microbiologia

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CUANTIFICACIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Introducción
En la naturaleza, los microorganismos se desarrollan en comunidades, sin embargo, el estudio de las
poblaciones que conforman esa comunidad ha incidido directamente en el desarrollo de la microbiología
desde el aislamiento e identificación hasta la caracterización de los cultivos puros. El crecimiento, manejo y
conservación de los cultivos puros está enmarcado en los aspectos cualitativos y cuantitativos de su
comportamiento. Si se extiende una alícuota de células sobre una superficie de agar, cada célula aislada se
multiplicará formando una colonia independiente, a la cual se denomina unidad formadora de colonias (UFC),
es decir, formación o agrupación macroscópicamente visible de microorganismos sobre un medio sólido; cada
colonia representa un cultivo puro.
Las colonias aisladas pueden obtenerse mediante tres principales formas de cultivo microbiana:
1) Siembra en estrías: Se inocula la mezcla microbiana sobre un extremo de la placa de agar con un
asa de siembra o un hisopo, y se extiende formado estrías sobre la superficie en uno o varios sentidos
Las células individuales se irán desprendiendo del asa al frotarla sobre la superficie y desarrollarán
colonias aisladas.
2) La siembra por extensión. Se pasa un volumen pequeño de una mezcla microbiana diluida
conteniendo no más de un centenar de células, al centro de una placa de agar y se extiende
uniformemente sobre la superficie con un distribuidor de células (asa digraskly o equivalente). Las
células diseminadas sobre la superficie desarrollarán colonias aisladas. El número de colonias debe
ser igual al número de organismos viables de la muestra (bajo la premisa que el medio y las
condiciones de incubación son adecuados para el tipo de microorganismos deseado). Este tipo de
siembra se utiliza para determinar la concentración microbiana en una muestra.
3) La siembra en profundidad se emplea frecuentemente con bacterias y hongos, puede también
generar colonias aisladas. La muestra original se diluye varias veces para reducir la población
microbiana lo suficiente, con el fin de obtener colonias separadas cuando se siembren. A
continuación, se mezclan volúmenes pequeños de las muestras diluidas con agar líquido, que se ha
temperado hasta aproximadamente 45 °C, y la mezcla se vierte inmediatamente en placas de cultivo
estériles. Por motivos estadísticos y de fiabilidad, únicamente se deberán contar las placas
conteniendo entre 30 y 300 colonias.
La siembra por punción también es considerada una siembra en profundidad, sin embargo su
aplicación no se refiere al aislamiento de microorganismos sino a su identificación mediante pruebas
bioquímicas.
Tanto la siembra por extensión como la de profundidad son una herramienta útil en el análisis cuantitativo
directo de las poblaciones microbianas, sin embargo también existen otros métodos indirectos que se utilizan
con mucha frecuencia y que pueden ser de mayor utilidad en análisis rutinarios.
Objetivo
Ensayar la cuantificación de poblaciones microbianas mediante diferentes métodos.

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Requerimientos
Materiales Reactivos y/o Medios de Cultivo
Sesión 1 (2 h)
2 Mecheros
1 Encendedor o chispero
2 Celdas plásticas disminuidas
1 Vaso de precipitado de 500mL
1 Gradilla para tubos de ensaye de 16x 20 mm
1 Micropipeta de 1 mL
1 Micropipeta de 200µL
10 puntas de 1 mL,estériles
20 puntas de 200µL, Estériles (De preferencia en caja
o en vaso).
2 asas digraskly
1 caja petri de vidrio NO estéril
4 cajas petri desechables estériles, vacías.(60x90 mm)
1 Pizeta con agua destilada.
5 Cubrebocas (1 por alumno)
1 Par de guantes para cosas calientes
Sesión 1 (2 h)
7 Tubos de 18x20mm con taparosca que contengan
9 mL de solución salina 0.85%, cada uno.
6 Cajas petri con Agar BHI (10x100 mm)
1 Matraz con 60 mL de agar BHI estéril y fundido.
Alcohol comercial (para esterilizar asa digraskly)
5 mL de caldo BHI (para blanquear equipo)
Equipos Otros
Sesión 1 (2 h)
3 Espectrofotómetros (por grupo)
1 Incubadora estática a 37ºC, 24 h (por grupo)
1 vortex (por equipo)
Sesión 2 (2 h)
1 Contador de colonias (por equipo)
Sesión 1 (2 h)
5mL de Cultivo de E. coli en caldo BHI crecido a
37ºC sin agitación durante 16-20 h
Procedimientos
Preparación de diluciones
1. Tomar 1 mL del cultivo de E. coli y realizar diluciones decimales hasta 10-7
en los tubos que
contienen 9 mL de solución salina 0.85%. (Figura 1)
Fig. 1 Preparación de diluciones decimales. Fuente: Prescott y col., 2009.

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Cuantificación por conteo en placa (Método directo: siembra por extensión y siembra en profundidad)
2. Siembra por extensión. Diluciones 10-2
a 10-7
: Inocular 50µl de cada dilución de E. coli (por
separado), en las cajas petri con medio BHI. Distribuir la muestra con un asa digraskly.
3. Siembra en profundidad (vaciado en placa). Diluciones 10-2
a 10-5
: Tomar 0.5 mL de cada
dilución (por separado) y colocarla en la caja petri vacía. Verter aproximadamente 15 mL de
medio BHI estéril y fundido. Homogeneizar y dejar solidificar el medio de cultivo.
4. Incubar las cajas invertidas a 37ºC durante 16-24h.
5. Realizar el conteo de colonias, considerando válidas las que tengan entre 30 y 300 colonias.
6. Calcular las UFC/ml de cultivo y expresar los resultados en LOG UFC/ml de cultivo.
Cuantificación por espectrofotometría (Método indirecto)
1. Tomar por separado una muestra (1 mL) de las diluciones 10-1
y 10-2
y medirlas en el
espectrofotómetro blanqueando el equipo con solución salina estéril o agua.
2. Registrar el resultado de la absorbancia a 590 nm (Abs590nm).
3. Estimar el crecimiento en términos de absorbancia considerando la dilución utilizada.
Cuestionario
1. ¿Por qué un recuento de viables es más sensible que un recuento microscópico?
2. Investigue las limitaciones del recuento directo por microscopía.
3. Explique la suposición qué se hace la relacionar el recuento en placa con el número de células.
4. Mencione las ventajas y desventajas del recuento en placa.
5. ¿Qué es la “gran anomalía” del recuento en placa?
6. Cite dos ventajas del uso de la turbidez para medir el crecimiento celular.
7. Describa como usaría un valor de turbidez para deducir cuantas colonias obtendría al sembrar en placa un
cultivo de una densidad óptica determinada.
8. Identifique las ventajas y desventajas de la denominada “técnica dela gota”.
Bibliografía
Prescott M. L., Sherwood M. L., Woolverton C. J. 2009.Microbiología.3a ed. Ed. McGraw-Hill.España.
Madigan M., Martinko M., Parker J. 2004. Brock. Biología de los microorganismos. Prentice Hall. España.
Koneman E. 1989. Diagnóstico microbiológico Edit. Panamericana.
Miles A. A. y Misra S.S. 1938. Journal of Hygiene 38, 732.
Munsch-Alatossava P. y Alatossava T. 2007. A faster and more economical alternative to the standard plate
count (SPC) method for microbiological analyses of raw milks. Communicating Current Research and
Educational Topics and Trends in Applied Microbiology A. Méndez-Vilas (Ed.). Pp. 495-499.