1. PURIFICACIÓN Y SEPARACIÓN DE ENZIMAS
INTRODUCCIÓN
Las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de
células que además poseen otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares,
complejos con otras enzimas, proteínas inertes, ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para
estudiar una enzima en particular, es necesario realizar un proceso de purificación.
Al purificar una enzima o una proteína se debe tener claramente definida la actividad biológica que
la caracteriza y sus condiciones óptimas de ensayo, tales como pH y temperatura.
Entre las generalidades sobre purificación de proteínas se tiene:
 El método de purificación debe diseñarse desde un principio teniendo en cuenta la
cantidad de proteína que se requiere.
 Hay etapas de purificación que se pueden aumentar de escala fácilmente y otras en que no
es posible hacerlo.
 El grado de pureza necesario dependerá del uso que se va a dar a la proteína. Para usos en
investigación, la escala es reducida y es más importante la pureza que el rendimiento. Para
usos terapéuticos la escala es mayor y la pureza requerida es máxima. Para usos
industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajo costo y pureza menor.
 Si el interés está en la proteína y no importa el organismo de origen, conviene buscar una
fuente fácil de obtener, barata, que contenga esa proteína en abundancia. Si existe la
posibilidad de partir de organismos enteros o de células en cultivo, esto último es en
general preferible. Lo óptimo es producir la proteína por métodos de DNA recombinante.
 Dependiendo de la finalidad, la proteína debe ser obtenida en estado nativo o puede estar
desnaturalizada. Para actividad biológica, debe estar nativa; para determinar estructura
primaria, puede estar desnaturalizada.
El estudio completo de una enzima involucra la investigación de sus propiedades características,
como:
 Propiedades fisicoquímicas: coeficientes de sedimentación y difusión; peso molecular;
forma; punto isoeléctrico; estabilidad frente al calor, pH y oxidación; reversibilidad de la
reacción y constante de equilibrio; calor, energía libre y entropía de la combinación
enzima-sustrato y de su conversión en productos; medida de las constantes de velocidad de
la reacción, efecto de activadores e inhibidores.
 Estructura: composición en aminoácidos, secuencia, presencia de grupos prostéticos,
grupos sulfhidrilos, etc.

2.  Propiedades enzimáticas: naturaleza de la reacción, coenzimas, especificidad.
 Propiedades biológicas: significado en el metabolismo, acoplamiento con otras enzimas,
localización, genética, efectos de su deficiencia, inmunología.
Entre los aspectos técnicos del trabajo con enzimas depende del cuidado con que se eviten las
condiciones en las cuales son inestables.
 Deben evitarse altas temperaturas y acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento y
la purificación conviene, trabajar entre 0 y 4 o
C y evitar pH mayor que 9 o menor que 5.
 Debe evitarse la formación de espuma, ya que la misma es indicador de desnaturalización
proteica.
 Los solventes orgánicos inactivan muchas enzimas a temperatura ambiente; de modo que
los fraccionamientos con los mismos deben llevarse a cabo a baja temperatura y ésta no
debe elevarse hasta que el solvente se haya eliminado o diluido a concentraciones inocuas.
Debe tomarse precauciones en lo que se refiere a las condiciones de la reacción:
 Elegir pH y temperatura en las zonas de mayor estabilidad de la enzima.
 Llevar a cabo la reacción a temperatura constante.
 Elegir un buffer adecuado para evitar cambios de pH.
 Evitar la introducción de trazas de otras enzimas (por ejemplo saliva).
 Elegir una cantidad de enzima adecuada para obtener variaciones apropiadas de la
magnitud a medir.
Para distinguir la individualidad de la enzima y su grado de purificación se recurre a los siguientes
parámetros:
 Cuantificación de la proteína en mg/ml. Consiste en emplear un método colorimétrico por
el que se determina la cantidad de proteína, de tal manera que se conozca el total de mg e
proteína en la preparación y en cada una de las etapas de purificación.
 Definición de la Unidad Enzimática, como la cantidad de enzima que catalizará la
transformación de una cantidad de sustrato específico en producto bajo ciertas condiciones
definidas de temperatura y pH. Por lo tanto 1 U = 1 micromol de substrato consumido/ mg
de proteína de la preparación enzimática.
 Definición de la Actividad Específica, como los micromoles de sustrato consumido en un
minuto por un miligramo de enzima (1 micromol de substrato consumido por min.) X ml o
bien se puede expresar como la Unidad de enzima X mg de proteína (1 Unidad = 1
micromol substrato consumido/min).
 Actividad Total de la enzima expresada como los micromoles de sustrato consumido/min
en los mg totales de proteína.
 El Rendimiento se conoce como la relación entre la actividad enzimática obtenida por cada
uno de los pasos de purificación y la actividad total obtenida en la primera etapa. Se

