Este documento presenta resúmenes de varios artículos sobre ingeniería genética. Incluye información sobre métodos de secuenciación de ADN como el método de Sanger, ensamblaje de contigs, plataformas de secuenciación de nueva generación, y tipos de bases de datos. También cubre temas como CRISPR, vectores virales, plásmidos y herramientas para la expresión de proteínas en microorganismos.

1. Respuestas al Cuestionario Tema 3 – Introducción a la
Ingeniería Genética
Considerar que las respuestas aquí brindadas no son estrictas (en la mayoría de los casos).
Lo que significa que, si las respuestas que ustedes proporcionaron poseen la misma
información con otras palabras o quizás, mayor información, también fueron consideradas
como correctas.
Del artículo: Bioinformatics. Zhang & Liu (2013).
1. (1) Métodos de secuenciamiento de DNA; (2) Desarrollo de herramientas bioinformáticas
de software y algoritmos y; (3) Anotación, análisis e interpretación de los datos biológicos a
través de softwares y algoritmos.
2. El método de Sanger es llamado método dideoxi pues marca nucleótidos con un
fluoróforo específico para cada nucleótido (ddA, ddT, ddC y ddG), el método consiste en:
• Desnaturalizar el DNA y colocar primers para su amplificación,
• El DNA se amplifica y nuevamente es desnaturalizado.
• Cada fragmento de DNA desnaturalizado es colocado en 4 tubos diferentes, cada
uno conteniendo un fluoróforo de cada nucleótido que se acoplará al OH del
extremo 3’ de la secuencia.
• Las secuencias son extendidas.
• Una vez que el fluoróforo se integra al DNA, la DNA polimerasa no extiende más la
secuencia.
• Los fragmentos resultantes son corridos en geles de agarosa y la posición en el gel,
además de la fluorescencia identifica el nucleótido y por ende la secuencia específica
del gen.
3. Un contig es una serie de solapamientos de secuencias de DNA usados para realizar un
mapa de posicionamiento espacial de una secuencia específica dentro de un genoma. Estas
secuencias están ordenadas obteniendo un “consenso” que minimiza errores de
ordenamiento de las secuencias del DNA. El tamaño promedio de un contig varia entre los
500 a 5000 pb.
4. Es el conjunto de las diferentes plataformas de secuenciación de DNA generadas en los
últimos años que tienen altos rendimientos y exactitud en la generación de secuencias de
DNA. NGS incluye sistemas como Roche 454, Illumina, Solexa o Applied Biosystems SOLiD
System.
5. Las bases de datos primarias almacenan los datos de secuencia de DNA originales
(Ejemplo: NCBI, EMBL, DDBJ), mientras que las bases de datos secundarias contienen
secuencias que son derivadas de los datos de las bases de datos primarias que generan
bases de datos basados en familias de proteínas o de patrones de secuencias.

2. Del artículo: Next-generation microbiology: from comparative genomics to gene function.
Kobras et al. (2021).
1. Un pequeño fragmento de RNA forma un complejo con el DNA de unión de la proteína
Cas9 inactivada, ambos fragmentos se unen a la región específica del genoma que se busca
“inactivar”. El complejo bloquea la RNA polimerasa del gen “blanco” por bloqueo estérico,
reprimiendo la transcripción del gen de interés (“blanco”).
2. (1) Represión génica y; (2) Complementación génica. Para validar la represión génica se
sugiere el uso de CRISPRi, mientras que para validar la complementación génica es a través
de un sistema de expresión condicional de un plásmido o de un locus ectópico en el
genoma.
3. A través de 3 estrategias que determinan cuando y donde el gen es expresado en la
célula: (1) Reemplazando la secuencia codificante del gen candidato con un gen reportero
que medie o monitoree la expresión por fluorescencia, luminiscencia o actividad enzimática;
(2) Midiendo directamente la expresión del RNAm del gen candidato por RT-PCR y; (3)
Microarrays basados en secuencias de RNAm (RNA-seq).
4. β-galactosidasa y Luciferasa.
5. La bioinformática al utilizar diferentes puntos de vista para analizar el significado de las
secuencias para brindarles una función biológica, escapa muchas veces al lógico
entendimiento de la microbiología fundamental, por lo tanto, para un investigador no
especialista en bioinformática, estos sets de datos le resultan abstractos.
Del artículo: Recent advances in plasmid-based tools for establishing novel microbial
chassis. Nora et al. (2019).
1. Chasis biológico refiere a cualquier organismo capaz de albergar y soportar los
componentes genéticos sintéticos (foráneos) a través de su maquinaria molecular natural o
modificada como por ejemplo sus sistemas transcripcionales y traduccionales.
2. (1) Entendimiento básico de la biología y manipulación de los nuevos organismos,
comprender su eficiencia de crecimiento y su sistema de recepción de DNA
(electroporación, transducción o conjugación). (2) Encontrar elementos comunes entre el
genoma de los nuevos organismos con los de los vectores (orígenes de replicación,
marcadores moleculares y elementos regulatorios), permitiendo conocer la estabilidad y
funcionalidad de estos vectores dentro del hospedero. (3) Determinar las herramientas
necesarias para controlar la evolución del chasis bacteriano y evitar mutaciones específicas
en el genoma del nuevo organismo o modificaciones secuenciales dentro del vector de
clonación.
3. Un vector episomal es un plásmido o virus que se replican de manera autónoma dentro
de la célula hospedera y tienen el potencial de ser transferidos a otras células en procesos
de mitosis y conjugación celular. Por otra parte, un vector integrativo es incapaz de

