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Procesamiento de las Muestras Microbiológicas
                       (Urocultivos, Heces y BAAR)

Procesamiento.

Consiste en la preparación de las muestras, la realización de tinciones, y la inoculación
en los medios de cultivo para su posterior incubación.
En este proceso es preciso considerar:
        a) el tipo de muestra enviada
        b) el diagnóstico clínico del paciente
        c) la petición solicitada.
El tipo de muestra enviada determina si requiere o no pretratamiento (centrifugación,
homogeneización) previo a la inoculación de los medios de cultivo. La información
clínica del paciente es fundamental para la selección de los medios de cultivo a
inocular y su posterior incubación. De modo general, en función
del tipo de muestra, el laboratorio utiliza unos medios de cultivo
primarios que permiten el aislamiento de la mayoría de los
agentes etiológicos más frecuentes de los distintos procesos
infecciosos. Sin embargo, en ocasiones el síndrome clínico
puede estar causado por microorganismos poco frecuentes
cuyo aislamiento requiere el uso de medios de cultivo
específicos y/o selectivos no habituales. La sospecha de la
participación de alguno de estos microorganismos poco habituales, debe comunicarse
al laboratorio. Igualmente, el laboratorio debe dar a conocer a los clínicos de su
institución qué microorganismos investiga rutinariamente y cuáles debe especificar en
la petición (cartera de servicios o catálogo de pruebas).
Aunque el aislamiento por cultivo y continúa siendo una las técnicas más
frecuentemente empleadas en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, existen
en la actualidad otras técnicas cuya principal ventaja sobre el cultivo es la rapidez
diagnóstica.

Contenido mínimo de los estudios microbiológicos.

El alcance de un estudio microbiológico se refiere al conjunto de requisitos, en cuanto
a tipo de muestras, estudios a realizar y métodos a emplear, que debe tener dicho
estudio para que su utilización sea adecuada. A continuación se definen los
contenidos mínimos para los estudios bacteriológicos más frecuentes. Algunos son
fáciles de delimitar y se consideran obligados, mientras que otros pueden considerarse
optativos y podrían ser motivo de opinión entre los profesionales.

Orinas
a) Estudios obligados:
       Cultivo cuantitativo, identificación y estudio de sensibilidad de gramnegativos.
       Cultivo cuantitativo de levaduras.
       Se debe realizar un sedimento de orina (principalmente
       para la determinación de piuria). Si esta prueba no se
       realiza en el laboratorio de Microbiología es conveniente
       indicar al clínico la necesidad de solicitarlo para evaluar
       correctamente el resultado del urocultivo.
b) Estudios optativos:
       Pruebas de cribado como prueba adicional al urocultivo.
       Observación microscópica directa (examen en fresco o tras tinción).
       Pruebas de sensibilidad de levaduras a antifúngicos.
Heces
a) Estudios obligados:
       Cultivo en medios adecuados para el aislamiento, identificación y estudio de
       sensibilidad de bacterias de los géneros Salmonella, Shigella, Yersinia,
       Aeromonas, Vibrio (incluyendo Vibrio cholerae) y
       Campylobacter. La utilización adicional de medios
       específicos para el cultivo de Aeromonas, Yersinia
       y Vibrio solamente se realizará tras valoración
       previa de su necesidad en cada laboratorio o en
       situaciones en las que se sospeche una epidemia.
       Serotipificación básica de Salmonella y Shigella
       (serogrupo).
       Detección de la(s) toxina(s) de Clostridiumdifficile en heces, o el cultivo de C.
       difficile con demostración de la toxigenicidad de las cepas a partir de muestras
       de heces de pacientes con gastroenteritis en los que se solicite (principalmente
       pacientes hospitalizados).
b) Estudios optativos:
       Detección de cepas de Escherichia coli diarreagénicas (principalmente de E.
       coli O157:H7).
       Observación microscópica directa de heces (tinción de Gram o azul de
       metileno para observación de leucocitos).


Microorganismos más comunes y técnicas rápidas para su detección.

En la actualidad existen múltiples equipos comercializados para la detección de
numerosos microorganismos en determinadas muestras clínicas que han demostrado
utilidad.
Microorganismos con técnica rápida disponible para su detección en muestras clínicas

Microorganismos           Muestras                           Técnicas disponibles
Bacterias
                                                                                 1   2
Streptococcuspneumoniae LCR, orina, muestras respiratorias   Aglutinación (LCR ), IC (orina)
                                                                   3                     4
Legionellapneumophila     Muestras respiratorias, orina      IFD (respiratorias), IC, EIA (orina)
Clostridiumdifficile      Heces                              Aglutinación, EIA
Virus
Rotavirus                 Heces                              IC, Aglutinación
Adenovirus                Heces, muestras respiratorias      IC (heces, respiratorias), Aglutinación
                                                             (heces), IFD (respiratorias)
Parásitos
Cryptosporidium           Heces                              Tinción de ácido-alcohol resistencia
Giardia+Cryptosporidium   Heces                              IFD
Entamoebahistolityca      Heces                              EIA


1
  Líquido cefalorraquídeo (LCR)
2
  Inmunocromatografía (IC)
3
  Inmunofluorescencia directa (IFD)
4
  Enzimoinmunoanálisis (EIA)
Procesamiento de Urocultivos (Orina).

Pruebas de tamizaje.
Se han diseñado diversos métodos rápidos de tamizaje,
automatizados y no automatizados, para determinar si la
muestra de orina contiene bacterias y/o leucocitos en cantidades
significativas.

Detección de bacteriuria.

Tinción de Gram.
1. Colocar 10 µl de la muestra de orina, bien mezclada
   pero sin centrifugar, sobre un portaobjetos.
2. Permitir secar al aire sin esparcir sobre la superficie del
   portaobjetos.
3. Fijar la lámina al calor.
4. Teñir por Gram.
5. Determinar y reportar el número de microorganismos
   por campo de inmersión.
6. La presencia de uno o más microorganismos por campo de inmersión correlaciona
   con un recuento de colonias de ≥105 UFC5/ml.
7. La presencia de abundantes células escamosas y diferentes morfotipos
   microbianos son indicativos de que la muestra ha sido probablemente contaminada
   durante la recolección. En este caso, se debe solicitar una segunda muestra.

Tinción con naranja de acridina.
1. Preparar un frotis como se indicó para la tinción de
   Gram.
2. Realizar una tinción con naranja de acridina.
3. Determinar el número de microorganismos por campo
   de ×400 utilizando un microscopio de fluorescencia. En
   caso de una morfología dudosa, se puede examinar el
   frotis con una magnificación de ×1000.
4. La presencia de uno o más microorganismos por campo
   de inmersión correlaciona con un recuento de colonias de ≥ 105 UFC/ml.

Detección de piuria.

Análisis del sedimento urinario.
El análisis de sedimento urinario por la presencia de
leucocitos polimorfonucleares es válido siempre y cuando el
procedimiento se haya estandarizado con respecto al
volumen de orina centrifugada, la velocidad y el tiempo de
centrifugación y el volumen en el cual se resuspende el
sedimento.

Cultivo de muestras de orina.

Recuento por dilución en tubo.
1. Añadir 0.1 ml de la muestra de orina (bien mezclada y sin centrifugar) a 9.9 ml de
   solución salina estéril (10-2).
2. Mezclar bien y transferir 0.1 ml de esta dilución a cada una de las placas con

5
    Unidad formadora de colonias (UFC)
medio (l0-3).
3. Distribuir bien el inóculo sobre la superficie del agar utilizando
   un asa estéril o una espátula de Drigalski.
4. Incubar las placas de los medios inoculados a 35 a 37ºCpor
   18-24 horas. Las placas de agar sangre deben ser incubadas
   en jarra con candela.
5. Luego del periodo de incubación determinar el número de
   colonias en la superficie y el número de UFC/ml multiplicando
   el número de colonias por el factor de dilución (l03).

