como la secuencia blanco del ADN a clonar se cortan con la misma enzima, en este caso Eco R1 que produce extremos pegajosos. Al mezclar en un tubo de ensayo el ADN plasmídico y la secuencia de ADN foráneo se hibridizan y tras la acción de una ligasa agregada al medio forman un plásmido híbrido que contiene el gen de interés. Luego se procede a transferir el ADN recombinante a una bacteria (proceso fácil de realizar). Se procede luego a transferir las bacterias a un medio de cultivo donde se multiplican. A partir de este crecimiento se siembran en un medio sólido conteniendo el antibiótico al que es resistente la bacteria que porta el plásmido, es decir, sólo van a crecer las bacterias que contienen el ADN recombinante. Luego a partir de las colonias se hace un cultivo en medio líquido para amplificar y de ese cultivo se purifica el ADN con el inserto.
    34. 34. SELECCIÓN DE CLONES o TRANSFORMANTES• La sonda es un fragmento de ADN o ARN de cadena sencilla complementaria a la secuencia del fragmento que queremos localizar. Esta sonda puede ser: – El ARNm correspondiente a la proteína que codifica el en buscado, y que se ha sintetizado in vitro. – Un ADN llamado complementario (ADNc), obtenido a partir del ARNm por la transcriptasa inversa.• La sonda lleva una molécula (reporter) que puede un isótopo radioactivo o una sustancia fluorescente. Sirve para “verla” por medio de autorradiografía (si lleva isótopos) o con microcosopio de florescencia si lleva sustancia fluorescente. La sonda se añade al conjunto de clones y se espera que hibride.• Si se quiere clonar el gen de la insulina humana y luego secuenciarlo, la sonda se prepara a partir de células del páncreas. Se aísla de ellas el ARNm de la insulina, luego con la transcriptasa inversa (y con nucleótidos marcados con isótopos radiactivos) se obtiene el ADNc, que contiene únicamente secuencias codificantes, sin intrones porque procede del ARNm maduro.
    35. 35. CLONACIÓN DE ADN. AMPLIFICACIÓN DEL ADN. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.• Para manipular el DNA se necesita grandes cantidades. En la actualidad se clona ADN sin necesidad de utilizar células, por tanto in vitro, con un método desarrollado en 1983 por K.B. Mullis, denominado Reacción en Cadena de la Polimerasa, (Polymerase Chain Reaction o PCR).
    36. 36. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.• Es una técnica mucho más rápida y productiva: a partir de una sola cadena de DNA en una tarde se pueden obtener hasta 100.000 millones de moléculas idénticas.• El mecanismo es el mismo que utilizan las células cuando replican el DNA. Es decir, reproduce in vitro lo que ocurre dentro de la célula. Se utiliza la DNA polimerasa, que a partir de una cadena molde fabricará dos cadenas hijas idénticas.
    37. 37. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.• Para esto hay que suministrar: – La cadena molde, que es una de las cadenas de la doble hélice – Desoxirribonucleótidos – Cebador
    38. 38. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.• El mecanismo es simple: consiste en repetir ciclos de síntesis. Cada ciclo consta de: – Desnaturalización de la doble cadena a copiar, con temperaturas altas. Cada hebra sencilla servirá de molde. – Lectura de la hebra molde – Incorporación de nucleótidos – Mantener temperatura muy elevada durante todo el proceso
    39. 39. • La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras.• Cada una de las hebras es copiada por la ADN polimerasa. (Se utiliza la ADN polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas).• Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de copias deseado.
    40. 40. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.• De esta manera, en el primer ciclo se obtienen dos cadenas, en el segundo, cuatro, en el tercero 8, etc. El número de moléculas obtenidas se obtiene por esta fórmula N = 2 n donde n es el número de ciclos realizados. Cada ciclo equivale a una replicación. Así al cabo de 20 ciclos se obtienen 1048576 moléculas de ADN.• Cada ciclo dura unos 5 minutos, ya para que se obtenga una amplificación útil se necesita 20 ciclos. Hoy día se hace de manera automatizada.
