charla para estudiantes de introducción al cultivo de tejidos.

1. Práctica de reconocimiento de instalaciones y
equipos de un laboratorio de cultivo de tejidos.
C.E.B. UNESUM.
Dr.C. Byron E. Zevallos Bravo.
Centro de Estudios de Biotecnología. UNESUM
byron.zevallos@unesum.edu.ec
Ing. Azucena Zhindon Ganchozo MsC
Centro de Estudios de Biotecnología. UNESUM
bertha,zhindon@unesum.edu.ec
CARRERA DE INGENIERIA AGROPECUARIA.
7MO SEMESTRE.
DOCENTE RESPONSABLE: Dra.C. Blanca Indacochea Ganchozo

2. CONTENIDO
Medios de cultivo.
Control de calidad del agua.
pH.
Desinfección y esterilización.
Reconocimiento de equipos e
instalaciones.
Practica de cultivo in vitro de ajo (Alium
sativum)

3. Medios de Cultivo: generalidades,
composición y preparación.
• Una vez definido el objetivo perseguido con el cultivo
in vitro de un determinado explante, es necesario
elegir un medio apropiado de cultivo, en el cual hay
que considerar no sólo sus componentes sino su
preparación.
• Componentes. En la actualidad existen innumerables
formulaciones cada una de las cuales contiene entre
15 y 35 compuestos químicos que suministran:
a)Carbono, b)Nutrimentos minerales,
c)Vitaminas,d)Agente gelificante,e)Sustancias
reguladoras del crecimiento,f)Otros compuestos.
• Generalmente se hace referencia al conjunto de
componentes a+b+c como al medio basal (MB).

4. MEDIOS MAS USADOS. Contenido de macronutrientes (mg/L).
Macronutrientes White
(1954)
W
Murashige &
Skoog
(1962)
Gamborg
(1968)
B5
Schenk
Hildebrandt
(1972)
S&H
Chu et al
(1975) N6
KNO3
NH4NO3
Ca(NO3)2.4H2O
CaCL2.2H2O
MgSO4.7H2O
KCL
KH2PO4
NH4H2PO4
NaH2PO4.H2O
Na2SO4
(NH4)2SO4
80
-
300
-
720
65
-
-
16.5
200
-
1900
1650
-
440
370
-
170
-
-
-
-
2500
-
-
150
250
-
-
150
-
-
134
2500
-
-
200
400
-
-
-
-
-
-
2830
-
-
166
185
-
400
-
-
-
463

5. Micronutrientes White
(1954)
W
Murashige &
Skoog
(1962)
Gamborg
(1968)
B5
Schenk
Hildebrandt
(1972)
S&H
Chu et al
(1975) N6
MnSO4.H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
CuSO4.5H2O
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
FeSO4.7H2O
NaFeEDTA.2H2O
Fe(SO4)3
7.0
-
3.0
1.5
0.75
-
-
-
-
-
2.5
22.3
-
8.6
6.2
0.83
25 µg
250 µg
25 µg
27.8
37.3
-
-
10.0
2.0
3.0
0.75
25 µg
250 µg
25 µg
-
-
-
-
10.0
1.0
5.0
1.0
0.2
0.1
0.1
15.0
20.0
-
-
4.4
1.5
1.6
0.8
-
-
-
27.85
37.25
-
MEDIOS MAS USADOS. Contenido de macronutrientes (mg/L).

6. Vitaminas White
(1954)
W
Murashige &
Skoog
(1962)
Gamborg
(1968)
B5
Schenk
Hildebrandt
(1972)
S&H
Chu et al
(1975) N6
Myo-inositol
Thiamina-HCL
Acido Nicotínico
Piridoxina-HCL
Ca-Pantotenato
Biotina
Acido Fólico
Cloruro Cholina
Rivoflavina
-
-
-
-
-
-
-
-
-
100
0.1
0.5
0.5
-
--
-
-
-
100
10.0
1.0
1.0
-
--
-
-
-
1000
5.0
5.0
0.5
-
--
-
-
-
-
1.0
0.5
0.5
-
0.05
0.5
-
-
MEDIOS MAS USADOS. Contenido de macronutrientes (mg/L).

7. PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO BASAL
SOLUCIONES STOCK
5 SOLUCIONES MADRE: 10 ML C/U POR LITRO

8. ADICIONAR VITAMINAS: 10 ml/L
ADICIONAR: 30 g de azúcar
REGULAR pH a 5.5 – 5.8
ADICIONAR 7 g de agar
SOMETER A TEMPERATURA PARA ACTIVAR EL GELIFICANTE
REPARTIR EN FRASCOS O TUBOS Y AUTOCLAVAR
LISTO

9. • Control de calidad del agua destilada
Para la preparación de medios, soluciones y tampones,
debe utilizarse agua destilada y desmineralizada que haya
sido sometida a controles periódicos que aseguren su
calidad.
Controles periódicos:
- Requisitos del agua destilada:
 Conductividad – 0.5 - 2.0 μS/cm
 pH – 5.5- 7
 Libre de metales pesados
 Libre de otros contaminantes
Practica: Medir
conductividad de
varios tipos de
aguas.