Recuento por inoculación directa con asa calibrada.
1. Introducir verticalmente un asa calibrada de 0.01 ml (10 µl) o de 0.001 ml (1 μl)
   estéril justamente por debajo de la superficie de la muestra de orina (bien
   mezclada y sin centrifugar).
2. Inocular por estría sobre toda la superficie del medio de cultivo.
3. Sin flamear nuevamente el asa, repetir el procedimiento para el segundo medio de
   cultivo a utilizar.
4. Incubar las placas de los medios inoculados a 35 a 37ºCpor 18-24 horas. Las
   placas de agar sangre deben ser incubadas en jarra con candela.
5. Luego del período de incubación determinar el número de colonias en la superficie
   del medio de cultivo y el número de UFC6/ml multiplicando el número de colonias
   por el factor de dilución (102 para un inóculo de 0.01 ml [una colonia representa
   100 UFC/ml], 103 para un inóculo de 0,001 ml [una colonia representa 1,000
   UFC/ml]).
Examen de los medios de cultivo.
1. Examinar las placas que han sido incubadas a 35 a 37ºCpor 18-24 horas.
2. Si no se observa crecimiento y la muestra ha sido recolectada por micción o por
   cateterización, reportar:
                   “No se observa crecimiento > 103 UFC/ml”,si se inocularon las
                   placas por dilución en tubo (10 -3) o con asa calibrada de 1 µl..
                    “No se observa crecimiento > 102 UFC/ml”,si se inocularon las
                   placas con asa calibrada de 10 µl.
3. Si no se observa crecimiento y la muestra fue recolectada por punción
   suprapúbica, incubar las placas por 18-24 horas adicionales.
4. Si se observan colonias muy pequeñas o diminutas, incubar las placas por 18-24
   horas adicionales.
5. Si no se observa crecimiento y este resultado no correlaciona con lo observado en
   la tinción de Gram de la muestra o con la condición clínica del paciente, incubar las
   placas por 18-24 horas adicionales.
6. Sin tampoco se observa crecimiento luego de una incubación de 48 horas y este
   resultado no correlaciona con lo observado en la tinción de Gram de la muestra o
   con la condición clínica del paciente, solicitar una muestra de orina recolectada por
   punción suprapúbica para hacer un cultivo para bacterias anaerobias.
7. Si se observa crecimiento, examine los cultivos por número de colonias (UFC/ml) y
   por los diferentes morfotipos coloniales.

Interpretación de los resultados.
    1. El criterio de un recuento de ≥105 UFC/ml se puede aplicar a la mayoría de las
       muestras de orina recolectadas por micción y enviadas para cultivo.
    2. En el caso de recuentos inferiores a 105 UFC/ml se puede aplicar la siguiente
       guía de análisis de los resultados:



6
    Unidad formadora de colonias (UFC)
Recuento             Condición                 Organismos           Procedimiento a seguir
                      Tipo de muestra
    ≥ 105      Orina por micción              Cultivo puro             Identificación y PSA
    ≥ 105      Orina por micción              Dos morfotipos           Identificación y PSA
               Sintomatología positiva        coloniales
    ≥ 105                                     Más de dos morfotipos    Posible contaminación
                                              coloniales               Reportar posible
                                                                       contaminación y solicitar
                                                                       nueva muestra
      104      Orina por                      Dos morfotipos           Identificación y PSA
               cateterizaciónSintomatología   coloniales
      104      positiva                       Más de dos morfotipos    Posible contaminación
                                              coloniales               Reportar posible
                                                                       contaminacióny solicitar
      10³                                                              nueva muestra
      10³                                     Cultivo puro             Identificación y PSA
      10²      Orina por cateterización       Cultivo puro             Identificación y PSA
               Hombre sintomático             Cualquier número de      Identificación y PSA
               Punción suprapúbica            morfotipos
       10²                                    Cultivo puro de bacilo   Identificación y PSA
               Mujer sintomática              Gram-negativo


                        Procesamiento de Copros (Heces).

Procedimientos.

Exámendirecto.
Un examen al fresco de una muestra de heces sin teñir es útil
para detectar parásitos y, con experiencia, las formas curvas y
con movilidad en dardo de Campylobacter y Vibrio cholerae a
partir de heces frescas. Estos últimos se pueden observar mejor
en microscopios de campo oscuro o contraste de fases.

Examen a fresco con azul de metileno.
Seleccionar una porción de material fecal de un área con sangre y
moco y mezclar con una gota del colorante de azul de metileno de
Loeffler (azul de metileno al 0.3% en etanol al 30%) por 2-3 minutos
observar en alto poder seco. El predominio de polimorfonucleares
indica la presencia de un posible patógeno invasivo, mientras que el
predominio de monocitos se asocia con infecciones por Salmonella
typhi.


Tinción de Gram.
Preparar un frotis delgado del material fecal y realizar una tinción
de Gram. Observar predominio de                polimorfonucleares,
levaduras, cocos Gram -positivos o bacilos Gram-negativos, lo
cual puede sugerir una infección por Candida, S. aureus o
Pseudomonas, respectivamente. El predominio de bacilos Gram-
positivos largos, rectos y con paredes paralelas puede sugerir sobrecrecimiento                   de
Clostridium difficile, aun cuando no es una prueba totalmente confiable de                         la
infección. La tinción de Gram modificada con fucsina básica al 0.1% permite                        la
observación de bacilos Gram-negativos delgados, en forma de coma, ese (S) o                       en
alas de gaviota, sugestivos de infección por Campylobacter spp.
Cultivo primario de rutina.

Aislamiento de Salmonella sp7. y Shigella sp8.
Las muestras que se reciben para la detección de éstos
patógenos deben cultivarse en un medio de enriquecimiento, un
medio de soporte, un medio levemente selectivo-diferencial, y un
medio moderadamente selectivo. Los medios más comúnmente
recomendados, de acuerdo con las posibilidades del laboratorio,
son los siguientes:
         Medio de soporte: agar sangre (agar tripticasa-soya con 5% de sangre).
         Medio diferencial: agar MacConkey o agar eosina-azul de metileno de Levine.
         Moderadamente selectivo: agar Hektoen, agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD),
          agar Salmonella-Shigella (SS).
Con el fin de aumentar la probabilidad de aislar alguno de estos agentes se pueden
utilizar los siguientes caldos:
         Caldo GN: la muestra se inocula en el caldo, se incuba a 35°C estrictamente
          por 4 a 6 horas y se subcultiva a medios diferenciales y selectivos.
          Caldo Selenito F y caldo tetrationato: la muestra se inocula en el caldo, se
          incuba a 35°C por 12 horas y se subcultiva a medios diferenciales y selectivos.
Las placas se inoculan directamente con una asada de la muestra de heces, con el
hisopo rectal o del medio de transporte, o a partir de los caldos de enriquecimiento, se
rayan con asa y se incuban a 35°Cpor 18-24 h. Las colonias que se deben buscan son
lactosa negativa con o sin H2S, las cuales se inoculan por picadura y/o rayado a TSI y
urea.

Aislamiento de Campylobacter sp9.
El aislamiento de Campylobacter recae sobre la selectividad del
medio, la cual depende de los agentes antimicrobianos en el medio, el
ambiente microaerofilico (5%O2, 10% CO2 y 85%N2) y la temperatura
de incubación a 42°C, los cuales suprimen el crecimiento de la
mayoría de bacterias comensales. Las muestras negativas por
leucocitos no son procesadas por Campylobacter.
La muestra debe cultivarse en alguno de los medios comerciales recomendados:
       Agar Blaser
       Agar Skirrow
       Agar Butzler
       Agar Preston
La atmósfera microaerofilica se puede generar utilizando una jarra y un sobre para
anaerobiosis, por evacuación y reemplazo de mezcla de gases o por medio de Bio-
Bags con generadores de gas. Debe hacerse una revisión de las placas a las 24, 48 y
hasta 72 horas buscando las colonias sospechosas. Las colonias son pequeñas,
convexas, translúcidas, grisáceas y asemejan una gota de agua.
La identificación presuntiva de las colonias incluye una tinción de Gram modificado con
fucsina básica al 0.1% y la observación de las formas de “S” o en alas de gaviota. La
prueba de oxidasa debe ser positiva y se puede observar la movilidad en dardo
resuspendiendo el microorganismo en un caldo Mueller-Hinton y observando a 40X
entre porta y cubreobjetos.




