El documento describe varios factores que afectan la solubilidad de las proteínas, como el buffer, la fuerza iónica, el pH y la temperatura. Explica métodos para medir la solubilidad de proteínas como Kjeldahl, absorción a 280 nm, 205 nm, ensayos de Lowry, Biuret y BCA. Finalmente, recomienda considerar estas variables al diseñar un protocolo para determinar la solubilidad de una proteína en particular.
2. Solubilidad de proteínas
Buffer: Ofrece un medio estable para la solubilidad.
Se utiliza la menor concentración posible para no afectar a
fuerza iónica del medio.
Proteínas con fuertes interacciones hidrofobicas necesitan
aumentar la fuerza iónica del buffer (NaCl o KCl).
Agentes caotrópicos: Se utilizan para disminuir las
interacciones prot-prot de los agregados.
3. Ph: Algunas proteínas necesitan el agregado de Ac. o bases
fuertes para su solubilidad
Hay que tener en cuenta que hacia extremos de Ph se
producen desnaturalización de las proteínas.
Temperatura: En general la solubilidad decrece al
disminuir la temperatura.
Se utiliza un amplio rango de temp. en los procesos de
solubilización de proteínas (4°c hasta 60°c).
4. Clarificación.
Proceso por el cual se elimina la proteína que no ha
sido solubilizada.
El mejor método consiste en la Sedimentación
Mediante centrifugación.
Vg= D2[(d1-d2)/18µ]g
D: diámetro de la partícula
d1 y d2: densidades de la partícula y del
medio respectivamente
µ: viscosidad del medio
g: aceleración de la graved.
5. Generalmente el factor limitante en una
centrifugación es el tamaño de las partículas o de los
agregados formados.
Se utilizan distintas vel. de sedimentación a
diferentes tiempos para sedimentar las distintas
proteínas.
Se busca una vel. que separe en 15-30 min.
6. MECANISMOS DE REACCIÓN DEL
MÉTODO
RANGO DE SENSIBILIDAD
SUSTANCIAS DE INTERFERENCIA
Métodos para medir solubilidad
7. La elección del método
La cantidad de proteína disponible a ensayar
La concentración de proteína
Especificidad del ensayo
Facilidad y fiabilidad, exactitud y precisión para
llevar a cabo el ensayo
8. Medición del nitrógeno proteico
Método de Kjeldahl
El método se basa en la determinación de la cantidad de
Nitrógeno orgánico contenido
Proteína + H2SO4 CO2 + (NH4)2SO4 + SO2
Se requieren 2 g de proteína. Para 10-40 mg se
miden con el método micro-Kjeldahl.
No detecta enlaces N-O y N-N.
Interfieren ácidos nucleicos y otros componentes
orgánicos con N.
Separar precipitando con TCA
9. Medición a 280 nm (uv)
Presencia de aás. aromáticos hacen que las proteínas
tengan un máx. de Abs a 280 nm.
No es destructivo, es rápido, alta sensibilidad
Ley de Lambert-Beer:
A = E280 . l . C
10. El valor de E280 depende de la cantidad de aás.
aromáticos que contiene la proteína. Los valores
están entre 0,4-1,5
Se requieren alrededor de 0,1-2,0 mg de proteína
Interferencias: Ácidos nucleicos y nucleótidos
(anillos de purina y pirimidina)
Corrección de la ecuación, midiendo a 260nm.
Prot (mg/ml)= 1,55 A280 – 0,76 A260
Minimizar la absorción de los buffers
Blancos de medida
11. ABSORBANCIA A UV-lejano (205nm)
Las uniones peptídicas absorben a 191-194 nm
Como todas las proteínas tienen estas uniones, el
valor de E205 es el mismo (E=31)
Se hace a 205nm porque a 191-194 absorbe el
oxígeno, interfiere en la medida.
Mide en el rango de 0,01-0,05 mg/ml prot.
Cubetas limpias y buffer que minimicen la A.
Se agrega Brij-35
Concentración (mg/ml) = 31 . A205
12. Para corregir la absorción del triptófano y la tirosina a
205nm
E205 = 27 + 120 (A280 / A205)
Los ácidos nucleicos contribuyen poco en la A205.
Sólo las proteínas puras pueden dar una medida exacta.
Es un método mas sensible que A280 , los enlaces
peptídicos son constantes.
13. Ensayo de lowry
Combina la reacción de Biuret con la reducción del
reactivo de Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y
fosfotúngstico) por la oxidación de tirosina y en
menor medida triptófano, cisteína, cistina de las
cadenas polipeptídicas
Los iones Cu+2 ayudan a exponer los residuos de
tirosina y en la reacción redox.
Varias sustancias interfieren (desventaja), como
fenoles, agentes buffer, timol.
La intensidad depende de la cantidad de Tyr
14. El reactivo de Folin se descompone rápido.
La curva estándar se hace en un rango de 0-100µg.
15. Biuret
Una solución diluida de sulfato cúprico en tartrato
fuertemente alcalino es adicionado a una solución
proteica de concentración de 1-6 mg/ml. La
reacción entre el Cu+2 y los nitrógenos de enlaces
peptídicos
adyacentes genera
un complejo de color
azul-violeta que
absorbe a 540-560 nm.
