ADN Recombinante e Ingieniería Genética Capítulo 16
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Ejemplo de Terapia Génica <ul><li>Mujer con hipercolesterolemia familiar </li></ul><ul><li>Se le removió parte de su hígad...
Resultados de la terapia génica  <ul><li>Las células modificadas vivieron en el hígado de la mujer </li></ul><ul><li>Los n...
Cambios Genéticos <ul><li>Los humanos han estado cambiando la genética de otras especies por miles de años </li></ul><ul><...
Ingieniería Genética  <ul><li>Los genes son aislados, modificados, e insertados dentro de un organismo </li></ul><ul><li>E...
Discubriendo las Enzimas de restricción <ul><li>Hamilton Smith estaba estudiando la forma en que la bacteria  Haemophilus ...
Especificidad de los cortes  <ul><li>Las enzimas de restricción cortan el ADN en una secuencia específica </li></ul><ul><l...
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¿Podría escapar del laboratorio una bacteria genéticamente modificada? <ul><li>Las bacterias genéticamente modificadas son...
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Amplificando ADN <ul><li>In vivo:  Los fragmentos pueden ser insertados dentro de microorganismos de crecimiento rápido  <...
Reacción en cadena de la  Polimerasa <ul><li>Se calienta la secuencia que se desea copiar </li></ul><ul><li>Se agregan los...
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Huellas genéticas o DNA Fingerprints <ul><li>Patron de bandas único que se obtiene después de una electroforesis del genom...
Repeticiones en Tandem  <ul><li>Cortas regiones de ADN que difieren sustancialmente entre las personas </li></ul><ul><li>E...
RFLPs  ( R estriction  f ragment  l ength  p olymorphisms) <ul><li>Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricc...
 
Electroforesis <ul><li>El ADN se pone en un “pozo” en uno de los extremos del gel. </li></ul><ul><li>Se aplica una corrien...
Analizando huellas genéticas  <ul><li>El ADN se hace visible mediante el marcaje con un isótopo de una sonda de ADN que se...
 
Huellas genéticas con sondas multilocus
Secuenciación de Genomas  <ul><li>1995 – Primera Secuencia en ser determinada: bacteria  Haemophilus influenzae . </li></u...
Nucleotidos para secuenciación <ul><li>Nucleótidos (A, T, C, G) </li></ul><ul><li>Versiones modificadas de estos nucleótid...
Mezcla para la reacción  <ul><li>Copias del ADN a ser secuanciado </li></ul><ul><li>Primer </li></ul><ul><li>DNA polimeras...
Procedimiento de la reacción <ul><li>Se sintetiza una hebra complementaria con los nucleótidos </li></ul><ul><li>Cuando se...
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Bibliotecas de genes <ul><li>Bacterias que  contienen diferentes fragmentos de ADNs clonados : </li></ul><ul><ul><li>Bibli...
Usando una sonda para encontrar un gen <ul><li>Usted desea saber cual bacteria de todas en una librería contiene un gen es...
Uso de una sonda Colonies on plate Cells adhere  to filter Cells are lysed; DNA sticks  to filter Probe is  added Location...
Ingieniería de proteinas <ul><li>Las bacterias pueden ser usadas para obtener miles o millones de copias de moléculas de u...
Limpieza del ambiente Bio-remediación <ul><li>Existen microorganismos que normalmente digieren basura orgánica y reciclan ...
El plásmido Ti  <ul><li>Investigadores </li></ul><ul><li>reemplazan genes que causan tumores por genes beneficiosos  </li>...
Ingieniería de plantas <ul><li>Plantas de algodón pueden hacerse resistentes a hierbicidas </li></ul><ul><li>Plantas de as...
Primeros mamíferos manipulados genéticamente <ul><li>Usaron ratones deficientes en hormona del crecimiento (enanos) </li><...
Clonando a Dolly <ul><li>1997 - Una oveja fué clonada a partir de una célula de adulto. </li></ul><ul><ul><li>Un nucleo de...