7
    No se ha determinado la especie (sp)
8
    Indica que se trata de varias especies del mismo género (spp)
9
    No se ha determinado la especie (sp)
Aislamiento de Aeromonas spp10.
Aeromonas spp. causa una diarrea acuosa que se ha
asociado con ingestión de agua no potable. Debe
descartarse Aeromonas spp. si la historia del paciente o
los síntomas sugieren una fuente de infección de este
tipo. Aeromonas spp. crece en los medios de rutina, pero
existe un medio selectivo apropiado para su detección.
Las muestras se cultivan en:
       Agar sangrecon10 xg de ampicilina /ml.
       MAC11 o EMB12
Las placas se incuban a 35°C por 24 horas en aerobiosis. Investigar las placas por
colonias con o sin hemólisis beta que no sean Pseudomonas y realizar prueba de
oxidasa, la cual debe ser positiva. En el medio MAC o EMB se obtienen colonias
lactosa negativa.

Cultivo primario de patógenos especiales.

Aislamiento de Vibrio sp.13
Las muestras sospechosas por Vibrio cholerae se cultivan en
agar TCBS14 y agar sangre, los cuales se incuban a 35°C por 24
horas. Para el enriquecimiento se utiliza el agua peptonada
alcalina, la cual se debe incubar de 5a 8 horas a 35°C para luego
subcultivar a agar TCBS y agar sangre. Las colonias
sospechosas son aquellas que presentan una coloración amarilla
en el agar TCBS y una hemólisis beta en el agar sangre.En el agar TCBS algunos
coliformes, como Proteus sp. y enterococos pueden crecer.
A las colonias sospechosas se les practica:
        Tinción de Gram, observando los bacilos característicos en forma de coma.
        Prueba de oxidasa del agar sangre, la cual debe ser positiva.
        Prueba de hilo mucoide: suspender colonias (obtenidas de un medio no
         inhibitorio) en una gota de solución acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%.Si
         el resultado es positivo, las células bacterianas se lisan por efecto del
         desoxicolato, el ADN liberado ocasionará que la mezcla se haga viscosa. Al
         retirar lentamente de la suspensión el asa, se forma un “hilo” mucoide. La
         mayor parte de Vibrio spp. son positivos, en tanto que las cepas de Aeromonas
         sp. suelen ser negativas.
        Identificación serológica: el uso de antisueros es uno de los métodos más
         rápidos y específicos para la identificación de Vibrio cholerae O1 y O139..
         Perfil completo de reacciones bioquímicas, en forma manual o automatizada.

Aislamiento de Yersinia sp.
Son bacilos Gram-negativos miembros de Enterobacteriaceae que no
fermentan lactosa, crecen mejor a 25°Cy son móviles a esta misma
temperatura y no a 37°C. El procesamiento incluye los siguientes
medios:
       Medio selectivo: agar cefsulodin-irgasan-novobiocin (CIN), en el
       cual Yersinia produce colonias rojo oscuro con bordes

10
     Indica que se trata de varias especies del mismo género (spp)
11
   Agar McConkey (MAC)
12
   Eosina azul de metileno (EMB)
13
   No se ha determinado la especie (sp)
14
   Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa (TCBS)
transparentes.
         Enriquecimiento en frío: inocular la muestra en buffer salino de fosfato (pH 7,6)
          de 4 a 5°Cpor 3 semanas y subcultivar a intervalos de una semana en MAC.
         Agar HE15: produce colonias amarillas pequeñas.

Aislamiento de E. coli enterohemorrágica serotipo O157:H7.
En el ámbito de laboratorio es muy dificil diferenciar las variantes
de Escherichia coli, con excepción de la mayoría de cepas de E.
coli enterohemorrágica O157:H7 (ECEH). Se utiliza como medio
diferencial el MAC-sorbitol, en el cual esta bacteria es incapaz de
hidrolizar sorbitol y produce colonias incoloras, sorbitol-negativo.
No obstante, es importante indicar que existen otras bacterias
entéricas sorbitol negativo por lo que la presencia de colonias
negativas al sorbitol no es diagnóstica de ECEH.
Por consiguiente, el clínico debe basarse en los síntomas y la historia clínica para
solicitar un estudio por un serotipo específico de E. coli, y someter toda muestra de
heces con sangre a análisis por ECEH.
Otros agentes de enfermedad del tracto gastrointestinal.
        Clostridíum dfficile. Debe inocularse un medio selectivo (cicloserina-cefoxitina-
         fructosa-yema de huevo) y realizarse un ensayo para detectar las toxinas, por
         medio de aglutinación en látex o inmunoensayo enzimático.
         Bacillus cereus, Clostridium perfringens y S. aureus. Las heces de pacientes
         con intoxicación alimentaria, así como las muestras de alimentos, cultivos de
         personas que manipulan alimentos y cualquier otro material potencialmente
         infeccioso, deben remitirse a un centro de referencia para su aislamiento e
         identificación.
         E. coli enteropatogénica, enteroinvasiva, enterotoxigénica o enteroadherente.
         No se disponen de medios selectivos específicos. Se pueden seleccionar
         cincocolonias de los medios convencionales, aislarlas y remitirlas a un
         laboratorio de referencia para su identificación.

Reporte de resultados

Cultivos negativos.
      Reportar “No seaisló Salmonella, Shigella, Campylobacter, etc.”,
       mencionandotodos los microorganismos utilizados en el tamizaje.
      No reportar “Nopatógenos entéricos”, porque es muy ambiguo y puede
       conducir a equivocaciones.

Cultivos Positivos.
       Si hay sobrecrecimiento de S.aureus, P. aeruginosa o Candida spp16., reportar
         “predominancia o cultivo puro de (género y especiesi es posible)”
       Reportes presuntivos de Salmonella y Shigella: de acuerdo con el resultado de
       las pruebas bioquímicas preliminares y la reacción serológica (por ej.,
       aglutinación positiva en un serogrupo.

       Reportes finales: basados en los resultados finales provenientes del laboratorio
        de referencia después de la identificación serológica completa.
       Reportar la presencia o ausencia de toxinas A y B (citotoxina) de C. difficile, de
        acuerdo con los resultados del inmunoensayo utilizado. El aislamiento por sí

15
     Agar entérico de Hektoen (HE)
16
     Indica que se trata de varias especies del mismo género (spp)
solo no es significativo dado que es parte de la flora normal
       Reportar “Cultivo negativo por E. coli O157:H7.” o por el serotipo investigado
       La notificación inmediata al médico depende de la política del laboratorio, la
        organización y el sistema de comunicación. Los aislamientos de V.cholerae o
        S. typhi requieren notificación personal inmediata.
       El aislamiento de Campylobacter spp., E. coli patogénica, Salmonella spp.,
        Shigella spp., Vibrio spp. o Yersinia spp. debe reportarse al epidemiólogo o
        comité de epidemiología del hospital, así como a las autoridades responsables
        de salud pública, para que se tomen las medidas higiénicas preventivas
        correspondientes.


