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T16 – EL ADN Y LA INGENIERÍA GENÉTICA.

 1.     De la biotecnología a la ingeniería genética.
 2.     Obtención de fragmentos de ADN.
 3.     Clonación del ADN.
 4.     Identificación de clones mediante sondas.
 5.     Reacción en cadena de la polimerasa.
 6.     Secuenciación del ADN.
 7.     Genómica y proteómica.
 8.     Ingeniería genética y medicina.
 9.     Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.
 10.    Ingeniería genética y ganadería.
 11.    Proyecto Genoma Humano.
 12.    Bioética.

ANTECEDENTES PAU:

2004 – Junio:      clonación, definición y ejemplos;
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
               Biotecnología

                       Utilización de los seres vivos para obtener
                             productos útiles al ser humano.


•    Producción de alimentos y bebidas.
•    Obtención de medicamentos.
             Ingeniería genética

                 Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular,
                   que permiten manipular el genoma de un ser vivo.

•    Clonación, mapas genéticos.
•    Organismos transgénicos, terapia génica.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 2 – Obtención de fragmentos de ADN.
  Tecnología del ADN recombinante

1. Fragmentar y aislar el ADN.
2. Unión a vectores.
3. Introducción en las células.
4. Clonación.
5. Búsqueda del clon idóneo.
6. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern.
7. Secuenciación.
8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 2 – Obtención de fragmentos de ADN.
        Enzimas de restricción
1. Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma)
   corta y conocida.

3. Las secuencias de corte son palindrómicas.

5. El corte puede ser:
         • Liso.
         • Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)

Posteriormente, los fragmentos de distintos
ADN cortados con la misma enzima se podrán
unir mediante otra enzima, una ADN ligasa.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



2 – Obtención de fragmentos de ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    2 – Obtención de fragmentos de ADN.
     Formación de ADN complementario por hibridación


•    Tenemos dos tipos distintos de ADN.
•    Se     separan    las    cadenas     de   ADN
     (desnaturalización).
•    Se devuelven las condiciones adecuadas y se
     produce la renaturalización.
•    Se pueden obtener moléculas híbridas de los
     dos tipos de ADN.
•    El porcentaje de hibridación está relacionado
     con el parentesco evolutivo.
•    Estas técnicas permiten localizar enfermedades
     genéticas.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 2 – Obtención de fragmentos de ADN.
       Síntesis de ADNc usando ARNm como molde

Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo de un
   ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en bacterias (los
   procariotas no realizan un proceso postranscripcional de eliminación de intrones).
2. Una célula eucariota transcribe el ADN a ARNm.
3. La misma célula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los intrones, y
   añadiendo una cola poli-A y un terminal GTP.
4. Esta cadena de ARNm maduro se extrae de la célula.
5. Se hibrida un oligonucleótido poli-T sobre la cola poli-A del molde de ARNm
   maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de doble cadena para
   comenzar a trabajar.
6. Se añade la retrotranscriptasa, junto con las bases A, T, C y G.
7. La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando la cadena
   de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc).
8. Se sintetiza la doble cadena.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



2 – Obtención de fragmentos de ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



2 – Obtención de fragmentos de ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    3 – Clonación del ADN.
             Clonación de ADN
•    En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias
     de un gen específico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo
     hospedador.

•    Estos organismos deben cumplir las siguientes características:

5.   Crecimiento rápido.
6.   No debe ser patógeno.
7.   Debe favorecer la entrada del transgén.
8.   Debe ser muy bien conocido.
9.   Debe ser fácilmente manipulable.



                                                                               Escherichia coli
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    3 – Clonación del ADN.
          Vectores de clonación

•    Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que
     llevan insertados.
•    Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.
•    Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del
     fragmento de ADN a clonar.