3. replicarse dentro de la célula hospedera, de manera que el vector debe integrarse al
genoma del hospedero o desaparecer, también son llamados vectores suicidas.
4. Los azúcares de 5 carbonos son ampliamente encontrados en residuos lignocelulósicos
(hemicelulosas), estos carbonos son sustratos de bajos costos que podrían abaratar
significativamente los costos de producción de proteínas o productos recombinantes por
levaduras, en especial porque la mayoría de las levaduras tienen muchas dificultades
utilizado azúcares de 5 carbonos como fuente de carbono al preferir los azúcares de 6
carbonos.
5. (1) Son capaces de producir proteínas recombinantes glicolisadas humanas; (2) Producen
proteínas farmacéuticas para tratar la angioedema hereditaria; (3) Permite el reuso de los
marcadores de selección (Zeomicna) a través de multiples deleciones de su genoma; (4)
Permite multiples integraciones y reciclaje de marcadores utilizando sistemas de
recombinación y; (5) Son capaces de producir y secretar la proteína de interés al medio de
cultivo.
Del artículo: Single plasmid systems for inducible dual protein expression and for CRISPR-
Cas9/CRISPRi gene regulation in lactic acid bacterium Lactococcus lactis. Berlec et al.
(2018).
1. pNZDual. Los sitios de clonación MC1 (sitio de restricción BglII 1) y MC2 (sitio de
restricción BglII 294) poseen 2 sitios promotores de nisina (PnisA) con sus respectivos 2
sitios de unión a ribosomas (RBS) y solo un terminador de transcripción general para ambos
sitios de restricción.
pNZDualTT. Los sitios de clonación MC1 (sitio de restricción BglII 1) y MC2 (sitio de
restricción BglII 446) poseen 2 sitios promotores de nisina (PnisA) con sus respectivos 2
sitios de unión a ribosomas (RBS) y 2 sitios terminadores de transcripción al final de cada
sitio de inserción de los genes MC1 y MC2, razón por la cual el sitio de restricción de MC2 se
traslada de la posición BglII 294 e pNZDual a BglII 446 de pNZDualTT.
pNZPolycist. Los sitios de clonación MC1 y MC2 (sitio de restricción BglII 1) se hallan bajo
control de 1 sitio promotor de nisina (PnisA) pero manteniendo sus respectivos 2 sitios de
unión a ribosomas (RBS) para cada gen y 1 sitio terminador de transcripción al final del sitio
de inserción de los genes MC1 y MC2.
2. DARPin. El plásmido pNZ8148 y el plásmido pNZPolycist conteniendo el gen codificante
de DARPin en el sitio de clonación múltiple MC1 y el gen IRFP en el sitio MC2. IRFP. El
plásmido pNZDual que contiene al gen codificante de IRFP en el sitio de clonación múltiple
MC2, en el cual, el MC1 no codifica ningún otro gen.
Si se desea una co-expresión de ambos genes como resultado final, el vector sugerido de
producción de los genes DARPin e IRFP es el pNZDual conteniendo el gen DARPin en la
posición MC1 y el gen IRFP en posición MC2. Este plásmido logra que ambos genes expresen
similares niveles de ambas proteínas, a pesar que los niveles de expresión de ambos genes
no sean los más altos de cada gen por separado.