3. obtiene al comparar porcentualmente las Actividades Totales del inicio hasta el final de la
purificación.
 El número de veces que la enzima se ha purificado es la relación entre la actividad
específica de la primera etapa de purificación con cada uno de los pasos sucesivos.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
 Conocer los métodos de purificación de enzimas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Conocer las reglas básicas de un proceso de purificación de enzimas
 Describir lo métodos de homogenización y separación de éstas.
 Describir la obtención y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa a
partir de la cepa bacterianaOligotrophacarboxidovorans (cepa OM 5)
DESARROLLO
Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos:
I. Enzimas en solución verdadera en el citoplasma. Permanecen en el sobrenadante luego
de la eliminación de los componentes particulados. La ruptura de las células en un buffer
adecuado libera tales enzimas al medio.
II. Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.). Pueden
encontrarse:
 En “solución” dentro de una membrana y pueden ser extraídas después de la
destrucción de la misma
 Asociadas a material lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solución debe disociarse
el complejo.
HOMOGENIZACIÓN
Proceso donde las células y los tejidos son lisados o rotos en fragmentos lo suficientemente
pequeños para dar lugar a una suspensión uniforme y estable llamada homogeneizado o extracto
crudo.
Formas físicas

4.  Homogenización mecánica: Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, a
veces con ayuda de abrasivos como alúmina, arena o bolitas de vidrio. Para ello, las células
son suspendidas en un solvente isotónico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o
ligeramente hipertónico junto con un buffer para mantener controlado el pH.
 Homogeneización sónica: El choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca cambios de
presión de miles de atmósferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para
bacterias y levaduras y a veces, para determinados tejidos animales (bazo, riñón o
eritrocitos). La sonicación puede alterar la estabilidad enzimática cuando las células se
rompen por este método, dicho cambio varía dependiendo de factores asociados como el
pH, temperatura, tipo de Buffer, tiempo, entre otros.
 Desintegracióntérmica: El congelamiento y descongelamiento rápidos y repetidos suelen
usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelación se forman cristales de hielo
intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las células se destruyen
osmóticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido.
Formas químicas
Se utilizan agentes que atacan la pared celular como el etanol, éter de petróleo, isopentanol, entre
otros.
 Homogeneización por deshidratación: se basa en la precipitación de proteínas por
solventes orgánicos.
Formas enzimáticas
Se utilizan enzimas capaces de hidrolizar las paredes bacterianas permitiendo la salida del
contenido intracelular; la enzima más utilizada es la lisozima , que cataliza de forma específica la
hidrólisis de enlaces β (1-4) del ácido N-acetilmuránico presentes en los mucopéptidos de las
paredes celulares bacterianas; de estas, las Gram-positivas son las que presentan mayor
sensibilidad a la lisozima, mientras que las Gram-negativas se consigue con la adición de EDTA
(ácido etilendiaminotetraacético) como agente quelante, lo que facilita su ruptura.
La elección del método de ruptura depende de:
 Naturaleza de la fuente de la enzima
 Velocidad del método de extracción
 Estabilidad del enzima
 Pureza requerida
 Costo del proceso