             Procesamiento de BAAR (Micobacterias y Tuberculosis)

En el procesamiento analítico microbiológico de una muestra para cultivo, aislamiento
e identificación de micobacterias, (sobre todo esputo y orina) hay un dato muy
importante a tener en cuenta: las micobacterias clínicamente importantes son
microorganismos de crecimiento muy lento, dando por lo general colonias visibles en
medios de cultivo apropiados no antes de siete días; lo cual permite que el crecimiento
de otros microorganismos de crecimiento normal enmascare e inhiba el crecimiento de
las micobacterias.
                          Para evitar esto, todo proceso de cultivo de micobacterias
                          lleva asociado un procedimiento previo de descontaminación
                          en el que eliminamos microorganismos no deseados. La
                          descontaminación puede llevarse a cabo con un ácido, un
                          álcali o cualquier compuesto descontaminante. La sosa, a
                          concentraciones del l al 4% es uno de los más utilizados. A
                          pesar de que las micobacterias son muy resistentes a estos
agentes, tras un proceso de descontaminación solo quedan viables de un 10 a un 20%
de la población inicial de micobacterias.
De la misma forma, al ser las micobacterias microorganismos de crecimiento
intracelular y quedar en muchas ocaciones englobadas en el espesor de la secrección
mucosa a que dan lugar (sobre todo la bronquial), es necesario un procedimiento de
fluidificación y homogeneización del producto estudiado para garantizar una óptima
recuperación de dichos microorganismos en caso de que se encuentren presentes.
Para esto se utilizan sustancias mucolíticas como la N-acetil cisteína o detergentes
como el lauril sulfato sódico.
Los líquidos normalmente estériles (LCR17, líquidos articulares, pleurales, etc.) no
necesitan proceso de homogeneización ni descontaminación. Únicamente sería
necesario un proceso de concentración previo a la siembra.

Método del Lauril sulfato de sosa
Es uno de los menos nocivos para las micobacterias, porque se utiliza menor
concentración de sosa que en otros. Son necesarios 2 reactivos, que denominaremos
A y B.
El reactivo A es una solución de lauril sulfato de sodio e hidróxido sódico que hará las
funciones de descontaminante y fluidificante. Tras mezclar la muestra con el reactivo
A, se homogeiniza por agitación, tras lo cual se deja reposar a temperatura ambiente
durante media hora. Pasado ese tiempo se neutraliza la alcalinidad con un reactivo B
(compuesto por un ácido y un indicador) hasta el cambio de color a amarillo pálido
persistente.
Después de una centrifugación intensa (3000 rpm durante 20 minutos) se decanta y se
siembra el sedimento.

17
     Liquido Cefalo Raquideo (L.C.R)
Características microscópicas y de tinción
La presencia de ácido micólico en la pared de lasmicobacterias
les confiere una resistencia a la solución de alcohol ácido que
los diferencia del resto de las bacterias.
Aprovechando esta propiedad se desarrolló una tinción
específica para bacterias ácido alcohol resistentes.
Con la tinción de Ziehl-Neelsen las micobacterias se observan
como bacilos de color rojo. Aparecen individualmente o formando pequeños grupos.
Otras tinciones utilizadas para poner de manifiesto estos microorganismos son la
tinción de Kinyoun, la de Tan-Thiam-Hok o la tinción fluorescente de auramina-
rodamina.

Baciloscopias
Todas las muestras deben ser examinadas mediante tinción de Ziehl-Neelsen antes de
proceder a su descontaminación. Aunque el hallazgo de BAAR18 en un frotis no es un
diagnóstico definitivo de infección micobacteriana, permite un diagnóstico presuntivo
muy precoz de tuberculosis.
Una buena baciloscopia comienza con la realización de un buen
frotis. Debe realizarse a partir de la parte más purulenta del
esputo, efectuándose una extensión de grosor adecuado. La
fijación debe hacerse durante 30 minutos al calor seguido de
alcohol metílico.
La observación debe hacerse siempre con objetivo de inmersión,
recomendándose hacer una valoración cuantitativa de los bacilos presentes en la
muestra.
Se observará todo un largo de la extensión finalizando el recuento si hay más de 10
bacilos por línea. Si hay menos de 10 bacilos por línea se efectuará el recuento en dos
líneas más y se expresará el resultado como bacilos x 3L
Si en la primera línea realizamos un recuento de más de 50 bacilos, no se continua el
recuento y se informa como más de 50 BAAR19 / 1 L
Otra forma de informar los recuentos cuantitativos de BAAR es la siguiente:

Ausencia de BAAR 0
De 1 a 9 BAAR / 1L Nº de bacilos
De 10 a 99 BAAR /1L +
De 1 a 10 BAAR / campo ++
Más de 10 BAAR / campo +++

Características de cultivo

Las micobacterias son muy exigentes desde el punto de vista nutritivo y se cultivan
con relativa lentitud y dificultad en el laboratorio.
Los bacilos de la tuberculosis son aerobios estrictos. Crece mejor a 37ºC, y el
crecimiento es nulo por debajo de 30ºC o a temperaturas superiores a 42ºC.
Los medios pueden ser líquidos o sólidos; los medios líquidos tienen poco interés para
especímenes muy contaminados como esputos y orinas. Se podrían utilizar, siempre
junto con los medios de base de huevo, en muestras poco contaminadas tales como
líquido pleural, sinovial, L.C.R.20 o en determinados especímenes como médula ósea o
biopsias. Otra utilidad de este tipo de medios es el mantenimiento de cepas o estudios
de CMI de drogas.

18
   Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR)
19
   Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR)
20
   Liquido Cefalo Raquideo (L.C.R)
Para el cultivo y aislamiento de micobacterias pueden utilizarse diferentes tipos de
medios:
- Medios enriquecidos: (Lowenstein-Jensen, Coletsos, Middlebrock, Caldo 7H9...)
- Medios selectivos: 7H11
- Medios diferenciales, que permiten la diferenciación entre micobacterias atípicas y
Mycobacterium tuberculosis

Los medios más utilizados son los enriquecidos, que pueden tener base de huevo
como el Lowenstein-Jensen o base de agar como el Middlebrock.
El cultivo de micobacterias en medio sólido debe hacerse en tubo para evitar la
desecación del medio durante el largo período de incubación. Los tubos se incuban
casi en horizontal, a 35º C, en oscuridad y en atmósfera húmeda con un 5 - 10% de
CO2 durante la primera semana, para luego pasar a una atmósfera normal. Es
conveniente que los tapones estén desenroscados hasta que se evapore el agua que
contienen los tubos, ya que ésta puede impedir la aparición de la morfología colonial
típica de las micobacterias.
Mycobacterium tuberculosis crece en medio de L-J dando lugar a colonias rugosas, de
aspecto cerebroide, excrecentes y de color marfil; M. bovis da lugar a colonias lisas.

Las pruebas bioquímicas que nos permiten diferenciar estas dos especies quedan
resumidas en la tabla siguiente:
                            Red. de    Sensibilidad a         Sensibilidad a
                 Niacina
                             nitrato    Pirazinamida            Hidracina
     M.
                      +          +                  +                        -
 Tuberculosis
      M. Bovis        -          -                  -                        +

Antibiograma
El procedimiento para la realización del antibiograma de M. tuberculosis más utilizado
en todo el mundo es el de Canetti, Rist y Grosset. Consiste en determinar la
proporción de bacilos resistentes a una determinada droga que existe en la población
bacteriana inicial (cepa). Para ello, se dispone de una serie de tubos con medios de
Löwenstein y las diversas drogas, incorporadas a unas concentraciones previamente
establecidas. Se inoculan dos series de tubos, con dos diluciones de una suspensión
bacilar, así como unos tubos testigo sin drogas incorporadas.
En los tubos testigo se obtiene el crecimiento correspondiente al total de la población
bacteriana inoculada. Las colonias crecidas en los tubos que
contienen droga indicarán el número de bacilos resistentes a dicha
droga en la población analizada.
La suspensión bacteriana se prepara tomando unas colonias
representativas de la mayor parte de la cepa a estudiar, se depositan
en un tubo conteniendo perlas de vidrio, y se añade agua destilada
hasta obtener una turbidez equivalente a la proporcionada por una suspensión de
BCG21 de 1 mg/ml. A partir de aquí se preparan dos diluciones en agua destilada
estéril al 1/1000 y al 1/100000. Se inoculan en los tubos correspondientes 0,2 ml de
las diluciones así preparadas. Los tubos se depositan en posición horizontal en la
estufa a 37ºC y se leen a los 21 y los 28 días. Se cuentan las colonias aparecidas en
los tubos testigo y, si existen, en los tubos conteniendo las drogas.
Si el crecimiento en los tubos con drogas es superior a la proporción crítica en relación
con el crecimiento en los testigos, la cepa se considera resistente, y si es inferior,
sensible.