Diseñando Ganado <ul><li>Embriones de ganado vacuno se pueden hacer crecer en cultivo y modificados genéticamente para </l...
Proyecto del Genoma Humano, U.S.A. Human Genome Organization HUGO, 1988 <ul><li>1990 planeado para 15 años: </li></ul><ul>...
Anormalidades cromosómicas CLONES Enfermedades ADNc ADNg Familias Ligamiento Híbridos celulares FISH Clones contiguos etc....
Proyecto del Genoma Humano <ul><li>Se hizo en centros con capacidad industrial de secuenciar: </li></ul><ul><li>Wellcome T...
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Proyecto del Genoma Humano <ul><li>Se desarrollaron grandes bases de datos de acceso gratuito por Internet, para los datos...
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Proyecto del Genoma Humano <ul><li>se necesitaron más de 10 años, más de 1.000 científicos y aproximadamente 2.000 millone...
Beneficio vrs riesgos <ul><li>Como cualquier conocimiento científico o avance tecnológico,  éste puede traernos gran canti...
Temores <ul><li>Los ciéntificos y el público en general han manifestado preocupaciones: el posible irrespeto a la dignidad...
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Desafíos <ul><li>Existen aspectos éticos que están en discusión y que  atañen a toda la sociedad,  se pueden señalar: el u...
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    1. 1. ADN Recombinante e Ingieniería Genética Capítulo 16
    2. 2. Hipercolesterolemia Familiar <ul><li>Un gen codifica una proteina que sirve como receptor celular para LDL </li></ul><ul><li>Dos alelos normales para el gen mantienen bajos los niveles sanguíneos de LDLs. </li></ul><ul><li>Dos alelos mutados producen niveles de colesterol anormalmente altos y enfermedad del corazón. </li></ul>
    3. 3. Ejemplo de Terapia Génica <ul><li>Mujer con hipercolesterolemia familiar </li></ul><ul><li>Se le removió parte de su hígado </li></ul><ul><li>Se utilizó un virus para insertar un gen normal para el receptor de LDL en las células del hígado cultivadas en el laboratorio </li></ul><ul><li>Las células modificadas del hígado se pusieron de regreso en la paciente </li></ul>
    4. 4. Resultados de la terapia génica <ul><li>Las células modificadas vivieron en el hígado de la mujer </li></ul><ul><li>Los niveles sanguíneos de LDLs bajaron en un 20% </li></ul><ul><li>No presentó evidencias de aterosclerosis </li></ul><ul><li>Los niveles de colesterol permanecieron altos </li></ul><ul><li>Falta todavía saber si el procedimiento prolongará su vida. </li></ul>
    5. 5. Cambios Genéticos <ul><li>Los humanos han estado cambiando la genética de otras especies por miles de años </li></ul><ul><ul><li>seleccion artificial de plantas y animales </li></ul></ul><ul><li>Los procesos naturales también han trabajado </li></ul><ul><ul><li>Mutaciones, crossing over </li></ul></ul>
    6. 6. Ingieniería Genética <ul><li>Los genes son aislados, modificados, e insertados dentro de un organismo </li></ul><ul><li>Es posible gracias a la tecnología del ADN recombinante </li></ul><ul><ul><li>Corte del ADN y recombinación de piezas </li></ul></ul><ul><ul><li>Las piezas modificadas se pueden amplificar </li></ul></ul>
    7. 7. Discubriendo las Enzimas de restricción <ul><li>Hamilton Smith estaba estudiando la forma en que la bacteria Haemophilus influenzae se defiende del ataque de los virus bacteriófagos </li></ul><ul><li>Descubrió que la bacteria tiene una enzima que corta el ADN viral </li></ul>
    8. 8. Especificidad de los cortes <ul><li>Las enzimas de restricción cortan el ADN en una secuencia específica </li></ul><ul><li>El número de cortes hecho en el ADN dependerá del número de veces en que la secuencia de reconocimiento existe en ese genoma </li></ul>
