biología molecular técnicas de manipulación

1. TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN
GENÉTICA
Dra. Carolina Flores
Genética 2020

2. Índice
1.
Introducción:
la clonación
molecular
2. Las
enzimas de
restricción.
Aislamiento
de ADN
foráneo.
3. Vectores de
clonación y
unión del
fragmento de
ADN
4.
Hospedadores.
Introducción
del
vector/ADN
foráneo
5. Métodos
de selección

3. Introducción: la clonación molecular
La clonación consiste en la obtención de un clon, entendido como
un conjunto de elementos genéticamente iguales entre si e iguales a
su precursor.

4. ... ¡¡ Dios mío, me han
clonado... !!

5. Estrategia general del proceso de clonación
1. Aislamiento del ADN foráneo
2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-DNA foráneo en la célula
hospedadora
4. Selección de los transformantes
5. Estabilidad de la información genética

6. Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular
1. Aislamiento del ADN
foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de
ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-
ADN foráneo en
la célula hospedadora
4. Selección de los
transformantes
5. Estabilidad de la
información genética
Cortar el ADN foráneo y el vector
con las mismas enzimas de
restricción

7. Vectores de clonación
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de
ADN
Son vehículos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN foráneo y
replicarlo.
Características principales
• Se replican de forma autónoma (origen de replicación)
• Contienen regiones no esenciales para su multiplicación y
estabilidad

8. Tipos de vectores
Plásmidos
•Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son más
con insertos más pequeños (<10kb).
•Contienen genes de resistencia a antibióticos.
Virus
•Permiten insertar 15-20 kb.
•El sistema de infección del virus permite la entrada
en E. coli.
•Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones
para secuenciar y realizar mutagénesis.
Vectores híbridos: cósmidos. Permiten insertar hasta 40

9. Tipos de vectores de clonación
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de
ADN
• Plásmidos (bacterianos)
• Virus
• Cósmidos (laboratorio)
• YACs (levaduras)

10. • Plásmidos
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
pBR322
-Control relajado
-Fenotipo seleccionable
-Cierto Nº de sitios de restricción
-Bajo PM (4 363 bp) (transformación con plásmidos 10,000 bp es poco eficiente)
ADN Plasmídico
ADN
ADN Plasmídico

11.  Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta
unas características que son muy beneficiosas:
 Son derivados del pBR322.
 Es pequeño: puede transportar fragmentos de
ADN relativamente grandes
 Tiene un origen de replicación y puede producir
hasta 500 copias de los fragmentos de ADN
insertado por célula.
 Se ha modificado para que presente muchas
secuencias de reconocimiento para enzimas de
restricción que se han agrupado en una región
denominada polylinker o multiple cloning site.
 Contiene un fragmento del gen
bacteriano lacZ que produce colonias de color
azul.
pUC18

12. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de
ADN
• Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13
• Para plantas: CaMV
• Para mamíferos: SV40
Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad que
poseen para introducir el ADN foráneo en la célula
hospedadora

13. • Virus
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de
ADN
-El corte por los sitios cos y el empaquetamiento
en la cápsida puede hacerse in vitro. La cápsida
admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del
DNA l).
-Se introduce en la bacteria hospedadora por
transducción
Fago λ

14. Adsorción de particulas virales a una bacteria

15. SIDA

16. Tipos de vectores de clonación
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de
ADN
• Plásmidos (bacterianos)
• Virus
• Cósmidos (laboratorio)
Mezcla plásmido y virus
• YACs (levaduras), contienes sitios característicos
de la funcionalidad de los cromosomas
V

17. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de
ADN
COSMIDO
Un plásmido que
posee el sito cos
del fago l
Secuencias
plasmídicas
necesarias para la
replicación y genes
de resistencia a
antibióticos
50 kb de ADN insertado

19. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
Levaduras
Vector YAC
100- 1000 kb
 Telómeros en sus extremos
 Un origen de replicación
 Un centrómero
 Genes marcadores de selección
 Enzimas de restricción para
insertar ADN exógeno

20. Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular
1. Aislamiento del ADN
foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de
ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-
ADN foráneo en
la célula hospedadora
4. Selección de los
transformantes
5. Estabilidad de la
información genética
Cortar el ADN foráneo y el vector con las
mismas enzimas de restricción
Vector de
clonación

21. Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular
1. Aislamiento del ADN
foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de
ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-
ADN foráneo en
la célula hospedadora
4. Selección de los
transformantes
5. Estabilidad de la
información genética

22. Formación de ADN recombinante: unión ADN foráneo-vector
3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN

23. 3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN
Enzimas de restricción
Vector ADN

24. Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular
1. Aislamiento del ADN
foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de
ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-
ADN foráneo en
la célula hospedadora
4. Selección de los
transformantes
5. Estabilidad de la
información genética