21
     Bacillus de Calmette y Guérin (BCG)

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Procesamiento de las muestras microbiológicas

  • 1. Procesamiento de las Muestras Microbiológicas (Urocultivos, Heces y BAAR) Procesamiento. Consiste en la preparación de las muestras, la realización de tinciones, y la inoculación en los medios de cultivo para su posterior incubación. En este proceso es preciso considerar: a) el tipo de muestra enviada b) el diagnóstico clínico del paciente c) la petición solicitada. El tipo de muestra enviada determina si requiere o no pretratamiento (centrifugación, homogeneización) previo a la inoculación de los medios de cultivo. La información clínica del paciente es fundamental para la selección de los medios de cultivo a inocular y su posterior incubación. De modo general, en función del tipo de muestra, el laboratorio utiliza unos medios de cultivo primarios que permiten el aislamiento de la mayoría de los agentes etiológicos más frecuentes de los distintos procesos infecciosos. Sin embargo, en ocasiones el síndrome clínico puede estar causado por microorganismos poco frecuentes cuyo aislamiento requiere el uso de medios de cultivo específicos y/o selectivos no habituales. La sospecha de la participación de alguno de estos microorganismos poco habituales, debe comunicarse al laboratorio. Igualmente, el laboratorio debe dar a conocer a los clínicos de su institución qué microorganismos investiga rutinariamente y cuáles debe especificar en la petición (cartera de servicios o catálogo de pruebas). Aunque el aislamiento por cultivo y continúa siendo una las técnicas más frecuentemente empleadas en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, existen en la actualidad otras técnicas cuya principal ventaja sobre el cultivo es la rapidez diagnóstica. Contenido mínimo de los estudios microbiológicos. El alcance de un estudio microbiológico se refiere al conjunto de requisitos, en cuanto a tipo de muestras, estudios a realizar y métodos a emplear, que debe tener dicho estudio para que su utilización sea adecuada. A continuación se definen los contenidos mínimos para los estudios bacteriológicos más frecuentes. Algunos son fáciles de delimitar y se consideran obligados, mientras que otros pueden considerarse optativos y podrían ser motivo de opinión entre los profesionales. Orinas a) Estudios obligados: Cultivo cuantitativo, identificación y estudio de sensibilidad de gramnegativos. Cultivo cuantitativo de levaduras. Se debe realizar un sedimento de orina (principalmente para la determinación de piuria). Si esta prueba no se realiza en el laboratorio de Microbiología es conveniente indicar al clínico la necesidad de solicitarlo para evaluar correctamente el resultado del urocultivo. b) Estudios optativos: Pruebas de cribado como prueba adicional al urocultivo. Observación microscópica directa (examen en fresco o tras tinción). Pruebas de sensibilidad de levaduras a antifúngicos.
  • 2. Heces a) Estudios obligados: Cultivo en medios adecuados para el aislamiento, identificación y estudio de sensibilidad de bacterias de los géneros Salmonella, Shigella, Yersinia, Aeromonas, Vibrio (incluyendo Vibrio cholerae) y Campylobacter. La utilización adicional de medios específicos para el cultivo de Aeromonas, Yersinia y Vibrio solamente se realizará tras valoración previa de su necesidad en cada laboratorio o en situaciones en las que se sospeche una epidemia. Serotipificación básica de Salmonella y Shigella (serogrupo). Detección de la(s) toxina(s) de Clostridiumdifficile en heces, o el cultivo de C. difficile con demostración de la toxigenicidad de las cepas a partir de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis en los que se solicite (principalmente pacientes hospitalizados). b) Estudios optativos: Detección de cepas de Escherichia coli diarreagénicas (principalmente de E. coli O157:H7). Observación microscópica directa de heces (tinción de Gram o azul de metileno para observación de leucocitos). Microorganismos más comunes y técnicas rápidas para su detección. En la actualidad existen múltiples equipos comercializados para la detección de numerosos microorganismos en determinadas muestras clínicas que han demostrado utilidad. Microorganismos con técnica rápida disponible para su detección en muestras clínicas Microorganismos Muestras Técnicas disponibles Bacterias 1 2 Streptococcuspneumoniae LCR, orina, muestras respiratorias Aglutinación (LCR ), IC (orina) 3 4 Legionellapneumophila Muestras respiratorias, orina IFD (respiratorias), IC, EIA (orina) Clostridiumdifficile Heces Aglutinación, EIA Virus Rotavirus Heces IC, Aglutinación Adenovirus Heces, muestras respiratorias IC (heces, respiratorias), Aglutinación (heces), IFD (respiratorias) Parásitos Cryptosporidium Heces Tinción de ácido-alcohol resistencia Giardia+Cryptosporidium Heces IFD Entamoebahistolityca Heces EIA 1 Líquido cefalorraquídeo (LCR) 2 Inmunocromatografía (IC) 3 Inmunofluorescencia directa (IFD) 4 Enzimoinmunoanálisis (EIA)
  • 3. Procesamiento de Urocultivos (Orina). Pruebas de tamizaje. Se han diseñado diversos métodos rápidos de tamizaje, automatizados y no automatizados, para determinar si la muestra de orina contiene bacterias y/o leucocitos en cantidades significativas. Detección de bacteriuria. Tinción de Gram. 1. Colocar 10 µl de la muestra de orina, bien mezclada pero sin centrifugar, sobre un portaobjetos. 2. Permitir secar al aire sin esparcir sobre la superficie del portaobjetos. 3. Fijar la lámina al calor. 4. Teñir por Gram. 5. Determinar y reportar el número de microorganismos por campo de inmersión. 6. La presencia de uno o más microorganismos por campo de inmersión correlaciona con un recuento de colonias de ≥105 UFC5/ml. 7. La presencia de abundantes células escamosas y diferentes morfotipos microbianos son indicativos de que la muestra ha sido probablemente contaminada durante la recolección. En este caso, se debe solicitar una segunda muestra. Tinción con naranja de acridina. 1. Preparar un frotis como se indicó para la tinción de Gram. 2. Realizar una tinción con naranja de acridina. 3. Determinar el número de microorganismos por campo de ×400 utilizando un microscopio de fluorescencia. En caso de una morfología dudosa, se puede examinar el frotis con una magnificación de ×1000. 4. La presencia de uno o más microorganismos por campo de inmersión correlaciona con un recuento de colonias de ≥ 105 UFC/ml. Detección de piuria. Análisis del sedimento urinario. El análisis de sedimento urinario por la presencia de leucocitos polimorfonucleares es válido siempre y cuando el procedimiento se haya estandarizado con respecto al volumen de orina centrifugada, la velocidad y el tiempo de centrifugación y el volumen en el cual se resuspende el sedimento. Cultivo de muestras de orina. Recuento por dilución en tubo. 1. Añadir 0.1 ml de la muestra de orina (bien mezclada y sin centrifugar) a 9.9 ml de solución salina estéril (10-2). 2. Mezclar bien y transferir 0.1 ml de esta dilución a cada una de las placas con 5 Unidad formadora de colonias (UFC)