    9. 9. Preparando ADN Recombinante 5’ 3’ G C T T A A A A T T C G G A A T T C C T T A A G 3’ 5’ one DNA fragment another DNA fragment 3’ 5’ In-text figure Page 254
    10. 10. nick 5’ 3’ 3’ 5’ G A A T T C C T T A A G nick G A A T T C C T T A A G DNA ligase action In-text figure Page 254
    11. 11. Usando Plásmidos <ul><li>Un plásmido es un pequeño cromosoma circular de ADN bacteriano </li></ul><ul><li>ADN extraño puede ser insertado dentro de un plásmido </li></ul><ul><ul><li>Se forman plásmidos recombinantes </li></ul></ul><ul><ul><li>Los plásmidos pueden servir como vectores de clonación </li></ul></ul><ul><ul><li>Pueden enviar ADN a otra célula </li></ul></ul>
    12. 12. DNA fragments + enzymes recombinant plasmids host cells containing recombinant plasmids Figure 16.4 Page 255
    13. 13. ¿Podría escapar del laboratorio una bacteria genéticamente modificada? <ul><li>Las bacterias genéticamente modificadas son diseñadas para que no puedan sobrevivir fuera del laboratorio </li></ul><ul><li>Si se liberan al medio ambiente mueren, son dependientes de las condiciones del laboratorio. </li></ul>
    14. 14. Preparando ADNc mRNA transcript mRNA–cDNA hybrid single-stranded cDNA double-stranded cDNA Figure 16.5 Page 255
    15. 15. Amplificando ADN <ul><li>In vivo: Los fragmentos pueden ser insertados dentro de microorganismos de crecimiento rápido </li></ul><ul><li>In vitro: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) </li></ul>
    16. 16. Reacción en cadena de la Polimerasa <ul><li>Se calienta la secuencia que se desea copiar </li></ul><ul><li>Se agregan los iniciadores o primers, los cuales reconocen su secuencia complementaria y se unen a ella </li></ul><ul><li>La ADN polimerasa usa nucleótidos para crear la hebra complementaria. </li></ul><ul><li>Se obtienen miles de copias del fragmento deseado. </li></ul>
    17. 17. Polymerase Chain Reaction Double-stranded DNA to copy Figure 16.6 Page 256 Stepped Art DNA heated to 90°– 94°C Primers added to base-pair with ends Mixture cooled; base-pairing of primers and ends of DNA strands DNA polymerases assemble new DNA strands
    18. 18. Polymerase Chain Reaction Figure 16.6 Page 256 Stepped Art Mixture heated again; makes all DNA fragments unwind Mixture cooled; base-pairing between primers and ends of single DNA strands DNA polymerase action again doubles number of identical DNA fragments
    19. 19. Huellas genéticas o DNA Fingerprints <ul><li>Patron de bandas único que se obtiene después de una electroforesis del genoma previamente cortado con alguna enzima de restricción. </li></ul><ul><li>Se heredan de padres a hijos de una forma mendeliana </li></ul>
    20. 20. Repeticiones en Tandem <ul><li>Cortas regiones de ADN que difieren sustancialmente entre las personas </li></ul><ul><li>Existen muchos sitios del genoma donde existen repeticiones en tandem </li></ul><ul><li>Cada persona es portadora de una única combinación de la cantidad de repeticiones. </li></ul>
    21. 21. RFLPs ( R estriction f ragment l ength p olymorphisms) <ul><li>Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción </li></ul><ul><li>El ADN de regiones con repeticiones en tandem se corta con enzimas de restricción </li></ul><ul><li>Debido a la variación en la cantidad de ADN repetido, los fragmentos de restricción varían en tamaño </li></ul><ul><li>La variación se detecta por una electroforesis </li></ul>