16. La reacción no depende de la composición específica
de aminoácidos.
Algunos buffers (ej: Tris) interfieren con el análisis.
El amoníaco proveniente de la precipitación con
sulfato de amonio debe ser removido ya que
interfiere con la medida.
17. Método de BCA
El ácido bicinconinico en forma de sal de
sodio es:
Soluble en agua
Estable
Altamente especifico y sensible al Cu+ en
solución alcalina.
Sensibilidad:
0.02-1.0mg/ml (estándar)
0.5-10 µg/ml (micro-BCA)
18. El Cu+ producto de la reacción de Biuret forma un complejo
con dos moléculas de BCA color púrpura; el cual exhibe
absorbancia a 562nm.
Reactivos quelantes como EDTA interfieren con el ensayo, de
modo que para eliminarlos la proteína se debe precipitar con
TCA o acetona.
19. Bradford
El colorante Coomassie
Brilliant Blue forma
fuertes complejos no
covalentes con las
proteínas a pH 1. Esta
unión desplaza el máximo
de absorción del colorante
de 465nm (rojo) a 595 nm
(azul) debido a la
estabilizacion de la forma
anionica del colorante.
20. La sensibilidad del ensayo puede mejorarse leyendo la
diferencia entre el colorante-proteina (595 nm) y
colorante libre (465nm).
El colorante se une principalmente a aa basicos y
aromáticos.
Tolera altas concentraciones de sal (1 M KCl, 5 M
NaCl), pero es sensible al EDTA, glicerol, SDS, β-
mercaptoetanol.
Para medidas cuantitativas se aconseja comparar los
resultados con los obtenidos por otro método.
21. Consideraciones generales
Estandars proteicos: la mayoría de los métodos
utilizan una curva patrón.
En la preparación de una proteína estándar se
aconseja usar proteínas que han sido dializadas y
liofilizadas. También podrían usarse estandars
altamente purificados disponibles comercialmente.
En general lo mejor es utilizar como proteína
estándar la misma que se quiere determinar
22. Remoción de compuestos que interfieren:
ya que para pruebas de solubilidad se
recomienda que la proteína sea lo más pura
posible.
Se debe: llevar al pH del ensayo, precipitar
contaminantes (TCA, acetona, ácido) y
centrifugar, luego resuspender el pellet. También
podemos dializar y ultrafiltrar; o usar soportes
DEAE cellulose de afinidad.
23. Determinación de humedad: Todas las
determinaciones de solubilidad están fundadas
sobre muestras de proteínas desecadas.
24. Protocolo
Al momento de realizar un protocolo para
determinar la solubilidad de una proteína hay que
tener en cuenta varios factores.
Existe una estrecha relación entre la estabilidad de
una proteína y su solubilidad. Por lo cual,
normalmente simulando su entorno natural
obtendremos la mayor solubilidad.
25. ¿Qué factores debemos tener en cuenta?
Definimos que la solubilidad de una proteína era función
de T, μ, D, [ ], pH, y otros componentes, entonces
debemos manejar estas variables al momento de
determinar la solubilidad.
[ ] se recomienda utilizar concentraciones teóricas finales
de entre 1-10mg/ml a no ser que se necesite determinar
algún tipo de concentración especifica.
μ, existen 4 tipos de proteínas distintas según su
solubilidad
Albuminas( salt-free o baja fuerza iónica)
Globulinas( moderada fuerza iónica 0,1-0,15M)
Prolaminas(fuerza iónica 0,3-0,6M y etanol 50-90%)
Glutelinas(alta fuerza iónica 0,5-1M)
26. pH, la solubilidad de una proteína depende
fuertemente del pH del medio. Para mantener este
pH, es necesario utilizar distintos sistemas Buffer;
también hay que tener en cuenta que las sales de
estos sistemas pueden interactuar con la proteína de
manera benéfica o no. Otra manera de mantener el
pH es adicionando HCl o NaOH, monitoreando con
un pHmetro durante 30min.
27. Luego de tener determinadas estas variables, es
importante definir de que manera se va a rehidratar
la proteína.
Al polvo, se le agregan pequeñas cantidades de solvente, agitando
de manera lenta, lo cual evita la inclusión de aire y formación de
espumas lo que lleva a desnaturalización.
Una vez agregado todo el solvente, se incuba a 24°C durante
30min, para asegurarnos que haya llegado al equilibrio.
28. Una vez realizada la suspensión, se debe clarificar la
solución y separar las fases.
Para esto, se coloca la suspensión en un tubo adecuado para una
centrífuga y, se centrifuga durante un tiempo determinado y a una
cierta fuerza g, las cuales dependerán del tamaño y densidad de
los insolubles. En la mayoría de los casos 16000g y 30min es lo
adecuado, sino se pueden probar distintas g 16000, 20000 y
30000 durante 30 min y comparar los resultados.
En esta etapa hay que tener especial cuidado en no tocas el pellet
durante la separación del sobrenadante.
29. Por último, se determina la concentración utilizando
micro-Kjeldhal, en el cual determinamos la
concentración como nitrógeno soluble o a través del
método espectrofotométrico que mejor se
adecue(Lowry, Bradford, BCA, 280nm, 205nm).