Para insertar un fragmento de ADN
al vector, se utiliza una enzima de
restricción, y se mezcla con fragmentos
de ADN producidos con la misma enzima.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    3 – Clonación del ADN.
       Tipos de vectores de clonación




•    Plásmidos.
•    Virus bacteriófagos.
•    Cósmidos.
•    YAC´s (cromosomas artificiales de levadura).
•    BAC´s (cromosomas artificiales de bacterias).
•    Cromosomas artificiales humanos.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 3 – Clonación del ADN.
            Plásmidos

• Son     moléculas      de      ADN
  bicatenario circular.
• Se localizan en las bacterias.
• Tienen                 replicación
  independiente.
• Genes propios (resistencias a
  antibióticos)    que     permiten
  seleccionarlos posteriormente.
• Facilidad para la manipulación.
• Puntos de corte específicos para
  enzimas de restricción.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



3 – Clonación del ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 3 – Clonación del ADN.
              Bacteriófagos
• Virus que infectan bacterias.
• Incorporan material genético mediante el proceso de
transducción.
• Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material
del antiguo huésped.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    3 – Clonación del ADN.
                Cósmidos
•    Consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma
     de un bacteriófago.
•    Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS (fragmento
     de fagos necesario para empaquetar el material genético).
•    Lleva varios genes de plásmidos.
•    Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos).
•    Tiene varios sitios de restricción.
•    Permite transportar grandes cantidades de ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



3 – Clonación del ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    3 – Clonación del ADN.
      Cromosoma artificial de levadura




•    Son vectores     de   clonación     de   alta
     capacidad.

•    Esto permite clonar en levaduras
     (microorganismos eucariotas) secuencias
     de ADN de hasta un millón de pares de
     bases o más, al comportarse como un
     cromosoma propio de la levadura.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



3 – Clonación del ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 3 – Clonación del ADN.
   Clonación de los fragmentos de ADN

1. Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo
   que sea). Generalmente de resistencia a antibióticos.
2. Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plásmido.
3. Se mezclan los fragmentos.
4. Obtención de plásmidos recombinantes.
5. Se juntan los plásmidos con bacterias.
6. Incorporación de los plásmidos por transformación
   bacteriana.
7. Cultivo de bacterias en presencia de un antibiótico.
8. Las bacterias que no han incorporado el plásmido mueren (no
   son resistentes).
T16. El ADN y la ingeniería genética.



3 – Clonación del ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 4 – Identificación de clones mediantes sondas.
   Almacenamiento de genes clonados

• Una genoteca es una colección de clones cada uno de los
  cuales contiene un vector al que se le ha insertado un
  fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la
  célula o tejido.
• La colección de clones debería contener, teóricamente, todas
  las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es
  decir, debería contener muestras de todo el ADN del
  organismo.
• Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de
  ácidos nucleicos.
• Estas genotecas pueden ser de plásmidos, fagos o de ADNc.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 4 – Identificación de clones mediantes sondas.
          Identificación de clones




Sondas de ADN
• Oligonucleótidos de cadena sencilla.
• Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la secuencia de
   aminoácidos de la proteína.
• Están marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser identificadas.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



4 – Identificación de clones mediantes sondas.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    5 – Reacción en cadena de la polimerasa.

•    Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento
     de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones
     de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y además en muy poco
     tiempo.
La reacción es un proceso cíclico:

3.La molécula de ADN que va a copiarse se
calienta para que se desnaturalice y se separe las
dos hebras.
4.Cada una de las hebras es copiada por la ADN-
polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una
bacteria que vive en aguas termales,
Thermusaquaticus, así la enzima puede trabajar a
altas temperaturas).
5.Las cadenas recién formadas son separadas de
nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de
copias.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



5 – Reacción en cadena de la polimerasa.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    5 – Reacción en cadena de la polimerasa.
            Aplicaciones de la PCR

•    Amplificación de:
      – ADN antiguos (mamuts, momias, fósiles…
      – ADN obtenidos de la escena de un crimen (medicina forense).
      – ADN de células embrionarias (diagnostico prenatal de trastornos
        genéticos).
      – ADN de genes virales (en células infectadas por virus difíciles de
        detectar, como el VIH).



      Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
T16. El ADN y la ingeniería genética.



    6 – Secuenciación del ADN.

•    Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la
     replicación enzimática (de la polimerización de DNA).
•    Elementos necesarios:
-    DNA polimerasa.
-    Oligonucleótido (primer o cebador), de 18-30 nucleótidos y complementario al
     extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar.
-    Mezcla de los 4 desoxinucleósidostrifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP).
-    Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidostrifosfato (ddATP*
     o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia específica para cada uno
     de ellos).
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 6 – Secuenciación del ADN.
         Pasos de la secuenciación
1. Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN
   (clonación).
2. Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples).
3. Mezcla de todos los componentes de la reacción.
4. Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un
   ddNTP marcado.
5. Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP*.
6. Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida.
7. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color.
8. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