    22. 23. Electroforesis <ul><li>El ADN se pone en un “pozo” en uno de los extremos del gel. </li></ul><ul><li>Se aplica una corriente al gel. </li></ul><ul><li>Las moléculas de ADN están cargadas negativamente y se mueven hacia el extremo positivo </li></ul><ul><li>Las moléculas pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes. </li></ul>
    23. 24. Analizando huellas genéticas <ul><li>El ADN se hace visible mediante el marcaje con un isótopo de una sonda de ADN que se hibridiza. El patrón de bandas se usa para: </li></ul><ul><ul><li>Identificar o rechazar al sospechoso de un crimen </li></ul></ul><ul><ul><li>Identificar cuerpos </li></ul></ul><ul><ul><li>Determinar paternidad </li></ul></ul>
    24. 26. Huellas genéticas con sondas multilocus
    25. 27. Secuenciación de Genomas <ul><li>1995 – Primera Secuencia en ser determinada: bacteria Haemophilus influenzae . </li></ul><ul><li>Actualmente se usa la secuenciación automática como método principal </li></ul><ul><li>La secuencia “borrador” del genoma humano completo se determinó de esta forma. </li></ul>
    26. 28. Nucleotidos para secuenciación <ul><li>Nucleótidos (A, T, C, G) </li></ul><ul><li>Versiones modificadas de estos nucleótidos: </li></ul><ul><ul><li>Marcados para emitir fluorescencia </li></ul></ul><ul><ul><li>Estructuralmente diferentes para que detengan la síntesis cuando ellos se unen a la molécula. </li></ul></ul>
    27. 29. Mezcla para la reacción <ul><li>Copias del ADN a ser secuanciado </li></ul><ul><li>Primer </li></ul><ul><li>DNA polimerasa </li></ul><ul><li>Nucleotides </li></ul><ul><li>Nucleótidos Modificados </li></ul>
    28. 30. Procedimiento de la reacción <ul><li>Se sintetiza una hebra complementaria con los nucleótidos </li></ul><ul><li>Cuando se incorpora un nucleótido modificado, se detiene la síntesis </li></ul><ul><li>Como resultado se obtienen millones de copias de longitud variable </li></ul>
    29. 31. Obtención de la secuencia T C C A T G G A C C T C C A T G G A C T C C A T G G A T C C A T G G T C C A T G T C C A T T C C A T C C T C T electrophoresis gel one of the many fragments of DNA migrating through the gel one of the DNA fragments passing through a laser beam after moving through the gel T C C A T G G A C C A <ul><li>ADN se pone en un gel </li></ul><ul><li>Fragmentos migran por el gel en orden de tamaños; pasan a través de un rayo laser. El color de la fluorescencia de cada fragmento se almacena en la computadora y se puede imprimir . </li></ul>Figure 16.8 Page 258
    30. 32. Bibliotecas de genes <ul><li>Bacterias que contienen diferentes fragmentos de ADNs clonados : </li></ul><ul><ul><li>Bibliotecas Genomicas </li></ul></ul><ul><ul><li>Bibliotecas de ADNs copias </li></ul></ul>
    31. 33. Usando una sonda para encontrar un gen <ul><li>Usted desea saber cual bacteria de todas en una librería contiene un gen específico </li></ul><ul><li>Se necesita una sonda del gen </li></ul><ul><ul><li>Una secuencia de ADN del gen, marcada con radio-isótopo que reconocerá su secuencia complementaria en la librería. </li></ul></ul>
    32. 34. Uso de una sonda Colonies on plate Cells adhere to filter Cells are lysed; DNA sticks to filter Probe is added Location where probe binds forms dark spot on film, indicates colony with gene Figure 16.9 Page 259
    33. 35. Ingieniería de proteinas <ul><li>Las bacterias pueden ser usadas para obtener miles o millones de copias de moléculas de una proteina de interés médico </li></ul><ul><ul><li>Insulina, interferon, Factores de coagulación de la sangre </li></ul></ul><ul><ul><li>Vacunas </li></ul></ul>
    34. 36. Limpieza del ambiente Bio-remediación <ul><li>Existen microorganismos que normalmente digieren basura orgánica y reciclan materiales </li></ul><ul><li>Algunos pueden ser usados por la ingieniería para digerir contaminantes o grandas cantidades de materiales peligrosos. </li></ul>