5. Por otro lado, es importante elegir la solución de homogeneización, puesto que será el medio al
que estará expuesta la proteína y en el que se pueden adicionar componentes para ajustar el pH, la
fuerza iónica, inhibidores de proteasas o algún estabilizador de la proteína.
MÉTODOS DE SEPARACIÓN
Para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso de
centrifugación.
Centrifugación
La centrifugación utiliza la fuerza de gravedad para separar los diferentes componentes del
homogeneizado (restos de tejido u organelos), basándose en su tamaño, forma y densidad. Después
de la centrifugación, algunas de las partículas más pesadas, que normalmente permanecían en
suspensión, sedimentan.
Cromatografía de intercambio iónico
Permite la separación de proteínas en función de su carga. Las resinas de intercambio iónico se
separan a partir de materiales insolubles que contienen grupos cargados negativamente o
positivamente que se empaquetan en columnas de cristal. Las resinas cargadas negativamente fijan
fuertemente cationes y se denominan resinas de intercambio catiónico; por el contrario, las resinas
policatiónicas unen aniones y se denominan resinas de intercambio aniónico. La elución de una
proteína dependerá de la magnitud de su carga al pH del disolvente empleado. Para facilitar la
elución cuando las interacciones entre la fase estacionaria y la muestra son muy fuertes se emplean
fases móviles de diferente pH o fuerza iónica que debiliten dichas interacciones.
Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad separa las proteínas en función de su afinidad de unión a ligandos
específicos. Así, las proteínas tienen una gran afinidad por sus sustratos, grupos prostéticos,
receptores de membrana o anticuerpos desarrollados frente a ellas. Uno de estos compuestos puede
unirse covalentemente a una resina insoluble para constituir la fase estacionaria de una
cromatografía en columna. Cuando se aplica en la columna una mezcla de proteínas, sólo aquella o
aquellas susceptibles de unirse a los grupos específicos de la resina quedarán ancladas en la fase
estacionaria, mientras que las demás proteínas de la mezcla se lavan a través de la columna.
Posteriormente se aplica un tampón adecuado que, generalmente, incluye el ligando libre y que
hace factible la elución de la proteína anclada
Cromatografía de exclusión molecular o gel-filtración

6. Permite separar las proteínas en función de su tamaño. Esta técnica se realiza en una columna que
está rellena con un gel poroso insoluble en forma de esferas, cuyos tamaños de poro son conocidos.
Las moléculas proteicas de menor tamaño penetran por los poros, por lo que el recorrido que han
de realizar a través de la disolución es mayor que el de las moléculas de gran tamaño, que no
penetran por los poros por impedimento estérico; esto hace que las moléculas de gran tamaño
eluyan antes que las de pequeño tamaño. Por lo tanto, una mezcla de proteínas se separará en
función del tamaño, primero eluirán las de mayor tamaño y en último lugar las de menor tamaño,
las proteínas de tamaños intermedios eluirán entre ambos extremos en función de su masa. Para
poder saber la masa molecular de una proteína, previamente se debe hacer un calibrado de la
columna con proteínas cuya masa molecular sea conocida, y cuyo volumen de elución se
determina experimentalmente.
Electroforesis