    41. 41. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR 1. Desnaturalización de las cadenas a 94º C. Durante el proceso de desnaturalización la cadena doble se abre y se forman dos hebras de cadena simple, además todas las reacciones enzimáticas que tienen lugar en ese momento paran, como por ejemplo la elongación de un ciclo previo.
    42. 42. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR 1. Anillado a 54º C. Los primers se encuentran flotando en la solución, de un lado a otro, o hacia arriba o hacia abajo debido al movimiento browniano. Las uniones iónicas entre el cebador y la cadena simple molde se forman y rompen en forma constante hasta que al encontrarse las zonas complementarias esta unión se hace más estable y se mantiene lo suficiente para que una polimerasa se enganche al cebador y comience a copiar la cadena molde.
    43. 43. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR 1. Extensión a 72º C. Esta polimerasa especial aislada de bacterias que viven en aguas termales calientes, tiene como temperatura de trabajo la de 72º C. Los cebadores que están unidos débilmente a esta temperatura se separan, en cambio, los complementarios al gen tienen uniones suficientemente fuertes de modo que la polimerasa sigue copiando la cadena. Los nucleótidos se agregan desde 5’ a 3’.
    44. 44. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR Debido a que ambas cadenas se copian durante la reacción de PCR se produce un aumento exponencial del número de copias del gen. Así, si suponemos que hay una sola copia del gen antes de que se inicien los ciclos, después de un ciclo habrá dos copias, después de dos habrá cuatro, luego ocho y así sucesivamente. A lo largo de los ciclos los primers que se usan son siempre los mismos.
    45. 45. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.• La DNA polimerasa utilizada al principio era la de Escherichia coli. Pero al elevar la temperatura para la desnaturalización del DNA la enzima se desnaturalizaba y había que reponerla en cada ciclo. Esto encarecía y ralentizaba el proceso. Esto se solucionó al descubrirse las bacterias termófilas (extremófilas) que vivían en aguas termales, cuyas proteínas soportan temperaturas elevadas. Se utilizó la polimerasa de Thermus aquaticus, que soportaba hasta 95 ºC. Esta polimerasa se denominó Taq polimerasa.
    46. 46. APLICACIONES DE LA PCR• Clonación de genes. La PCR resulta útil en la clonación de genes, ya que permite obtener un gran número de copias del gen sin la intervención de células.• Estudios evolutivos. Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos a partir de cantidades muy pequeñas de ADN presentes en algunos fósiles, para comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y reconstruir el árbol filogenético.
    47. 47. APLICACIONES DE LA PCR• Huellas dactilares del ADN. La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones más interesantes de la PCR.• Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas.• Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de paternidad.
    48. 48. APLICACIONES DE LA PCR• Huellas dactilares del ADN.
    49. 49. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR  Algunas de las aplicaciones de la PCR son:  Secuenciación. Una de las razones más comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho más sencillo y rápido que la clonación en células. Técnicas de secuenciación El test genético
    50. 50. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR  Algunas de las aplicaciones de la PCR son:  Estudios evolutivos. Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos (mamut), o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos.
    51. 51. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR  Algunas de las aplicaciones de la PCR son:  El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano.
    52. 52. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR  Algunas de las aplicaciones de la PCR son:  Huellas dactilares del ADN. La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones más interesantes de la PCR. Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas.
    53. 53. Manipulando los genes uno a unoLa reacción en cadena de la polimerasa, PCR  Algunas de las aplicaciones de la PCR son:  Huellas dactilares del ADN. Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biológicas (sangre, semen, piel o cabellos). También se utiliza en pruebas de paternidad.
    54. 54. APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA• Medicina.• En agricultura• En ganadería.• En medio ambiente. Biorremediación.• Producción de transgénicos.• Medicina.• Clonación animal.• Clonación terapeutica: celulas madre.
    55. 55. Producción de proteínas terapéuticas• Se ha conseguido insertar en bacterias los genes que codifican proteínas humanas cuya carencia produce enfermedad.• Así se han obtenido:• INSULINA.• HORMONA DEL CRECIMIENTO.• INTERFERÓN.• FACTORES DE COAGULACIÓN.