    35. 37. El plásmido Ti <ul><li>Investigadores </li></ul><ul><li>reemplazan genes que causan tumores por genes beneficiosos </li></ul><ul><li>Los plásmidos transfieren estos genes a celulas vegetales en cultivo </li></ul>foreign gene in plasmid plant cell Figure 16.11 Page 261
    36. 38. Ingieniería de plantas <ul><li>Plantas de algodón pueden hacerse resistentes a hierbicidas </li></ul><ul><li>Plantas de aspen pueden producir menos lignina y más celulosa </li></ul><ul><li>Plantas de tabaco pueden producir proteínas humanas </li></ul><ul><li>Células de la planta de mostaza pueden producir plástico biodegradable. </li></ul>
    37. 39. Primeros mamíferos manipulados genéticamente <ul><li>Usaron ratones deficientes en hormona del crecimiento (enanos) </li></ul><ul><li>Los huevos fertilizados de ratón fueron inyectados con el gen de rata para la hormona del crecimiento </li></ul><ul><li>Gen se integróal ADN del ratón </li></ul><ul><li>Ratones modificados fueron 1,5 veces mas grandes que sus hermanos no modificados </li></ul>
    38. 40. Clonando a Dolly <ul><li>1997 - Una oveja fué clonada a partir de una célula de adulto. </li></ul><ul><ul><li>Un nucleo de una célula de la glándula mamaria fué insertado en un ovulo sin núcleo </li></ul></ul><ul><ul><li>El embrion fué implantado en una madre sustituta </li></ul></ul><ul><ul><li>La oveja obtenida es una copia genética del animal del cual se obtuvieron las celulas de las glándulas mamarias </li></ul></ul>
    39. 41. Diseñando Ganado <ul><li>Embriones de ganado vacuno se pueden hacer crecer en cultivo y modificados genéticamente para </li></ul><ul><li>- crear resistencia a enfermedades </li></ul><ul><ul><li>Hacerlos producir albúmina humana u otras proteinas de uso médico. </li></ul></ul>
    40. 42. Proyecto del Genoma Humano, U.S.A. Human Genome Organization HUGO, 1988 <ul><li>1990 planeado para 15 años: </li></ul><ul><li>Mapear y secuenciar el genoma humano. </li></ul><ul><li>Desarrollar tecnologías y métodos. </li></ul><ul><li>Mapear y secuenciar genes de 5 organismos modelos: E.coli, Saccharomyses cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster y el ratón. </li></ul><ul><li>Estudiar las implicaciones éticas y legales del proyecto (Subproyecto ELSI). </li></ul>
    41. 43. Anormalidades cromosómicas CLONES Enfermedades ADNc ADNg Familias Ligamiento Híbridos celulares FISH Clones contiguos etc. MAPA DEL GENOMA HUMANO Mapa físico Mapa genético Secuenciación Identificación de genes Mapa RATON P o l i m o r f i s m o s
    42. 44. Proyecto del Genoma Humano <ul><li>Se hizo en centros con capacidad industrial de secuenciar: </li></ul><ul><li>Wellcome Trust Sanger Institute en Reino Unido. </li></ul><ul><li>The Whitehead Institute y el Institute of Technology of Massachussetts. </li></ul><ul><li>Washington University </li></ul><ul><li>DoE Joint Genome Institute. </li></ul><ul><li>Baylor College of Medicine </li></ul><ul><li>Y una red de pequeños laboratorios en todo el mundo </li></ul>
    43. 45. 08_01.jpg Proyecto Genoma Humano
    44. 46. Proyecto del Genoma Humano <ul><li>Se desarrollaron grandes bases de datos de acceso gratuito por Internet, para los datos obtenidos con fondos públicos: </li></ul><ul><li>Datos de mapeo y secuenciación de ADN y proteínas. Ej Genome database (GDB). Estos pueden ser accesados y analizados desde cualquier parte del mundo. </li></ul><ul><li>Datos de interés local obtenidos por cada laboratorio. </li></ul>