  • 4. medio (l0-3). 3. Distribuir bien el inóculo sobre la superficie del agar utilizando un asa estéril o una espátula de Drigalski. 4. Incubar las placas de los medios inoculados a 35 a 37ºCpor 18-24 horas. Las placas de agar sangre deben ser incubadas en jarra con candela. 5. Luego del periodo de incubación determinar el número de colonias en la superficie y el número de UFC/ml multiplicando el número de colonias por el factor de dilución (l03). Recuento por inoculación directa con asa calibrada. 1. Introducir verticalmente un asa calibrada de 0.01 ml (10 µl) o de 0.001 ml (1 μl) estéril justamente por debajo de la superficie de la muestra de orina (bien mezclada y sin centrifugar). 2. Inocular por estría sobre toda la superficie del medio de cultivo. 3. Sin flamear nuevamente el asa, repetir el procedimiento para el segundo medio de cultivo a utilizar. 4. Incubar las placas de los medios inoculados a 35 a 37ºCpor 18-24 horas. Las placas de agar sangre deben ser incubadas en jarra con candela. 5. Luego del período de incubación determinar el número de colonias en la superficie del medio de cultivo y el número de UFC6/ml multiplicando el número de colonias por el factor de dilución (102 para un inóculo de 0.01 ml [una colonia representa 100 UFC/ml], 103 para un inóculo de 0,001 ml [una colonia representa 1,000 UFC/ml]). Examen de los medios de cultivo. 1. Examinar las placas que han sido incubadas a 35 a 37ºCpor 18-24 horas. 2. Si no se observa crecimiento y la muestra ha sido recolectada por micción o por cateterización, reportar: “No se observa crecimiento > 103 UFC/ml”,si se inocularon las placas por dilución en tubo (10 -3) o con asa calibrada de 1 µl.. “No se observa crecimiento > 102 UFC/ml”,si se inocularon las placas con asa calibrada de 10 µl. 3. Si no se observa crecimiento y la muestra fue recolectada por punción suprapúbica, incubar las placas por 18-24 horas adicionales. 4. Si se observan colonias muy pequeñas o diminutas, incubar las placas por 18-24 horas adicionales. 5. Si no se observa crecimiento y este resultado no correlaciona con lo observado en la tinción de Gram de la muestra o con la condición clínica del paciente, incubar las placas por 18-24 horas adicionales. 6. Sin tampoco se observa crecimiento luego de una incubación de 48 horas y este resultado no correlaciona con lo observado en la tinción de Gram de la muestra o con la condición clínica del paciente, solicitar una muestra de orina recolectada por punción suprapúbica para hacer un cultivo para bacterias anaerobias. 7. Si se observa crecimiento, examine los cultivos por número de colonias (UFC/ml) y por los diferentes morfotipos coloniales. Interpretación de los resultados. 1. El criterio de un recuento de ≥105 UFC/ml se puede aplicar a la mayoría de las muestras de orina recolectadas por micción y enviadas para cultivo. 2. En el caso de recuentos inferiores a 105 UFC/ml se puede aplicar la siguiente guía de análisis de los resultados: 6 Unidad formadora de colonias (UFC)
  • 5. Recuento Condición Organismos Procedimiento a seguir Tipo de muestra ≥ 105 Orina por micción Cultivo puro Identificación y PSA ≥ 105 Orina por micción Dos morfotipos Identificación y PSA Sintomatología positiva coloniales ≥ 105 Más de dos morfotipos Posible contaminación coloniales Reportar posible contaminación y solicitar nueva muestra 104 Orina por Dos morfotipos Identificación y PSA cateterizaciónSintomatología coloniales 104 positiva Más de dos morfotipos Posible contaminación coloniales Reportar posible contaminacióny solicitar 10³ nueva muestra 10³ Cultivo puro Identificación y PSA 10² Orina por cateterización Cultivo puro Identificación y PSA Hombre sintomático Cualquier número de Identificación y PSA Punción suprapúbica morfotipos 10² Cultivo puro de bacilo Identificación y PSA Mujer sintomática Gram-negativo Procesamiento de Copros (Heces). Procedimientos. Exámendirecto. Un examen al fresco de una muestra de heces sin teñir es útil para detectar parásitos y, con experiencia, las formas curvas y con movilidad en dardo de Campylobacter y Vibrio cholerae a partir de heces frescas. Estos últimos se pueden observar mejor en microscopios de campo oscuro o contraste de fases. Examen a fresco con azul de metileno. Seleccionar una porción de material fecal de un área con sangre y moco y mezclar con una gota del colorante de azul de metileno de Loeffler (azul de metileno al 0.3% en etanol al 30%) por 2-3 minutos observar en alto poder seco. El predominio de polimorfonucleares indica la presencia de un posible patógeno invasivo, mientras que el predominio de monocitos se asocia con infecciones por Salmonella typhi. Tinción de Gram. Preparar un frotis delgado del material fecal y realizar una tinción de Gram. Observar predominio de polimorfonucleares, levaduras, cocos Gram -positivos o bacilos Gram-negativos, lo cual puede sugerir una infección por Candida, S. aureus o Pseudomonas, respectivamente. El predominio de bacilos Gram- positivos largos, rectos y con paredes paralelas puede sugerir sobrecrecimiento de Clostridium difficile, aun cuando no es una prueba totalmente confiable de la infección. La tinción de Gram modificada con fucsina básica al 0.1% permite la observación de bacilos Gram-negativos delgados, en forma de coma, ese (S) o en alas de gaviota, sugestivos de infección por Campylobacter spp.
  • 6. Cultivo primario de rutina. Aislamiento de Salmonella sp7. y Shigella sp8. Las muestras que se reciben para la detección de éstos patógenos deben cultivarse en un medio de enriquecimiento, un medio de soporte, un medio levemente selectivo-diferencial, y un medio moderadamente selectivo. Los medios más comúnmente recomendados, de acuerdo con las posibilidades del laboratorio, son los siguientes: Medio de soporte: agar sangre (agar tripticasa-soya con 5% de sangre). Medio diferencial: agar MacConkey o agar eosina-azul de metileno de Levine. Moderadamente selectivo: agar Hektoen, agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), agar Salmonella-Shigella (SS). Con el fin de aumentar la probabilidad de aislar alguno de estos agentes se pueden utilizar los siguientes caldos: Caldo GN: la muestra se inocula en el caldo, se incuba a 35°C estrictamente por 4 a 6 horas y se subcultiva a medios diferenciales y selectivos. Caldo Selenito F y caldo tetrationato: la muestra se inocula en el caldo, se incuba a 35°C por 12 horas y se subcultiva a medios diferenciales y selectivos. Las placas se inoculan directamente con una asada de la muestra de heces, con el hisopo rectal o del medio de transporte, o a partir de los caldos de enriquecimiento, se rayan con asa y se incuban a 35°Cpor 18-24 h. Las colonias que se deben buscan son lactosa negativa con o sin H2S, las cuales se inoculan por picadura y/o rayado a TSI y urea. Aislamiento de Campylobacter sp9. El aislamiento de Campylobacter recae sobre la selectividad del medio, la cual depende de los agentes antimicrobianos en el medio, el ambiente microaerofilico (5%O2, 10% CO2 y 85%N2) y la temperatura de incubación a 42°C, los cuales suprimen el crecimiento de la mayoría de bacterias comensales. Las muestras negativas por leucocitos no son procesadas por Campylobacter. La muestra debe cultivarse en alguno de los medios comerciales recomendados: Agar Blaser Agar Skirrow Agar Butzler Agar Preston La atmósfera microaerofilica se puede generar utilizando una jarra y un sobre para anaerobiosis, por evacuación y reemplazo de mezcla de gases o por medio de Bio- Bags con generadores de gas. Debe hacerse una revisión de las placas a las 24, 48 y hasta 72 horas buscando las colonias sospechosas. Las colonias son pequeñas, convexas, translúcidas, grisáceas y asemejan una gota de agua. La identificación presuntiva de las colonias incluye una tinción de Gram modificado con fucsina básica al 0.1% y la observación de las formas de “S” o en alas de gaviota. La prueba de oxidasa debe ser positiva y se puede observar la movilidad en dardo resuspendiendo el microorganismo en un caldo Mueller-Hinton y observando a 40X entre porta y cubreobjetos. 7 No se ha determinado la especie (sp) 8 Indica que se trata de varias especies del mismo género (spp) 9 No se ha determinado la especie (sp)
