Técnicas en biología molecular y celular

1. Técnicas en biología
molecular y celular

2. Transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia
(FRET, fluorescence resonance energy transfer). Este diagrama esquematico
muestra un ejemplo del uso de la tecnologia FRET para seguir
el cambio en la conformacion de una proteina (PKG) despues de la union
a cGMP. Las dos pequenas proteinas fluorescentes en forma de barril,
CFP mejorado (ECFP, enhanced CFP) y YFP mejorado (EYFP, enhanced
YFP), se muestran en su color fluorescente. En ausencia de cGMP, la excitacion
de ECFP con luz de 440 nm conduce a la emision de luz de 480
nm de la proteina fluorescente. Despues de la union a cGMP, un cambio
conformacional en PKG pone a las dos proteinas fluorescentes lo suficientemente
cerca para que ocurra la FRET. Como resultado, la excitacion del
donante de ECFP con luz de 440 nm conduce a la transferencia de energia
al aceptador de EYFP y a la emision de luz de 535 nm del aceptador.
Las versiones mejoradas de estas proteinas tienen una mayor intensidad
de fluorescencia y tienden a ser mas estables que las moleculas de proteina
originales.

3. Microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser. a)
Las trayectorias de luz en un microscopio de fluorescencia confocal. La
luz de la longitud de onda corta (azul) es emitida por una fuente de laser,
pasa a traves de una pequena abertura y se refleja en un espejo dicroico
(un tipo de espejo que refleja ciertas longitudes de onda y transmite a
otros) en un objetivo y se enfoca en un punto del plano de la muestra. Los
fluoroforos en la muestra absorben la luz incidente y emiten luz de mayor
longitud de onda, que puede pasar a traves del espejo dicroico y enfocarse
en un plano que contiene una abertura estenopeica. La luz luego pasa
a un tubo fotomultiplicador que amplifica la senal y se transmite a una
computadora que forma una imagen procesada y digitalizada. Se evita
que los rayos de luz que se emitan desde arriba o debajo del plano optico
en la muestra pasen a traves de la abertura estenopeica y, por tanto, no
contribuyen a la formacion de la imagen. Este diagrama muestra la iluminacion
de una sola mancha en la muestra. Diferentes sitios dentro de este
plano se iluminan por medio de un proceso de escaneo laser. El diametro
de la abertura estenopeica es ajustable. Cuanto menor es la apertura, mas
delgada es la seccion optica y mayor es la resolucion, pero la senal es
menos intensa. b) Micrografias de fluorescencia confocal de tres secciones
opticas separadas, cada una de 0.3 μm de espesor, de un nucleo de
levadura tenido con dos anticuerpos diferentes marcados fluorescentemente.
El anticuerpo fluorescente rojo ha tenido el DNA dentro del nucleo,
y el anticuerpo fluorescente verde ha tenido una proteina de union
de los telomeros que se localiza en la periferia del nucleo.

5. Procedimiento utilizado para la proyección de la sombra
como medio para proporcionar contraste en el microscopio electrónico.
Este procedimiento se usa a menudo para visualizar particulas pequenas,
como los virus que se muestran en la figura anterior. Las moleculas de
DNA y RNA a menudo se hacen visibles mediante una modificacion de este
procedimiento conocido como sombreado giratorio en el que el metal
se evapora en un angulo muy bajo mientras se gira la muestra.

8. Purificación de las fracciones subcelulares mediante
centrifugación en equilibrio de densidad-gradiente. En este ejemplo particular,
el medio esta compuesto por un gradiente continuo de densidad
de sacarosa y los diferentes organulos se sedimentan hasta que alcanzan
un lugar en el tubo igual a su propia densidad, donde forman bandas.

9. Cromatografía de intercambio iónico. La separación de
dos proteinas por la DEAE celulosa. En este caso, se utiliza una
resina de intercambio ionico cargada positivamente para unir la
proteina cargada negativamente.
Cromatografía de filtración en gel. La separacion de
tres
proteinas globulares que tienen diferente masa molecular.
Entre las proteinas de forma basica similar, las moléculas
mas grandes se eluyen antes que las moleculas mas
pequenas.

10. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Las muestras de las proteinas se disuelven en una solucion de
sacarosa cuya densidad evita que la muestra se mezcle con el tampon y luego se cargan en los pocillos con una
pipeta fina como se muestra en el paso 1. En el paso 2, se aplica una corriente directa a traves del gel, que hace
que las proteinas se muevan hacia la poliacrilamida a lo largo de los carriles paralelos. Cuando se lleva a cabo en
el detergente SDS, que suele ser el caso, las proteínas se mueven como bandas a velocidades que son
inversamente proporcionales a su masa molecular. Una vez que se completa la electroforesis, el gel se retira del

11. Separación de fragmentos de restricción del DNA por
electroforesis en gel. a) El DNA se incuba con una enzima de restriccion,
que lo corta en fragmentos (pagina 723). La mezcla de fragmentos se
introduce
en una ranura, o bien, en una placa de agarosa y se aplica una
corriente electrica. Las moleculas de DNA con carga negativa migran hacia
el electrodo positivo y se separan por tamano. b) Todos los fragmentos
de DNA que estan presentes en un gel pueden revelarse sumergiendolo
en una solucion de bromuro de etidio y luego observandolo bajo una luz
ultravioleta.

12. Determinación de la ubicación de los fragmentos de DNA específicos en un gel mediante una transferencia Southern. Como se
describe
en la figura, los fragmentos de DNA fraccionados se lavan del gel y se atrapan en una membrana de nitrocelulosa, que se incuba con
sondas de
DNA (o RNA) marcadas radiactivamente (o con fluorescencia). La ubicacion de los fragmentos hibridados se determina de forma
autorradiografica (o microscópicamente si las sondas estan marcadas con fluorescencia). Durante el procedimiento de transferencia, la
accion capilar empuja el tampon hacia arriba en las toallas de papel. A medida que el tampon se mueve a traves del gel electroforetico,
disuelve los fragmentos de DNA y los transfiere a la superficie de la membrana adyacente

13. Formación de una molécula de DNA recombinante