    45. 47. Fechas importantes en el Mapeo y Secuenciación del Genoma Humano <ul><li>1977: Fred Sanger: metodo de secuenciación usando dideoxinucleótidos. </li></ul><ul><li>1980: Bolstein et al propuso mapear con RFLPs </li></ul><ul><li>1981: Sanger publicó la secuencia mitocondrial completa </li></ul><ul><li>1987: El departamento de energía de los Estados Unidos ve la necesidad de hacer el proyecto del genoma humano </li></ul><ul><li>1988: Se crea el Centro Nacional para el estudio del Genoma Humano adscrito a los Institutos Nacionales de Salud. USA. </li></ul><ul><li>1990: lanzamiento oficial del proyecto </li></ul><ul><li>2001: Publicación del primer borrador de la secuencia del genoma humano (90%), por parte de Celera Genomics. </li></ul><ul><li>2003: Secuencia completa del genoma Humano </li></ul>
    46. 48. Proyecto del Genoma Humano <ul><li>se necesitaron más de 10 años, más de 1.000 científicos y aproximadamente 2.000 millones de dólares, de los cuales solamente entre un 3-5% se han destinado al subproyecto ELSI, el cual financia investigaciones sobre los aspectos éticos, legales, y sociales asociados al nuevo conocimiento. </li></ul>
    47. 49. Beneficio vrs riesgos <ul><li>Como cualquier conocimiento científico o avance tecnológico, éste puede traernos gran cantidad de beneficios, si se maneja con una visión humanista y solidaria, obedeciendo valores fundamentales como el respeto a la vida, a la privacidad, el derecho a la salud y de aspirar cada día a una mejor calidad de vida; y el derecho de proteger la identidad genética. </li></ul><ul><li>Por el contrario si es usado en forma inescrupulosa, con fines comerciales o raciales podría conducirnos a una sociedad cada día más deshumanizada. </li></ul>
    48. 50. Temores <ul><li>Los ciéntificos y el público en general han manifestado preocupaciones: el posible irrespeto a la dignidad humana, la discriminación contra personas con desbalances genéticos, o portadoras de alguna mutación que les confiere un riesgo mayor de llegar a desarrollar alguna enfermedad degenerativa, incapacitante o que les acorte la vida. Esta discriminación se podría traducir en </li></ul><ul><li>1. Pago de mayores primas en seguros de salud o total ausencia de cobertura, en los países donde la salud es asegurada por empresas privadas (afortunadamente, todavía no es el caso de Costa Rica). </li></ul>
    49. 51. Temores <ul><li>2. Obstáculo para obtener un trabajo, etc. </li></ul><ul><li>Los expertos del subproyecto ELSI recomendaron legislar urgentemente con el fin de proteger la información genética de los individuos porque los temores mencionados tienen fundamento, y porque los incentivos económicos para cometer discriminaciones aumentarán, conforme aumente la investigación genética y bajen los costos del tipeo genético de los individuos. Por lo que se deben penalizar las acciones de discriminación. </li></ul>
    50. 52. Desafíos <ul><li>Existen aspectos éticos que están en discusión y que atañen a toda la sociedad, se pueden señalar: el uso de la información, la privacía y confidencialidad, quién es el dueño de la información, el impacto sicológico y la estigmatización social, el tamizaje genético individual (por pertenecer a una familia con historia de enfermedad genética) o poblacional (recién nacidos, prematrimonial y ocupacional), aspectos reproductivos, derecho a la reproducción, terapia génica, intervenciones genéticas, disponibilidad del uso de las tecnologías genéticas, acceso y financiamiento, aspectos clínicos, comercialización,. implicaciones filosóficas y conceptuales. </li></ul>

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