7. Es un método que permite separar las proteínas en función de su carga neta al someterla a un
campo eléctrico. No se utiliza como método de purificación de proteínas, ya que hay que teñirlas
para visualizarlas, y en este proceso generalmente se inactivan.
Para realizar este método se emplea: un soporte (papel, acetato de celulosa o geles de
poliacrilamida), el cual está inmerso en una solución tampón que controla el pH del medio, ambos
contenidos en una cubeta que tiene dos electrodos. Sobre el soporte se colocan las muestras de
proteínas que se desea separar, y se aplica la corriente eléctrica. Posteriormente las proteínas se
visualizan mediante tinción con un colorante. Las manchas se identifican comparándolas con una
serie de patrones que han corrido al mismo tiempo en el mismo soporte.
En condiciones normales, la migración diferencial de las proteínas dependerá tanto de la carga
como del tamaño y estructura de la proteína, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido
un agente desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria
y cuaternaria de las proteínas y se uniforman sus cargas, por lo que la migración sólo depende de
su peso molecular.
En un gel de poliacrilamida-SDS, las proteínas pequeñas viajan más rápido que las de mayor
tamaño, porque el tamaño del poro del gel entorpece el paso de las proteínas de mayor peso
molecular.
OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA MONÓXIDO DE CARBONO
DESHIDROGENASA A PARTIR DE LA CEPA BACTERIANAOligotrophacarboxidovorans
(cepa OM 5)
El monóxido de carbono (CO) es un gas contaminante, venenoso, producido durante la
combustión incompleta de materiales petróleo, gasolina, carbón y materiales vegetales. El
monóxido de carbono inhibe la capacidad de la sangre para transportar oxígeno, siendo
responsable de síntomas respiratorios.

8. A nivel mundial hay una conciencia cada vez mayor entre lasautoridades competentes de la
necesidad de controlar los niveles de monóxido de carbono presentes enla atmósfera. Es por esto,
que hay un gran interés porel desarrollo de biosensores, es decir, sensores basados en principios de
reconocimiento molecular inherentes a muchas reacciones bioquímicas en la que participan
enzimas y anticuerpos capaces de detectar concentraciones pequeñas del gas.
Un sensor electroquímico enzimático es un electrodo metálico cuya superficie contiene una enzima
redox inmovilizada. Las enzimas pueden aislarse de sus fuentes (microorganismos,
tejidosvegetales o animales) y purificarse.
La bacteria gram (-) Oligotrophacarboxidovorans (cepa OM 5), pertenece al grupo de
bacteriascarboxidótrofas, que pueden usar el monóxido de carbono como única fuente de energía
mediante la inducción del plásmido responsable de la expresión de la enzima monóxido de carbono
deshidrogenasa (CODH), ligada a membrana, y que posee la capacidad de oxidar el CO en
solución acuosa.
Cultivo
Para el crecimiento autotrófico de O. carboxidovorans se utilizó el medio mineral ATCC 1789(pH
final fue de 6,8), en el que la única fuente de carbono disponible provenía del monóxido de
carbono.
Al recipiente con el medio de cultivo (medio mineral ATCC 1789) previamente inoculado con la
cepa, se colocó en un desecador saturado con monóxido de carbono, con agitación constante a 30
ºC durante 96 horas, tiempo necesario para que las células alcanzaran la fase de crecimiento
exponencial.
Obtención y purificación de los extractos enzimáticos
La preparación de los extractos enzimáticos se realizó a partir del cultivo bacteriano al cual se le
agregó lisozima. Las bacterias con lisozima se colocaron en un baño María durante12 horas a 40
ºC. Posteriormente, la suspensión celular tratada conlisozima se sometió a sonicación por 10
minutos. La muestra se puso en hielo mientras se sometía a sonicación, con el objetivo de evitar su
calentamiento.
Purificación
Solubilización con el detergente (Triton X-100):Para separar la enzima de los restos de la
membrana, al extracto celular después de la sonicación, se añadió Tritón X-100, se homogenizó la
solución y el detergente se dejó actuar por una hora.