6 – Secuenciación del ADN.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



7 – Genómica y proteómica.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



7 – Genómica y proteómica.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



7 – Genómica y proteómica.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



7 – Genómica y proteómica.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



8 – Ingeniería genética y medicina.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



8 – Ingeniería genética y medicina.
 Obtención de productos farmacéuticos

1.Secuencia de la proteína (insulina).
2.Síntesis de los ADN.
3.Obtención de plásmidos recombinantes con
  los genes para formar las dos cadenas de la
  insulina.
4.Expresión en E. coli.
5.Purificación y procesado químico.
6.Obtención de insulina activa.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 8 – Ingeniería genética y medicina.
             Medicina forense



2. Los seres humanos difieren en un 0,1% del genoma.
3. Estas diferencias están localizadas en regiones
   cromosómicas concretas.
4. Estas zonas se usan como marcadores genéticos.
5. Con la identificación de los marcadores se hace la
   huella genética (método de Southernblot).
6. La comparación de huellas genéticas permite
   resolver casos policiales.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



8 – Ingeniería genética y medicina.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



8 – Ingeniería genética y medicina.
             Terapia génica
T16. El ADN y la ingeniería genética.



9 – Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



9 – Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



9 – Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



10 – Ingeniería genética y ganadería.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



10 – Ingeniería genética y ganadería.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



11 – Proyecto Genoma Humano.


• Objetivos:
  – Situar genes y marcadores moleculares en mapas
    genéticos de cada cromosoma.
  – Caracterizar y localizar físicamente fragmentos de
    ADN clonados.
  – Secuenciar los pequeños fragmentos para
    obtener la secuencia genómica completa.
T16. El ADN y la ingeniería genética.



 12 – Bioética.

• Las ventajas de la ingeniería genética y de las nuevas
  tecnologías asociadas son muchas, pero los potenciales
  riesgos también lo son:

    – Ecológicos. Posibles efectos secundarios como la contaminación del
      agua o del suelo.
    – Sanitarios. Casos de alergias provocadas por alimentos transgénicos.
    – Sociales, éticos y legales.


• Surge la bioética, aplicación de la ética a las ciencias de la
  vida.

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T16 - El adn y la ingeniería genética.