4. 3. Un vector policistrónico es un plásmido capaz de expresar dos o más RNAm codificantes
de genes de interés utilizando uno o más sistemas de expresión dentro del mismo vector.
Generalmente estos vectores pueden ser construidos ligando un ORF individual con una sola
secuencia conteniendo el sitio de unión de ribosomas (RBS).
4. El marcador gen marcador de selección utilizado en la totalidad de los ensayos fue el
codificante de cloranfenicol acetil transferasa (resistencia a cloranfenicol). El plásmido
pIAV7 utilizado para la prueba de resistencia a eritromicina, contenía el gen codificante de
eritromicina esterasa ermR.
5. La mutación sitio-dirigida es una técnica de mutagénesis sitio-dirigida de un plásmido de
doble hebra de DNA. Permite crear sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos
dentro de una secuencia codificante de genes.
Consiste en diseñar primers específicos de sustitución, deleción e inserción, requiriendo
para ello de una polimerasa de alta fidelidad. Las modificaciones son entonces amplificadas
por PCR, los modelos son eliminados y los plásmidos resultantes son transformados,
amplificados y secuenciados para verificar la modificación positiva de los genes.
En ingeniería genética las mutaciones sitio-dirigidas permiten el desarrollo experimental de
la biología sintética que consiste en el diseño de proteínas y sus genes codificantes acorde a
características que permitan su mejoramiento estructural. Las modificaciones pueden
optimizar secuencias de aminoácidos optimizando propiedades de las proteínas (catálisis,
estabilidad, unión a subunidades o sustratos, etc.).
Del artículo: Viral vectors: from virology to transgene expression. Bouard et al. (2009).
1. (1) Proceso de producción del vector; (2) la estabilidad; (3) diferenciación de expresión
transitoria o de largo plazo; (4) los elementos regulatorios del vector; (5) procesos de
acoplamiento al hospedero y; (6) diversidad y disponibilidad del vector a diferentes tipos
celulares.
2. Para la producción de vectores virales derivados de Adenovirus se requiere del gen de
interés, secuencias de origen de replicación y empaquetamiento del vector, además
requieren de un “virus ayudante” que provean las proteínas estructurales. Para la
producción de Retrovirus se requiere de dos componentes importantes, el gen de interés
conteniendo el cassette de expresión flanqueado con regiones cis de inicio/terminación y las
proteínas encargadas de la replicación y encapsulamiento del vector.
3. (1) De alto nivel y promotores virales constitutivos; (2) promotores inducibles; (3)
promotores tejido-específicos o; (4) promotores endógenos, incluyendo locus genómicos y
otras secuencias regulatorias.
Promotores constitutivos. No necesitan de controles estrictos de expresión, tienen niveles
de expresión del gen de interés alta y generalmente de expresión transitoria. Promotores
inducibles. Promotores regulados por antibióticos o factores físico-químicos, son tipo-

5. celular específicos, su expresión puede ser transitoria o a largo plazo y pueden adherirse a la
célula hospedera por recombinación.
4. Los genes terapéuticos puedes ser introducidos a las células blanco ex vivo, cuando las
células blanco son aisladas, tratadas con el vector viral conteniendo el gen de interés de
corrección, la introducción del gen de interés y su acoplamiento a las células blanco y
finalmente la reinserción de las células blanco al hospedero. Los genes terapéuticos puedes
ser introducidos a las células blanco in vivo, cuando el vector viral es hábil de entregar el
gen de interés directamente a las células blanco específicas dentro del hospedero.
5. Los retrovirus son considerados vectores virales más óptimos para una expresión de un
gen a largo plazo por su habilidad de integrar el transgen a la célula blanco. Sin embargo, las
principales desventajas son que la integración no es “automática” y no es garantizada, por
lo que la expresión del gen puede perderse con el tiempo y además, la integración del gen
de interés puede ocurrir en locaciones o células no deseadas (no blanco).