    56. 56. Manipulando los genes uno a unoBiotecnología: fabricación de proteínas Además de la insulina, la industria farmacéutica ha comercializado estas proteínas recombinantes: ADN Vacunas basadas Interferón humano Hormona de en proteínas polimerasa I recombinantes crecimiento Esclerosis Enanismo Fibrosis múltiple Hepatitis B hipofisiario quística
    57. 57. Producción de INSULINA• Es una proteína formada por dos cadenas.• Cada cadena se obtiene en una cepa de bacterias diferente y luego se une.
    58. 58. Producción de INSULINA
    59. 59. Producción de INSULINA• La insulina fue la primera proteína obtenida por ingeniería genética.• Está formada por dos polipéptidos, el A y el B, y para su producción es necesario, primero, sintetizar químicamente las dos cadenas de ADN que la expresan: la cadena A y la cadena B.• Esto ha sido posible porque la secuencia de aminoácidos de la insulina es conocida desde hace tiempo.
    60. 60. Producción de INSULINA• Los genes sintéticos se insertan por separado, y junto al gen que expresa una proteína -la β-galactosidasa- en plásmidos de E. coli, se obtienen plásmidos recombinantes.• Estos se introducen en cepas distintas de E. coli, donde se expresan, y se obtiene una proteína de fusión -la β- Gal-insulina-, que es más estable en E. coli que la insulina sola. Estas proteínas de fusión se procesan químicamente para separar de ellas los polipéptidos A y B, que luego, mediante renaturalización y oxidación de las cisteínas, se unen para obtener la insulina activa.
    61. 61. Producción de INSULINA
    62. 62. Producción de insulina humanaLa forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que estáncodificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obteneren cultivos bacterianos separados. Proteína de fusión con subunidad A Promotor del gen de la insulinaSubunidad A delgen de la insulina Transformación Extracción de Separación de en E. coli las proteínas de los polipéptidos fusión AyB Promotor Formación Proteína de fusión de insulina con subunidad B delSubunidad B del activa gen de la insulinagen de la insulina
    63. 63. Producción de hormona del crecimiento• Utilizada para tratar algunos casos de enanismo.
    64. 64. Producción de interferón• Proteína producida en el sistema inmunitario, útil para luchar contra infecciones víricas y algunos tipos de cáncer.
    65. 65. Producción de factores de coagulación• El 80% de hemofílicos carece del factor VIII de coagulación.• Esta proteína se obtiene por ingeniería genética en grandes cantidades sin necesidad de donantes y evitando posibles infecciones.
    66. 66. Producción de vacunas• Se insertan genes del patógeno en alguna célula y se recogen las proteínas sintetizadas.• Dichas proteínas actúan como antígenos al ser inoculadas en un paciente.• Se evita así la inoculación de agentes patógenos debilitados o muertos, siendo las vacunas más seguras y con menos efectos adversos.
    67. 67. Terapia génica.• La terapia génica consiste en manipular genéticamente las células del individuo con el fin de corregir algún defecto (enfermedad) genético o permitir que aparezca alguna característica que permita combatir alguna enfermedad• La terapia génica puede aplicarse siguiendo dos estrategias:• Insertar una copia sana de un gen en las células del paciente, para así compensar el efecto del gen defectuoso.• Introducir un gen especialmente diseñado para que suministre una nueva propiedad a las células. Por ejemplo introducir en linfocitos un gen que produzca un inhibidor de la replicación del virus del SIDA.
    68. 68. Terapia génica.• Hasta ahora la terapia génica sólo se realiza sobre células somáticas, por los problemas éticos que se plantean al hacerlo en células germinales, puesto que las modificaciones se transmitirían a la descendencia.