25. Transformación: ADN plasmídico en célula. CaCl2 (mejora el
proceso). Para plásmidos < 20 Kb
Infección: directa del virus empaquetado in vitro
Transducción: ADN vírico sin cápsida (menor rendimiento)
Microinyección: para células grandes (eucariotas) con
micromanipulación.
Pistola o Bombardeo de partículas: para transformar
vegetales.
Conjugación: del ADN de dos células
Fusión de Protoplastos: intercambio ADN, dos células sin pared
celular

26. Transformación.
Transducción

27. Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular
1. Aislamiento del ADN
foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de
ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-
ADN foráneo en
la célula hospedadora
4. Selección de los
transformantes
5. Estabilidad de la
información genética

28. Resistencia a
antibióticos
Genes marcadores
(gen b-
galactosidasa)
GFP (green
fluorescent protein)
Hibridación de
colonias
MÉTODOS DE SELECCIÓN

29.  Resistencia a antibióticos
La resistencia la confieren genes que porta el vector,
en este caso a ampicilina y a tetraciclina
Plásmido
pBR322
El ADN
foráneo se
inserta en el
gen de
resistencia a
Ampicilina

30. Sin plásmido
Sin inserto
5. Métodos de selección
 Resistencia a antibióticos
La resistencia la confieren genes que porta el vector
Con ampicilina
y tetraciclina
Con plásmido
Sin inserto
Con plásmido
Con inserto
Con
tetraciclina

31. 5. Métodos de selección
MÉTODOS DE SELECCIÓN
 Resistencia a antibióticos
 Genes marcadores (gen b-galactosidasa)
 GFP (green fluorescent protein)
 Hibridación de colonias

32. 5. Métodos de selección
• Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa)
5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido  Br-Cl-indol + galactosa
(X-gal) (Azul)
 Inactivación insercional
(introducir el DNA foraneo en el medio del marcador)
 Inserción génica positiva
(Unir el gen marcador al DNA foraneo)
Amp
Gal
Ori
pUC19

33. 5. Métodos de selección
• Genes marcadores (gen b-galactosidasa)
Plasmido pUC19
Amp
Gal
Ori
Plasmido pUC19
Amp
Gal + inserto
Ori

34. 5. Métodos de selección
• Genes marcadores b-galactosidasa

35. 5. Métodos de selección
b-galactosidasa b-galactosidasa +
ADN foráneo
pUC19 = plásmido
X

36. 5. Métodos de selección
 GFP (green fluorescent protein)

37. 5. Métodos de selección
510
488
Tubulina
GFP-TUB
530
515
Retículo endoplásmico
YFP-ER
510
488
Peroxisomas
GFP-
PEROXI
530
515
Núcleo
YFP-NUC
475
420
Mitocondria
CFP-MITO
600
550
Mitocondria
RFP-MITO
510
488
Membrana
M-GFP
510
488
Endosomas
GFP-ENDO
475
420
Ap. De Golgi
CFP-GOLGI
510
488
Actina
GFP-ACTIN
Emisión
(nm)
Excitación
(nm)
Localización
Vector
 GFP (green fluorescent protein)

38. Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular
1. Aislamiento del ADN
foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de
ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-
ADN foráneo en
la célula hospedadora
4. Selección de los
transformantes
5. Estabilidad de la
información genética

39. Genotecas
Genoteca: colección de clones que contiene todo el genoma de un
organismo.
Tipos de genotecas:
• Genómicas
• Parciales
• ADNc. Colección de ARNm
Tipos de vectores:
• Plásmidos (Genotecas parciales)
• Fagos (Genotecas genómicas pequeñas y de ADNc)
• Cósmidos, BAC (genotecas genómicas complejas)

40. 6. Obtención de genotecas
Utilizando un virus
Utilizando un plásmido

41. 5. Métodos de selección
• Hibridación de colonias
Consiste en detectar secuencias
de DNA en colonias
transformadas mediante
hidridación “in situ” con sondas
marcadas
• Obtención de la sonda
marcada:
• marcaje radioactivo: (32P)
• marcaje desoxinucleótidos
fluorescentes

42. ¿CÓMO SE HACE UNA PLANTA TRANSGÉNICA?
1. técnicas indirectas: transformación de células mediada por Agrobacterium tumefaciens.
2. técnicas directas: electroporación, microinyección, liposomas y métodos químicos.
Aplicaciones de la ingeniería genética

43. APLICACIONES DE LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS
Resistencia a herbicidas, a insectos y a
enfermedades microbianas. Ej. Bacillus
thuringiensis (toxina - Bt)
Incremento del rendimiento fotosintético
transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas
C4 que es más eficiente.
Mejora en la calidad de los productos
agrícolas Tal es el caso de la colza y la soja
transgénicas que producen aceites modificados, que no
contienen los caracteres indeseables de las plantas
comunes.
Síntesis de productos de interés comercial
Existen ya plantas transgénicas que producen
anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de
un poliéster destinado a la fabricación de plásticos
biodegradables.
Asimilación de nitrógeno atmosférico se

44. ¿Cómo se hace un animal
transgénico?
La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas:
• Transgénesis por microinyección de zigotos
• Transgénesis por manipulación de células embrionarias