  • 1. T16 – EL ADN Y LA INGENIERÍA GENÉTICA. 1. De la biotecnología a la ingeniería genética. 2. Obtención de fragmentos de ADN. 3. Clonación del ADN. 4. Identificación de clones mediante sondas. 5. Reacción en cadena de la polimerasa. 6. Secuenciación del ADN. 7. Genómica y proteómica. 8. Ingeniería genética y medicina. 9. Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente. 10. Ingeniería genética y ganadería. 11. Proyecto Genoma Humano. 12. Bioética. ANTECEDENTES PAU: 2004 – Junio: clonación, definición y ejemplos;
  • 2. T16. El ADN y la ingeniería genética. 1 – De la biotecnología a la ingeniería genética. Biotecnología Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano. • Producción de alimentos y bebidas. • Obtención de medicamentos. Ingeniería genética Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo. • Clonación, mapas genéticos. • Organismos transgénicos, terapia génica.
  • 3. T16. El ADN y la ingeniería genética. 1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
  • 4. T16. El ADN y la ingeniería genética. 1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
  • 5. T16. El ADN y la ingeniería genética. 1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
  • 6. T16. El ADN y la ingeniería genética. 1 – De la biotecnología a la ingeniería genética.
  • 7. T16. El ADN y la ingeniería genética. 2 – Obtención de fragmentos de ADN. Tecnología del ADN recombinante 1. Fragmentar y aislar el ADN. 2. Unión a vectores. 3. Introducción en las células. 4. Clonación. 5. Búsqueda del clon idóneo. 6. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern. 7. Secuenciación. 8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
  • 8. T16. El ADN y la ingeniería genética. 2 – Obtención de fragmentos de ADN. Enzimas de restricción 1. Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma) corta y conocida. 3. Las secuencias de corte son palindrómicas. 5. El corte puede ser: • Liso. • Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos) Posteriormente, los fragmentos de distintos ADN cortados con la misma enzima se podrán unir mediante otra enzima, una ADN ligasa.
  • 9. T16. El ADN y la ingeniería genética. 2 – Obtención de fragmentos de ADN.
  • 10. T16. El ADN y la ingeniería genética. 2 – Obtención de fragmentos de ADN. Formación de ADN complementario por hibridación • Tenemos dos tipos distintos de ADN. • Se separan las cadenas de ADN (desnaturalización). • Se devuelven las condiciones adecuadas y se produce la renaturalización. • Se pueden obtener moléculas híbridas de los dos tipos de ADN. • El porcentaje de hibridación está relacionado con el parentesco evolutivo. • Estas técnicas permiten localizar enfermedades genéticas.
  • 11. T16. El ADN y la ingeniería genética. 2 – Obtención de fragmentos de ADN. Síntesis de ADNc usando ARNm como molde Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo de un ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en bacterias (los procariotas no realizan un proceso postranscripcional de eliminación de intrones). 2. Una célula eucariota transcribe el ADN a ARNm. 3. La misma célula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los intrones, y añadiendo una cola poli-A y un terminal GTP. 4. Esta cadena de ARNm maduro se extrae de la célula. 5. Se hibrida un oligonucleótido poli-T sobre la cola poli-A del molde de ARNm maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de doble cadena para comenzar a trabajar. 6. Se añade la retrotranscriptasa, junto con las bases A, T, C y G. 7. La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando la cadena de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc). 8. Se sintetiza la doble cadena.
  • 12. T16. El ADN y la ingeniería genética. 2 – Obtención de fragmentos de ADN.
  • 13. T16. El ADN y la ingeniería genética. 2 – Obtención de fragmentos de ADN.
  • 14. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN. Clonación de ADN • En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo hospedador. • Estos organismos deben cumplir las siguientes características: 5. Crecimiento rápido. 6. No debe ser patógeno. 7. Debe favorecer la entrada del transgén. 8. Debe ser muy bien conocido. 9. Debe ser fácilmente manipulable. Escherichia coli
  • 15. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN. Vectores de clonación • Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados. • Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. • Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar. Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.
  • 16. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN. Tipos de vectores de clonación • Plásmidos. • Virus bacteriófagos. • Cósmidos. • YAC´s (cromosomas artificiales de levadura). • BAC´s (cromosomas artificiales de bacterias). • Cromosomas artificiales humanos.
  • 17. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN. Plásmidos • Son moléculas de ADN bicatenario circular. • Se localizan en las bacterias. • Tienen replicación independiente. • Genes propios (resistencias a antibióticos) que permiten seleccionarlos posteriormente. • Facilidad para la manipulación. • Puntos de corte específicos para enzimas de restricción.
  • 18. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN.
  • 19. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN. Bacteriófagos • Virus que infectan bacterias. • Incorporan material genético mediante el proceso de transducción. • Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material del antiguo huésped.
  • 20. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN. Cósmidos • Consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago. • Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS (fragmento de fagos necesario para empaquetar el material genético). • Lleva varios genes de plásmidos. • Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos). • Tiene varios sitios de restricción. • Permite transportar grandes cantidades de ADN.
  • 21. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN.
  • 22. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN. Cromosoma artificial de levadura • Son vectores de clonación de alta capacidad. • Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.
  • 23. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN.