    69. 69. Terapia génica.• En células somáticas se pueden utilizar tres técnicas de terapia génica:• Terapia ex vivo (fuera del cuerpo): Se extraen células con genes defectuosos y se le introducen mediante vectores adecuados, copias normales de dichos genes (se suelen utilizar células madre de la médula ósea) posteriormente estas células se devuelven al cuerpo. Se ha utilizado en el síndrome de la inmunodeficiencia combinada severa en los llamados “niños burbuja”.• Terapia in situ: Se introducen los genes directamente en el propio órgano defectuoso como por ejemplo en el caso de la fibrosis quística. A veces no produce los efectos deseados.• Terapia in vivo (en el cuerpo): Se hacen llegar los genes a las células defectuosas, a través del torrente circulatorio mediante vectores adecuados que llevan en su superficie moléculas que son reconocidas únicamente por las células diana debido a la presencia de receptores específicos.
    70. 70. Manipulando los genes uno a unoTerapia génicaTÉCNICA EX VIVO: Se extraen células del paciente, se cultivan con el ADN recombinante deseado yluego las células modificadas se vuelven a introducir en el paciente.
    71. 71. Manipulando los genes uno a unoTerapia génicaTÉCNICA IN VIVO: Se introduce en el paciente el ADN recombinante de las dos formas: mediante unliposoma o mediante un virus que llevan en los dos casos el gen correcto.
    72. 72. Manipulando los genes uno a unoTerapia génica ENFERMEDADES HEREDITARIAS QUE PUEDEN SER CONSIDERADAS COMO PRIMERAS CANDIDATAS A SER TRATADAS POR MEDIO DE LA TERAPIA GÉNICA Producto normal del gen Células a modificar por la terapia Enfermedad Incidencia defectuoso génica Inmunodeficiencia Enzima adenosin desaminasa combinada severa (SCID) Rara Células de la médula ósea o linfocitos T (ADA) (“niños burbuja”) Hemoglobinopatías 1 cada 600 personas en β - globina de la hemoglobina Células de la médula ósea (talasemias) ciertos grupos étnicos Hemofilia A 1/10.000 varones Factor VIII de coagulación Células del hígado o fibroblastos Hemofilia B 1/30.000 varones Factor IX de coagulación Células del hígado o fibroblastos Receptor del hígado para Hipercolesterolemia 1/500 personas lipoproteínas de baja densidad Células del hígado familiar (LDL) α-1-antitripsina (producto hepático que protege los Enfisema hereditario 1/3.500 personas Células del pulmón o del hígado pulmones de la degradación enzimática) Producto del gen CFTR que Fibrosis quística 1/2.500 personas mantiene libre de mucus los Células del pulmón tubos aéreos de los pulmones Distrofia muscular de Distrofina (componente 1/10.000 varones Células musculares Duchenne estructural del músculo)
    73. 73. APLICADA A LA AGRICULTURA• Mediante la ingeniería genética se han modificado las características de gran cantidad de plantas haciéndolas más útiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas.• La manipulación genética en los vegetales se realiza introduciendo ADN procedente de otros organismos por diversos métodos: directamente mediante microinyección, liposomas, etc o indirectamente utilizando la bacteria Agrobacterium tumefaciens que es capaz de transferir de forma natural algunos genes en sus plásmidos a ciertas plantas.
    74. 74. APLICADA A LA AGRICULTURA• La biotecnología en la agricultura tiene los siguientes objetivos:• Conseguir plantas resistentes a herbicidas, a insectos y a diversas enfermedades.• Conseguir plantas que presenten mejoras en procesos básicos como son un mayor rendimiento fotosintético, mejor asimilación del nitrógeno atmosférico, etc.• Conseguir plantas que proporcionen productos agrícolas de mayor calidad, más duraderos, etc• Obtención de plantas capaces de sintetizar productos de interés comercial. Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferones e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables, etc..
    75. 75. APLICADA A LA AGRICULTURA• Algunos cultivos transgénicos: – Maiz Bt. Resistente a plagas. Gen que produce un insecticida. – Soja resistente a herbicidas. – Tomate de maduración tardía.• En desarrollo: – Arroz dorado. Que produzca vit A. – Cultivos con genes nif. Eficientes utilizando N2 atmosférico.
    76. 76. APLICADA A LA GANADERÍA.• En los animales, mediante técnicas de ingeniería genética se puede modificar el genoma, es decir obtener animales transgénicos, con distintas finalidades: evitar ciertas patologías, aumentar la producción de carne y leche, obtener productos de interés, etc. Igualmente se pueden obtener organismos clónicos.