  • 7. Aislamiento de Aeromonas spp10. Aeromonas spp. causa una diarrea acuosa que se ha asociado con ingestión de agua no potable. Debe descartarse Aeromonas spp. si la historia del paciente o los síntomas sugieren una fuente de infección de este tipo. Aeromonas spp. crece en los medios de rutina, pero existe un medio selectivo apropiado para su detección. Las muestras se cultivan en: Agar sangrecon10 xg de ampicilina /ml. MAC11 o EMB12 Las placas se incuban a 35°C por 24 horas en aerobiosis. Investigar las placas por colonias con o sin hemólisis beta que no sean Pseudomonas y realizar prueba de oxidasa, la cual debe ser positiva. En el medio MAC o EMB se obtienen colonias lactosa negativa. Cultivo primario de patógenos especiales. Aislamiento de Vibrio sp.13 Las muestras sospechosas por Vibrio cholerae se cultivan en agar TCBS14 y agar sangre, los cuales se incuban a 35°C por 24 horas. Para el enriquecimiento se utiliza el agua peptonada alcalina, la cual se debe incubar de 5a 8 horas a 35°C para luego subcultivar a agar TCBS y agar sangre. Las colonias sospechosas son aquellas que presentan una coloración amarilla en el agar TCBS y una hemólisis beta en el agar sangre.En el agar TCBS algunos coliformes, como Proteus sp. y enterococos pueden crecer. A las colonias sospechosas se les practica: Tinción de Gram, observando los bacilos característicos en forma de coma. Prueba de oxidasa del agar sangre, la cual debe ser positiva. Prueba de hilo mucoide: suspender colonias (obtenidas de un medio no inhibitorio) en una gota de solución acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%.Si el resultado es positivo, las células bacterianas se lisan por efecto del desoxicolato, el ADN liberado ocasionará que la mezcla se haga viscosa. Al retirar lentamente de la suspensión el asa, se forma un “hilo” mucoide. La mayor parte de Vibrio spp. son positivos, en tanto que las cepas de Aeromonas sp. suelen ser negativas. Identificación serológica: el uso de antisueros es uno de los métodos más rápidos y específicos para la identificación de Vibrio cholerae O1 y O139.. Perfil completo de reacciones bioquímicas, en forma manual o automatizada. Aislamiento de Yersinia sp. Son bacilos Gram-negativos miembros de Enterobacteriaceae que no fermentan lactosa, crecen mejor a 25°Cy son móviles a esta misma temperatura y no a 37°C. El procesamiento incluye los siguientes medios: Medio selectivo: agar cefsulodin-irgasan-novobiocin (CIN), en el cual Yersinia produce colonias rojo oscuro con bordes 10 Indica que se trata de varias especies del mismo género (spp) 11 Agar McConkey (MAC) 12 Eosina azul de metileno (EMB) 13 No se ha determinado la especie (sp) 14 Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa (TCBS)
  • 8. transparentes. Enriquecimiento en frío: inocular la muestra en buffer salino de fosfato (pH 7,6) de 4 a 5°Cpor 3 semanas y subcultivar a intervalos de una semana en MAC. Agar HE15: produce colonias amarillas pequeñas. Aislamiento de E. coli enterohemorrágica serotipo O157:H7. En el ámbito de laboratorio es muy dificil diferenciar las variantes de Escherichia coli, con excepción de la mayoría de cepas de E. coli enterohemorrágica O157:H7 (ECEH). Se utiliza como medio diferencial el MAC-sorbitol, en el cual esta bacteria es incapaz de hidrolizar sorbitol y produce colonias incoloras, sorbitol-negativo. No obstante, es importante indicar que existen otras bacterias entéricas sorbitol negativo por lo que la presencia de colonias negativas al sorbitol no es diagnóstica de ECEH. Por consiguiente, el clínico debe basarse en los síntomas y la historia clínica para solicitar un estudio por un serotipo específico de E. coli, y someter toda muestra de heces con sangre a análisis por ECEH. Otros agentes de enfermedad del tracto gastrointestinal. Clostridíum dfficile. Debe inocularse un medio selectivo (cicloserina-cefoxitina- fructosa-yema de huevo) y realizarse un ensayo para detectar las toxinas, por medio de aglutinación en látex o inmunoensayo enzimático. Bacillus cereus, Clostridium perfringens y S. aureus. Las heces de pacientes con intoxicación alimentaria, así como las muestras de alimentos, cultivos de personas que manipulan alimentos y cualquier otro material potencialmente infeccioso, deben remitirse a un centro de referencia para su aislamiento e identificación. E. coli enteropatogénica, enteroinvasiva, enterotoxigénica o enteroadherente. No se disponen de medios selectivos específicos. Se pueden seleccionar cincocolonias de los medios convencionales, aislarlas y remitirlas a un laboratorio de referencia para su identificación. Reporte de resultados Cultivos negativos. Reportar “No seaisló Salmonella, Shigella, Campylobacter, etc.”, mencionandotodos los microorganismos utilizados en el tamizaje. No reportar “Nopatógenos entéricos”, porque es muy ambiguo y puede conducir a equivocaciones. Cultivos Positivos. Si hay sobrecrecimiento de S.aureus, P. aeruginosa o Candida spp16., reportar “predominancia o cultivo puro de (género y especiesi es posible)” Reportes presuntivos de Salmonella y Shigella: de acuerdo con el resultado de las pruebas bioquímicas preliminares y la reacción serológica (por ej., aglutinación positiva en un serogrupo.  Reportes finales: basados en los resultados finales provenientes del laboratorio de referencia después de la identificación serológica completa.  Reportar la presencia o ausencia de toxinas A y B (citotoxina) de C. difficile, de acuerdo con los resultados del inmunoensayo utilizado. El aislamiento por sí 15 Agar entérico de Hektoen (HE) 16 Indica que se trata de varias especies del mismo género (spp)
  • 9. solo no es significativo dado que es parte de la flora normal  Reportar “Cultivo negativo por E. coli O157:H7.” o por el serotipo investigado  La notificación inmediata al médico depende de la política del laboratorio, la organización y el sistema de comunicación. Los aislamientos de V.cholerae o S. typhi requieren notificación personal inmediata.  El aislamiento de Campylobacter spp., E. coli patogénica, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp. o Yersinia spp. debe reportarse al epidemiólogo o comité de epidemiología del hospital, así como a las autoridades responsables de salud pública, para que se tomen las medidas higiénicas preventivas correspondientes. Procesamiento de BAAR (Micobacterias y Tuberculosis) En el procesamiento analítico microbiológico de una muestra para cultivo, aislamiento e identificación de micobacterias, (sobre todo esputo y orina) hay un dato muy importante a tener en cuenta: las micobacterias clínicamente importantes son microorganismos de crecimiento muy lento, dando por lo general colonias visibles en medios de cultivo apropiados no antes de siete días; lo cual permite que el crecimiento de otros microorganismos de crecimiento normal enmascare e inhiba el crecimiento de las micobacterias. Para evitar esto, todo proceso de cultivo de micobacterias lleva asociado un procedimiento previo de descontaminación en el que eliminamos microorganismos no deseados. La descontaminación puede llevarse a cabo con un ácido, un álcali o cualquier compuesto descontaminante. La sosa, a concentraciones del l al 4% es uno de los más utilizados. A pesar de que las micobacterias son muy resistentes a estos agentes, tras un proceso