  • 24. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN. Clonación de los fragmentos de ADN 1. Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo que sea). Generalmente de resistencia a antibióticos. 2. Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plásmido. 3. Se mezclan los fragmentos. 4. Obtención de plásmidos recombinantes. 5. Se juntan los plásmidos con bacterias. 6. Incorporación de los plásmidos por transformación bacteriana. 7. Cultivo de bacterias en presencia de un antibiótico. 8. Las bacterias que no han incorporado el plásmido mueren (no son resistentes).
  • 25. T16. El ADN y la ingeniería genética. 3 – Clonación del ADN.
  • 26. T16. El ADN y la ingeniería genética. 4 – Identificación de clones mediantes sondas. Almacenamiento de genes clonados • Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido. • La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería contener muestras de todo el ADN del organismo. • Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos. • Estas genotecas pueden ser de plásmidos, fagos o de ADNc.
  • 27. T16. El ADN y la ingeniería genética. 4 – Identificación de clones mediantes sondas. Identificación de clones Sondas de ADN • Oligonucleótidos de cadena sencilla. • Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la secuencia de aminoácidos de la proteína. • Están marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser identificadas.
  • 28. T16. El ADN y la ingeniería genética. 4 – Identificación de clones mediantes sondas.
  • 29. T16. El ADN y la ingeniería genética. 5 – Reacción en cadena de la polimerasa. • Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y además en muy poco tiempo. La reacción es un proceso cíclico: 3.La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. 4.Cada una de las hebras es copiada por la ADN- polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermusaquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). 5.Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias.
  • 30. T16. El ADN y la ingeniería genética. 5 – Reacción en cadena de la polimerasa.
  • 31. T16. El ADN y la ingeniería genética. 5 – Reacción en cadena de la polimerasa. Aplicaciones de la PCR • Amplificación de: – ADN antiguos (mamuts, momias, fósiles… – ADN obtenidos de la escena de un crimen (medicina forense). – ADN de células embrionarias (diagnostico prenatal de trastornos genéticos). – ADN de genes virales (en células infectadas por virus difíciles de detectar, como el VIH). Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
  • 32. T16. El ADN y la ingeniería genética. 6 – Secuenciación del ADN. • Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimática (de la polimerización de DNA). • Elementos necesarios: - DNA polimerasa. - Oligonucleótido (primer o cebador), de 18-30 nucleótidos y complementario al extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar. - Mezcla de los 4 desoxinucleósidostrifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). - Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidostrifosfato (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia específica para cada uno de ellos).
  • 33. T16. El ADN y la ingeniería genética. 6 – Secuenciación del ADN. Pasos de la secuenciación 1. Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN (clonación). 2. Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples). 3. Mezcla de todos los componentes de la reacción. 4. Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un ddNTP marcado. 5. Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP*. 6. Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida. 7. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color. 8. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.
  • 34. T16. El ADN y la ingeniería genética. 6 – Secuenciación del ADN.
  • 35. T16. El ADN y la ingeniería genética. 7 – Genómica y proteómica.
  • 36. T16. El ADN y la ingeniería genética. 7 – Genómica y proteómica.
  • 37. T16. El ADN y la ingeniería genética. 7 – Genómica y proteómica.
  • 38. T16. El ADN y la ingeniería genética. 7 – Genómica y proteómica.
  • 39. T16. El ADN y la ingeniería genética. 8 – Ingeniería genética y medicina.
  • 40. T16. El ADN y la ingeniería genética. 8 – Ingeniería genética y medicina. Obtención de productos farmacéuticos 1.Secuencia de la proteína (insulina). 2.Síntesis de los ADN. 3.Obtención de plásmidos recombinantes con los genes para formar las dos cadenas de la insulina. 4.Expresión en E. coli. 5.Purificación y procesado químico. 6.Obtención de insulina activa.
  • 41. T16. El ADN y la ingeniería genética. 8 – Ingeniería genética y medicina. Medicina forense 2. Los seres humanos difieren en un 0,1% del genoma. 3. Estas diferencias están localizadas en regiones cromosómicas concretas. 4. Estas zonas se usan como marcadores genéticos. 5. Con la identificación de los marcadores se hace la huella genética (método de Southernblot). 6. La comparación de huellas genéticas permite resolver casos policiales.
  • 42. T16. El ADN y la ingeniería genética. 8 – Ingeniería genética y medicina.
  • 43. T16. El ADN y la ingeniería genética. 8 – Ingeniería genética y medicina. Terapia génica
  • 44. T16. El ADN y la ingeniería genética. 9 – Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.
  • 45. T16. El ADN y la ingeniería genética. 9 – Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.
  • 46. T16. El ADN y la ingeniería genética. 9 – Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente.
  • 47. T16. El ADN y la ingeniería genética. 10 – Ingeniería genética y ganadería.
  • 48. T16. El ADN y la ingeniería genética. 10 – Ingeniería genética y ganadería.
  • 49. T16. El ADN y la ingeniería genética. 11 – Proyecto Genoma Humano. • Objetivos: – Situar genes y marcadores moleculares en mapas genéticos de cada cromosoma. – Caracterizar y localizar físicamente fragmentos de ADN clonados. – Secuenciar los pequeños fragmentos para obtener la secuencia genómica completa.
  • 50. T16. El ADN y la ingeniería genética. 12 – Bioética. • Las ventajas de la ingeniería genética y de las nuevas tecnologías asociadas son muchas, pero los potenciales riesgos también lo son: – Ecológicos. Posibles efectos secundarios como la contaminación del agua o del suelo. – Sanitarios. Casos de alergias provocadas por alimentos transgénicos. – Sociales, éticos y legales. • Surge la bioética, aplicación de la ética a las ciencias de la vida.