5. La cuantificación de la actividad enzimática de una enzima habitualmente se efectúa a través
de la determinación de la velocidad de consumo de sustrato, aparición de producto, o en el
caso de que la enzima posea cofactor disociable, variación en alguna propiedad del cofactor.
6. Cuantificación de la actividad enzimática:
La cuantificación de la actividad enzimática de una enzima habitualmente se efectúa a través de
la determinación de la velocidad de consumo de sustrato, aparición de producto, o en el caso de
que la enzima posea cofactor disociable, variación en alguna propiedad del cofactor.
7. Fuentes de enzimas:
Las enzimas industriales pueden ser de
origen animal, vegetal o microbiano.
Entre las enzimas de origen animal, las
más conocidas son las proteasas (cuajo,
pepsina, etc.) y el complejo pancreatina
(amilasas, proteasas y lipasas).
Tanto las enzimas de origen vegetal y
animal tiene la limitante de la poca
versatilidad en relación en el pH y
temperatura óptima de acción.
Cuando se requiere enzimas capaces de
tener rendimiento óptimo a
temperaturas y pH variados, es
necesario recurrir a las enzimas de
origen microbiano. Dada la gran
diversidad de microorganismos capaces
de producirlas siempre existirá una que
cumpla con los requisitos exigidos.
8. Determinación de actividad pectinesterasa:
Pectina: Polisacárido lineal que contiene de 200 a 1000 unidades de galactosa, unidas por
enlaces glucosídicos β 1→4. Peso Molecular: 50 kDa a 150 kDa. El principal constituyente es el
ácido D-galacturónico.
El ácido poligalacturónico está parcialmente esterificado con grupos metilo y los grupos de ácido
libre pueden estar parcial o totalmente neutralizados con sodio, potasio o amonio. La proporción
de grupos ácidos esterificados a grupos ácidos totales es denominada grado de esterificación
(DE). Este valor influye especialmente en las propiedades de solubilidad y de formación de
geles. El DE de 50 % divide comercialmente a las pectinas en de alto éster o metoxilo (HM) y
bajo éster (LM):
Mayor de 50 % pectinas de alto éster (HM)
Menor de 50 % pectinas de bajo éster (LM)
70-85 % Gelificación rápida
44-65 % Gelificación lenta
Las pectinas HM necesitan de un mínimo
de sólidos solubles y un pH alrededor de 3
para formar geles. Las pectinas LM
requieren de la presencia de cationes
calcio u otros cationes divalentes para
gelificar no necesitan azúcar y/o ácido.
9. Pectinesterasa. La pectinesterasa es una isoenzima, que se encuentra en frutas, vegetales,
hongos y ciertas bacterias asociadas a vegetales. Hidroliza el enlace éster metoxilo de la
pectina liberando metanol e iones hidrógeno, con la consecuente acidificación del medio.
Este cambio se utiliza para efectuar la determinación de su actividad, ya sea mediante cambio
de coloración de ciertos indicadores (azul de bromotimol) o titulación de los iones hidrógeno
liberado.
La enzima requiere ión sodio para su activación y es inhibida por el producto ácido péctico
(8% de metoxilo) y ácido pectínico (2% de metoxilo).
Su pH óptimo es cercano a 4,5 para las de origen fúngico (aspergillus) y de 7,5 para la de
cáscara de naranja. Su temperatura óptima es de 30-35 ºC dependiendo de la fuente. Es
inactivada por el proceso de escaldado, pero algunas variantes isoenzimáticas presentan cierto
grado de termoresistencia y regeneración.
10. 1. Actividades
4.1. Preparación de soluciones:
a) Mezclar la cantidad deseada (de pectina pura de alto metoxilo 0,25; 0,5; 0,75; 1,0
% pH 4,2) con 5.0 ml de alcohol etílico en un vaso precipitado.
b) Adicionar 80 ml de agua destilada, mezclando con agitador magnético.
c) Después de la disolución completa de todos los componentes (30 minutos a 1 hora), dejar la
solución a 0ºC, hasta su utilización.
d) En el momento del ensayo calentar hasta 25º C y llevar a pH 4,2 con NaOH 0,02 N.
e) Aforar a 100 ml, la solución se conserva por 2 o 3 días. Se puede adicionar fenol
como conservante.
11. 4.2. Cinética enzimática a diferentes concentraciones de sustrato:
a) Agregar a un vaso precipitado de 250 ml:
25 ml de solución de pectina
5 ml de NaCl 2N
15 ml de agua destilada
b) Llevar con agitación a una temperatura de 25ºC por 10 minutos.
c) agregar con agitación, 50 µl de la solución de enzima. Registrara este tiempo como cero en el
cronometro y ajustar a pH 4.3 con la solución de NaOH 0,02 N.
d) Mantener el pH 4,3 de la solución agregando regularmente NaOH 0,02 N.
e) Registrar en una tabla el volumen o miliequivalentes de NaOH acumulados cada 2 minutos. La
reacción se considera terminada luego de 32 minutos.
12. Volumen de NaOH 0,02N
tiempo Me 0,25% Me 0,5% Me 0,75% Me 1%
0 0 0 0 0
5
10
15
20
25
30
14. Volumen de NaOH
0,2 M (ml)
Concentracion
(mmoles)
Tiempo Me 0,25% Me 0,25%
0 0 0
5 3 0,6
10 8 1,6
15 15 3
20
25
30 0,2M = x moles de soluto/0,003 L
X = 0,0006 moles
X = 0,6 mmoles
15. g) Para cada ensayo con diferente concentración de pectina, dibujar la gráfica volumen
NaOH 0,02 N gastado versus tiempo en minutos.
Concentracion
NaOH mM
Tiempo (min)
= Vo
h) A partir de cada grafica obtener por método estadístico el valor de la pendiente cuando
t___0 (recta trazada hasta el origen).
ME 0,25%
16. i) Obtenidos los valores de V0, dibujar la relación V0 versus concentración de sustrato, la
cual corresponderá a la grafica de Michaelis-Menten.
j) Graficar los valores de 1/Vo versus 1/S (curva o grafica de Lineweaver-Burk).
k) De este ultimo grafico, determinar Vmax y Km. Km se puede calcular a partir del valor
del intercepto de la recta en el eje X, igual a -1/Km; Vmax se calcula del valor del intercepto
en Y, igual a 1/Vmax o del valor de la pendiente, Km/Vmax.
Diagrama de Lineweaver-Burk
17. 4.3. Calculo de la actividad de la enzima:
La actividad de la pectinesterasa, luego de 30 minutos se puede expresar como: Nº de mg de
metoxilos se separados por 1.0 ml de solución de enzima.
Actividad = Volumen NaOH (ml) x Molaridad x PM
Volumen solución enzima (ml) x 30 minutos