de descontaminación solo quedan viables de un 10 a un 20% de la población inicial de micobacterias. De la misma forma, al ser las micobacterias microorganismos de crecimiento intracelular y quedar en muchas ocaciones englobadas en el espesor de la secrección mucosa a que dan lugar (sobre todo la bronquial), es necesario un procedimiento de fluidificación y homogeneización del producto estudiado para garantizar una óptima recuperación de dichos microorganismos en caso de que se encuentren presentes. Para esto se utilizan sustancias mucolíticas como la N-acetil cisteína o detergentes como el lauril sulfato sódico. Los líquidos normalmente estériles (LCR17, líquidos articulares, pleurales, etc.) no necesitan proceso de homogeneización ni descontaminación. Únicamente sería necesario un proceso de concentración previo a la siembra. Método del Lauril sulfato de sosa Es uno de los menos nocivos para las micobacterias, porque se utiliza menor concentración de sosa que en otros. Son necesarios 2 reactivos, que denominaremos A y B. El reactivo A es una solución de lauril sulfato de sodio e hidróxido sódico que hará las funciones de descontaminante y fluidificante. Tras mezclar la muestra con el reactivo A, se homogeiniza por agitación, tras lo cual se deja reposar a temperatura ambiente durante media hora. Pasado ese tiempo se neutraliza la alcalinidad con un reactivo B (compuesto por un ácido y un indicador) hasta el cambio de color a amarillo pálido persistente. Después de una centrifugación intensa (3000 rpm durante 20 minutos) se decanta y se siembra el sedimento. 17 Liquido Cefalo Raquideo (L.C.R)
  • 10. Características microscópicas y de tinción La presencia de ácido micólico en la pared de lasmicobacterias les confiere una resistencia a la solución de alcohol ácido que los diferencia del resto de las bacterias. Aprovechando esta propiedad se desarrolló una tinción específica para bacterias ácido alcohol resistentes. Con la tinción de Ziehl-Neelsen las micobacterias se observan como bacilos de color rojo. Aparecen individualmente o formando pequeños grupos. Otras tinciones utilizadas para poner de manifiesto estos microorganismos son la tinción de Kinyoun, la de Tan-Thiam-Hok o la tinción fluorescente de auramina- rodamina. Baciloscopias Todas las muestras deben ser examinadas mediante tinción de Ziehl-Neelsen antes de proceder a su descontaminación. Aunque el hallazgo de BAAR18 en un frotis no es un diagnóstico definitivo de infección micobacteriana, permite un diagnóstico presuntivo muy precoz de tuberculosis. Una buena baciloscopia comienza con la realización de un buen frotis. Debe realizarse a partir de la parte más purulenta del esputo, efectuándose una extensión de grosor adecuado. La fijación debe hacerse durante 30 minutos al calor seguido de alcohol metílico. La observación debe hacerse siempre con objetivo de inmersión, recomendándose hacer una valoración cuantitativa de los bacilos presentes en la muestra. Se observará todo un largo de la extensión finalizando el recuento si hay más de 10 bacilos por línea. Si hay menos de 10 bacilos por línea se efectuará el recuento en dos líneas más y se expresará el resultado como bacilos x 3L Si en la primera línea realizamos un recuento de más de 50 bacilos, no se continua el recuento y se informa como más de 50 BAAR19 / 1 L Otra forma de informar los recuentos cuantitativos de BAAR es la siguiente: Ausencia de BAAR 0 De 1 a 9 BAAR / 1L Nº de bacilos De 10 a 99 BAAR /1L + De 1 a 10 BAAR / campo ++ Más de 10 BAAR / campo +++ Características de cultivo Las micobacterias son muy exigentes desde el punto de vista nutritivo y se cultivan con relativa lentitud y dificultad en el laboratorio. Los bacilos de la tuberculosis son aerobios estrictos. Crece mejor a 37ºC, y el crecimiento es nulo por debajo de 30ºC o a temperaturas superiores a 42ºC. Los medios pueden ser líquidos o sólidos; los medios líquidos tienen poco interés para especímenes muy contaminados como esputos y orinas. Se podrían utilizar, siempre junto con los medios de base de huevo, en muestras poco contaminadas tales como líquido pleural, sinovial, L.C.R.20 o en determinados especímenes como médula ósea o biopsias. Otra utilidad de este tipo de medios es el mantenimiento de cepas o estudios de CMI de drogas. 18 Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) 19 Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) 20 Liquido Cefalo Raquideo (L.C.R)
  • 11. Para el cultivo y aislamiento de micobacterias pueden utilizarse diferentes tipos de medios: - Medios enriquecidos: (Lowenstein-Jensen, Coletsos, Middlebrock, Caldo 7H9...) - Medios selectivos: 7H11 - Medios diferenciales, que permiten la diferenciación entre micobacterias atípicas y Mycobacterium tuberculosis Los medios más utilizados son los enriquecidos, que pueden tener base de huevo como el Lowenstein-Jensen o base de agar como el Middlebrock. El cultivo de micobacterias en medio sólido debe hacerse en tubo para evitar la desecación del medio durante el largo período de incubación. Los tubos se incuban casi en horizontal, a 35º C, en oscuridad y en atmósfera húmeda con un 5 - 10% de CO2 durante la primera semana, para luego pasar a una atmósfera normal. Es conveniente que los tapones estén desenroscados hasta que se evapore el agua que contienen los tubos, ya que ésta puede impedir la aparición de la morfología colonial típica de las micobacterias. Mycobacterium tuberculosis crece en medio de L-J dando lugar a colonias rugosas, de aspecto cerebroide, excrecentes y de color marfil; M. bovis da lugar a colonias lisas. Las pruebas bioquímicas que nos permiten diferenciar estas dos especies quedan resumidas en la tabla siguiente: Red. de Sensibilidad a Sensibilidad a Niacina nitrato Pirazinamida Hidracina M. + + + - Tuberculosis M. Bovis - - - + Antibiograma El procedimiento para la realización del antibiograma de M. tuberculosis más utilizado en todo el mundo es el de Canetti, Rist y Grosset. Consiste en determinar la proporción de bacilos resistentes a una determinada droga que existe en la población bacteriana inicial (cepa). Para ello, se dispone de una serie de tubos con medios de Löwenstein y las diversas drogas, incorporadas a unas concentraciones previamente establecidas. Se inoculan dos series de tubos, con dos diluciones de una suspensión bacilar, así como unos tubos testigo sin drogas incorporadas. En los tubos testigo se obtiene el crecimiento correspondiente al total de la población bacteriana inoculada. Las colonias crecidas en los tubos que contienen droga indicarán el número de bacilos resistentes a dicha droga en la población analizada. La suspensión bacteriana se prepara tomando unas colonias representativas de la mayor parte de la cepa a estudiar, se depositan en un tubo conteniendo perlas de vidrio, y se añade agua destilada hasta obtener una turbidez equivalente a la proporcionada por una suspensión de BCG21 de 1 mg/ml. A partir de aquí se preparan dos diluciones en agua destilada estéril al 1/1000 y al 1/100000. Se inoculan en los tubos correspondientes 0,2 ml de las diluciones así preparadas. Los tubos se depositan en posición horizontal en la estufa a 37ºC y se leen a los 21 y los 28 días. Se cuentan las colonias aparecidas en los tubos testigo y, si existen, en los tubos conteniendo las drogas. Si el crecimiento en los tubos con drogas es superior a la proporción crítica en relación con el crecimiento en los testigos, la cepa se considera resistente, y si es inferior, sensible. 21 Bacillus de Calmette y Guérin (BCG)