10. pH - Importancia
Cuando se prepara un medio de cultivo,
después de añadir sus componentes, se
procede a ajustar el pH final al valor deseado,
añadiendo OHNa 0.1 N o HCl 0.1N al medio.
Una vez ajustado el pH se procede a agregar
el gelificante, de ser el caso y esterilizar el
medio. El pH final del medio de cultivo es un
factor importante por diversas razones:

11. •Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la
solidificación de los agentes gelificantes añadidos a
los medios.
•El valor del pH puede afectar a la solubilidad de
algunos componentes del medio de cultivo.
•El valor del pH puede afectar a la absorción de
determinados nutrientes por parte del explante (p.e.
la absorción de iones NO3-aumenta con la acidez
del medio)
•El valor del pH del medio puede afectar al pH del
citoplasma y como consecuencia a la actividad de
muchas enzimas.

12. Por todas estas razones conviene optimizar el pH
del medio para cada caso en concreto. En general,
no obstante, en la mayoría de situaciones se
trabaja a pH entre 5.2 y 5.8.
Una vez ajustado el pH del medio, este sufrirá una
ligera acidificación durante el proceso de
esterilización en autoclave, para, después, subir
nuevamente durante el tiempo de cultivo, y luego se
irá acidificando progresivamente como resultado de
la absorción diferencial de algunos componentes,
así como de la excreción de exudados por parte del
explante.
Práctica: Regular pH

13. Esterilización.
• Es el proceso mediante el cual cualquier
material, sitio o superficie se libera
completamente de cualquier
microorganismo vivo o espora.
• La desinfección se limita al proceso de
destrucción de los microorganismos
mediante métodos químicos, la esterilización
se refiere al método físico para la
destrucción de los microorganismos.
Práctica: Cálculos de Preparación de
soluciones. CV y VV. Diferencias.

14. Procedimientos de esterilización.
• El calor es uno de los agentes que se utiliza con
más frecuencia en la esterilización, se puede
usar en forma de llama directa, de calor
húmedo (vapor) o de calor seco (aire caliente).
• CALOR SECO. Los recipientes de vidrio y
demás utensilios que se utilizan para las
operaciones de implantación, son esterilizados
mediante el empleo de una ESTUFA a una
temperatura mínima de 170ºC, durante dos
horas, nunca menos de una hora.
• Todos los materiales a esterilizar mediante calor
seco(estufa) deben estar limpios y libres de
trazas de materia orgánica.

15. • VAPOR BAJO PRESIÓN.(AUTOCLAVE).
• Es muy eficiente para destruir todas las formas de
bacterias , hongos y sus esporas y es el método
más utilizado para esterilizar diferentes materiales
incluyendo los medios de cultivo(siempre y
cuando no contengan componentes termolábiles).
• Es necesario extraer todo el aire antes de
empezar el proceso de esterilización ya que a
presiones iguales, la temperatura de una mezcla
de aire y vapor no es tan alta como la del vapor
puro.
• La temperatura dentro del autoclave se regula
mediante la presión y es directamente
proporcional a ésta, la presión se lee en un
manómetro que forma parte del autoclave.

16. • Para esterilizar los materiales relacionados
con el cultivo de tejidos se acostumbra usar
una presión de 15 lb durante 20 minutos, a
esta presión la temperatura del vapor es
aproximadamente 121ºC, suficiente para
matar virtualmente a todas las formas de
vida en cinco minutos. Pero el tiempo
dependerá del tipo de material como de su
cantidad.
• La siguiente es una guía para presiones
variables:

17. • 10 lb. de presión (115.5ºC)durante 30 minutos.
• 15 lb. de presión (121.5ºC)durante 20 minutos.
• 20 lb. de presión (126.5ºC)durante 15 minutos.
• FILTRACIÓN.Cuando se usa componentes
termolábiles en el medio de cultivo, se procede
a su filtración y no al autoclaveo. Estos son
filtros especiales (Millipore) a prueba de hongos
y bacterias, existen filtros desechables que
aunque costosos, pueden ahorrar tiempo y son
pre-esterilizados.

18. Esterilización del medio de cultivo
• Son generalmente esterilizados en autoclave a 1210C y
1,2 kg/cm2
Volumen de medio por frasco
(mL)
Tiempo mínimo de
esterilización (min)
20-50 15
75-200 20
250-500 25
1000 30
1500 35
2000 40
El agua que se
utiliza en el
autoclave debe ser
siempre
desmineralizada.
Gracias.
INICIO DE TOUR BIOTECNOLOGICO