9. Posteriormente se realizó una centrifugación a 10.000 rpm durante 45 minutos a 4 °C y se tomó el
sobrenadante.La muestra solubilizada se pasó por una columna de exclusión molecular (filtración
por gel). Se tomaron las muestras que fueron luegoeluídascon buffer fosfato de sodio 0.2M, pH 7.
Posteriormente, se recolectaron las fracciones entubos de 1.5 mL y se les realizaron las pruebas de
actividad enzimáticay concentración proteica.La actividad enzimática se determinó
electrofotométricamente mediante la reducción del azul de metileno en presencia de monóxido de
carbono a 30ºC y 664 nm.
Posteriormente el resultado del proceso de purificación de los extractos crudos se verificó mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida, en condiciones no desnaturalizantes.
CONCLUSIONES
Para el estudio de una enzima se deben conocer su estructura, propiedades fisicoquímicas,
enzimáticas y biológicas. Dentro de un proceso de purificación de enzimas es importante el
cuidado en los aspectos técnicos de trabajo para evitar condiciones que sean inestables en dicho
proceso o que interfieran en las condiciones de reacción.
Los métodos de homogenización se realizan mediante formas físicas, químicas y enzimáticas que
dará lugar a una suspensión uniforme y estable llamada homogeneizado o extracto crudo. Los
métodos de separación pueden realizarse mediante centrifugación, métodos cramatográficos y
métodos electrofóreticos.
La obtención y purificación de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa a partir de cultivos
de la cepa bacteriana Oligotrophacarboxidovorans, cultivada en un medio mineral saturado de
monóxido de carbono. Los extractos crudos se obtuvieron por sonicación y se purificaron por
centrifugación y cromatografía de exclusión molecular (filtración por gel); estos esultados del
proceso de purificaciónfueronverificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamidaen
condiciones no desnaturalizantes.
BIBLIOGRAFÍA
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/211619/Contenido_en_linea_eXe/leccin_20_extraccin_puri
ficacin_y_caracterizacin_de_proteinas.html
Sobeida Sánchez.Material de apoyo para los estudiantes del curso
Bioquímica experimental. 2013.
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDENTES_22427.pdf

10. Unidad de enzima (U): cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 mol de sustrato en
producto(s) en 1 minuto de reacción, bajo condiciones previamente determinadas.
Actividad enzimática o concentración de enzima: unidades de enzima por ml de solución. (U/ml)
Actividad específica (U/mg): actividad enzimática (U/ml)/concentración de proteínas (mg/ml) de
la solución. Es el número de unidades de enzima por mg de proteína
Actividad total: Actividad enzimática x volumen total.
ANÁLISIS DE LOS DATOS
Para juzgar si un método de purificación es adecuado, deben calcularse:
 recuperación
 Grado de purificación alcanzados.
 Las unidades enzimáticas totales de la etapa inicial (100%) puede calcularse el
rendimiento de cada etapa refiriendo las unidades totales de cada paso a las iniciales.
 Grado de purificación, debe obtenerse primero el valor de Ae alcanzado en cada paso.
 Si se considera la Ae inicial como unidad de purificación, el grado de purificación de cada
etapa se calcula haciendo el cociente entre la Ae de dicha etapa y la del primer paso.
 AE
Unidades totales en la fracción i
Total de proteínas en la fracción i
 Rendimiento
Unidades totales en la fracción i
Unidades totales en la fracción original

11.  Porcentaje de purificación
AE en la fracción i
AE en la fracción original
se obtuvieron extractos crudos y purificados de la enzima monóxido de carbono deshidrogenasa capaces de oxidar
monóxido de carbono a CO2, a partir de cultivos de la bacteria carboxidotrofaOligotrophacarboxidovorans (cepa
OM5)cultivadas aeróbicamente en un medio mineral saturado con CO. Los extractos crudos se obtuvieron mediante la
ruptura delas células por sonicación y se purificaron por cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de
intercambio iónico. La actividad enzimática de los extractos se midió utilizando azul de metileno como aceptor
electrónico artificial en la oxidación del CO a CO2. Se obtuvieron extractos crudos y purificados con actividad
enzimática detectable por medio de espectrofotometría. El grado máximo de purificación obtenido fue de 200veces y se
lograron actividades enzimáticas específicas en el rango de 0.01 a 2.0 mU/mg de proteína. Ensayos electroquímicos
usando un microelectrododeplatino y azul de metileno como mediador electrónico, mostraron un aumento de la
corrienteanódica cuando se adicionó el sustrato monóxido de carbono a la celda que contenía el extracto enzimático.
Estos resultados permiten alentar la construcción de un biosensor electroquímico para la detección de monóxido de
carbono, utilizando extractos enzimáticos obtenidos a partir de bacterias carboxidotrofas.