    77. 77. APLICADA A LA GANADERÍA.• Transgénesis en animales.• El ADN extraño que se incorpora se llama transgén. La transgénesis puede realizarse de dos formas distintas:• Transgénesis por microinyección de zigotos. En primer lugar se aíslan un número grande de óvulos fertilizados. A continuación los zigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una micropipeta a modo de aguja, se introduce el ADN extraño (transgen). Por último, estos zigotos son reimplantados en hembras que actuarán como nodrizas permitiendo la gestación.• Transgénesis por manipulación de células embrionarias. Se obtienen células embrionarias totipotentes o células embrionarias madre, del interior de la blástula, mediante diversas técnicas se introduce el ADN extraño en su interior y posteriormente se reintroducen estas células manipuladas en la blástula y ésta se reimplantada en una hembra.
    78. 78. APLICADA A LA GANADERÍA.• Clonación de animales.• Obtención de organismos idénticos genéticamente, y por tanto morfológica y fisiológicamente, como lo son dos gemelos univitelinos. En 1997 se produjo la primera clonación de un mamífero, la oveja Dolly.• La clonación de animales se puede conseguir por dos métodos:• Por disgregación de células embrionarias. Se separan las células de un embrión en las primeras fases del desarrollo, hasta el estado de mórula. Cada célula separada puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse dando un individuo completo.• Por transferencia nuclear. Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por disgregación y se cultivan in vitro. Posteriormente se fusionan con ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo (enucleado). Las células resultantes empiezan a funcionar como un zigoto, originando un nuevo individuo.
    79. 79. Manipulando los genes uno a unoCélulas madre y clonación Clonación de la oveja Dolly Madre de Dolly: oveja I Célula normal de la oveja Se implanta en una nueva oveja (III) Óvulo con núcleo de la madre (oveja I) Donante: oveja II Se elimina el núcleo Óvulo de de la oveja II donante Clon (Dolly) Nace de la oveja III pero es idéntica a la oveja I, que es la que ha donado el núcleo delLa oveja Dolly, primer mamífero clónico, falleció en 1.983. Victima óvulode una enfermedad degenerativa, tuvo que ser sacrificada cuandotenía 6 años (una oveja suele vivir entre 10 y 11 años). Comenzó amostrar una enfermedad en la que sus células envejecían másrápido de lo normal, aunque empezó a desarrollar artritis a unaedad muy temprana. La clonación (animal, humana, terapéutica) El método de clonación (clonación, investigación, utilidad) Nueva técnica de clonación Selección genética de embriones
    80. 80. APLICADA AL MEDIO AMBIENTE• Los microorganismos también son útiles en la lucha frente a la contaminación. A cualquier proceso que sirva para remediar un problema ambiental y utilice para ello organismos vivos se le denomina biorremediación.• Biodegradación del petróleo.• La descomposición microbiana del petróleo y sus derivados tiene gran importancia ambiental utilizándose en las mareas negras y en el lavado de los tanques de almacenamiento. Los principales microorganismos capaces de descomponer el petróleo y sus derivados son bacterias (Pseudomonas) y hongos oxidadores de hidrocarburos.•
    81. 81. APLICADA AL MEDIO AMBIENTE• Depuración de aguas residuales.• La depuración de las aguas de uso domestico e industrial es una de las aplicaciones más conocidas de la biotecnología. En este proceso se combinan tratamientos físico-químicos y microbiológicos• Las aguas residuales contienen materia orgánica e inorgánica (pesticidas, restos de alimentos, plásticos, etc). Los microorganismos se emplean para eliminar las sustancias orgánicas que contaminan el agua. Éstos oxidan, mediante procesos de digestión y fermentación, la materia orgánica transformándola en moléculas más simples (CO2, CH4). Estos procesos pueden realizarse en tanques cerrados (anaeróbicamente) o en depósitos abiertos que facilitan la aireación del agua.• Una vez que el agua está libre de materia orgánica se somete a tratamientos físico-químicos que permiten la eliminación de sustancias inorgánicas especialmente fosfatos y nitratos.

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