Métodos de separación de ácidos nucléicos (Eletroforesis y Cromatografía)

1. SEPARACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Metodología del DNA Recombinante

2. Método fisicoquímico, que tienen como
finalidad la separación de mezclas basándose
en la diferente capacidad de interacción de
cada componente con otra sustancia.

3. Elementos de la Cromatografía
 Fase Móvil
Eluyente.
Contiene el analito y migra a través de la fase
estacionaria.
 Fase Estacionaria
Adsorbente.
Permanece inmóvil.

4. Separación del analito
 Cromatografía de partición
Distribución de los componentes entre las
fases móvil y estacionaria
 Cromatografía de adsorbción
Adsorción por la fase estacionaria
 Cromatografía de intercambio iónico
Efectos de intercambio iónico
 Cromatografía de afinidad
Unión selectiva a la fase estacionaria

5. High-Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
Utilizada para la separación de oligonucleótidos.
Es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basándose en
diferentes tipos de interacciones químicas entre
las sustancias analizadas y la columna
cromatografíca.

6. Cromatografía de Adsorbción
 Los ác. nucleicos se unen selectivamente a sílice
o vidrio, en presencia de sales caotrópicas.
 Se utiliza hidroxiapatita, es una forma de
fosafato de calcio Ca5(PO4)3(OH)2 .
 El DNA de doble cadena tiene especial afinidad
por el; el DNA puede aislarse mediante el pasaje
del lisado de células a través de la columna.
 Se recuperan los ác. nucleicos con una solución
hiposalina.

7. Cromatografía de Afinidad
Es una adaptación de la cromatografía de
adsorbción.
Un ligando inmovilizado reconoce y se une al
analito de interés, se realizan lavados que
remueven los componentes no unidos y un
elución final que permita separa el analito.

8. Ejemplo: Aislamiento de RNAm
Se utiliza una columna de
celulosa que presenta
cadenas de oligo(dT).
Se carga el ARN con un
tampón EDTA-SDS con
NaC.
Los RNAm retenidos
pueden ser eluidos con un
tampónTris-EDTA.

9. Cromatografía de Intercambio
Iónico
Un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un
intercambiador iónico con grupos cargados positivamente.
Se eluirán primero de la columna las moléculas cargadas positivamente
que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el
tampón de elución eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y
luego las de mayor carga negativa neta.

10. Se utilizan dos tipos de
intercambiadores
ióicos:
 Metilaminoetanol
 Dietilaminoetil

11.  Permite la concentración y purificación de
DNA de calidad.
 Rápida y eficaz.

12. Cromatografía de Exclusión
(Filtración en gel)
Se basa en el tamaño de las partículas.
Moléculas grandes  Migran más rápido
Moléculas pequeñas Se retienen en los poros.

13.  Permite la separación de ácidos nucleicos a partir
de substancias de bajo peso molecular.
 Emplea columnas de sílice o de polímeros
orgánicos.
 Purificación en gel de agarosa de un ác. nucleico
de determinado tamaño.
 Utilizado en la clonación de vectores.

14. Es una técnica para la separación de moléculas
según la movilidad de estas en un campo eléctrico
a través de una matriz porosa, la cual finalmente
las separa por tamaños moleculares y carga
eléctrica.

15. Proceso general de
Electroforesis
1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la
concentración requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer
de carga adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electroforética al voltaje
pertinente.
5.Visualizar.

16. Elementos necesarios para la
Electroforesis
 Cámara de electroforesis
Permite la generación de un campo eléctrico
alrededor de un gel en el que se depositan las
muestras.
Cuenta con dos polos que se conectan a una
fuente de energía.

17.  Gel
Da soporte para evitar perturbaciones
mecánicas durante la separación.

18. Electroforesis en Gel de
Agarosa
100pb a 25 kb
No tóxico
Permite analizar pesos moleculares variados
Menor poder de resolución de la poliacrilaminda

21. Electroforesis en Gel de
Poliacrilamida (PAGE)
Polímero sintético
Polimerización de acrilamida y bisacrilamida
Tóxico
Poros de menor tamaño que la agarosa
Puede ser utilizado para secuenciación.

22. La poliacrilamida se forma por copolimerización
de dos compuestos, la acrilamida y la bis-
acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una
reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina
(TEMED) y el persulfato de amonio. El radical
persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa
al monómero de acrilamida para que polimerice.
 A 150 ml de la solución de poliacrilamida al 5% se
le agregan 1 ml de solución de persulfato de
amonio al 10% y 100 µl deTEMED.

25. 1.Tanque externo
2. Conectores tipo banana
3. Soporte para geles
4. Cuña
5.Tapa
6. Cables fijos

26.  Buffer de corrimiento
Proporciona el medio para la transmisión de la
corriente eléctrica y mantiene el pH sin
variaciones mientras se realiza el corrimiento. En
el caso de los ácidos nucleicos, pueden
emplearse:
TBE TAE
Tris base, ácido bórico y
EDTA, y se maneja a un pH
de 7.2.
Tris base, ácido acético y
EDTA, ajustado
a pH 8.5.

27.  Buffer de carga
Tiene como fin brindar peso, densidad y color a la
muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su
salida del gel.
Relación 1:3 respecto a la muestra
Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol

28. Electroforesis en ácidos
nucleicos
 Las movilidad dependerá únicamente de la longitud
(pb).
 Se realiza con voltajes de 25 y 100V.
 Se monitorea en avance por la visualización de los
colorantes.
 molecular de las moléculas de DNA que se va a
separar.
 Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5
kb) se recomienda usar voltajes comprendidos entre
75 y 100V.
 Para muestras de DNA genómico y plasmídico (> 2
kb) se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75V.

30. Visualización de las
muestras
 Utilización de bromuro de etidio
 Incorporar antes de solidificar(0.5mg/ml)
 Luego del corrimientos, incubando el gel en
una solución que contenga 0.5mg/ml
Emite fluorescencia naranja al exponerse a UV
con longitud de absorción de 254nm y
longitud de emisión de 366nm.

32. Electroforesis en Gel de
Campo Pulsante (PFGE)
Permite resolver moléculas de DNA de hasta
10 millones de pb.
La polaridad de lo s electrodos se revierte
periódicamente , y cada pulso dura ente 0.1 y
1000 s

33. Colorantes
 Azul de bromofenol
Por su menor tamaño, se mueve más rápido
que las proteínas o que la mayoría de
moléculas de DNA (siempre que éstas sean
superiores a 300 pb), es decir, marca el "frente
de avance".

34.  Bromuro de etidio
Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que
tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce
entre sus bases apiladas. interacciona también con DNA
monocatenario.
 Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia. Se excita
con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emite su
fluorescencia como luz visible, de color rosado-
anaranjado.

35.  GelRed
Se excitan con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y
emiten luz visible, de color rojo (de ahí el nombre del
reactivo).
Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una
disolución de GelRed™, o bien incorporar éste a la
disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

36. Transluminador Ultravioleta

37. Bibliografía
 Voet;Voet.(2011).Biochemistry.4th Edition.USA,
JOHNWILEY & SON,INC.
 Salazar; Sandoval; Armendáriz (2016)Biología
Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las
ciencias de la salud.2 Edición.McGrawHillEducation.
 Pérez, D. M. (2000). Electroforesis en geles de
poliacrilamida: fundamentos,. Obtenido de
bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.pdf
 Wink. (2009)An Introduction to Molecular
Biotechnology. Fundamentals, Methods and
Aplications.2 Edition.Willey-Blackwell