Guia de prácticas de infección e inmunidad_P6 (1) (1).pdf

Se prohíbe la reproducción total o parcial de la presente guía de uso exclusivo del Laboratorio de Microbiología
Infección e Inmunidad
UNSCH Código LAB-AAM-GPII-01
GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
Sistema de Gestión de Calidad

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
INFECCIÓN E INMUNIDAD
GUÍA DE PRÁCTICAS
PRÁCTICA 6
MÉTODO MICROBIOLÓGICO: ANTIBIOGRAMA
Grupo de práctica: MARTES 11 -1 PM
Docente de Práctica: Mg. Alexandra Antonieta Urrutia Zegarra
INTEGRANTES
1. GONZALEZ BERROCAL, Leslie Caroline
2. MENDIZABAL ROJAS, Eddison James Edwar
3. TABOADA CASTRO, Joselin Adith
Ayacucho – Perú
2021

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
PRÁCTICA N° 6
MÉTODO MICROBIOLÓGICO:
ANTIBIOGRAMA
OBJETIVO
Conocer el fundamento del método microbiológico y la utilidad del antibiograma.
INTRODUCCIÓN
El antibiograma es una prueba que se pide cotidianamente al laboratorio, a fin de seleccionar el antibiótico más
eficaz en el tratamiento de una infección determinada (Zurita Macalupú, 2013)
Con miras al tratamiento de las infecciones que pueden causar algunos microorganismos, junto con su aislamiento e
identificación se determina la susceptibilidad de estos frente a antibióticos y otros agentes antimicrobianos. El
método del disco en medio sólido es aplicable principalmente a gérmenes de crecimiento rápido, no recomendándose
para determinar la susceptibilidad de microorganismo de crecimiento lento a menos que se empleen métodos de
difusión específicamente estandarizado. El mediode cultivo más frecuente empleado es el de Muller Hinton, que
permite el crecimiento de casi todas las bacterias. este medio puede ser suplemento con un 5% de sangre
desfibrinada de cordero cuando la bacteria lo requiera para su desarrollo (Luna Fontalvo, 2012).
PRUEBA DE DIFUSIÓN EN PLACA (Método de Kirby Bauer)
Esta prueba mide la inhibición del crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculada, que se evidencia alrededor
de los discos de papel filtros impregnados con antimicrobianos que difunden en el tiempo.

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
Materiales
- Escala de Mc. Farland
- Cultivo puro de Streptococcus pyogenes
- Agar Müller Hinton con 5% sangre de carnero
- Caldo TSA
- Estufa
- Hisopos estériles
- Discos de antibióticos (ampicilina o penicilina, eritromicina,clindamicina,cefotaxima, cloranfenicol)
- Mechero de Bunsen
Procedimiento
- Preparación del estándar (0,5 Mc. Farland) para el inóculo
- Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al 1,175% P/V) a
99,5 mL de una solución de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V) (0,5 de la escala de Mac Farland) como estándar.
- Antes de ser usado agitar vigorosamente dicho estándar de preferencia, en un agitador mecánico.
Selección de los discos de sensibilidad antibiótica
La selección de los antibióticos es en base a los siguientes criterios:
- Eficacia clínica documentada.
- Representatividad de una familia de antibióticos.
- Disponibilidad de criterios técnicos fiables para la determinación in vitro de su eficacia clínica.
- Estabilidad de la molécula en los discos para antibiograma.
- Presencia en el mercado nacional.
Inoculación
- Seleccionar cuatro a cinco colonias bien aisladas, del mismo tipo morfológico, de un cultivo enplaca.
- Tocar la superficie de cada colonia con un asa de siembra y transferirlo a un tubo que contienede 4 a 5
mL de caldo apropiado (Ejemplo Caldo Tripticasa soya).
- Incubar el caldo a una temperatura entre 35°C a 37°C, hasta que alcance o exceda la turbidezdel
estándar 0,5 de la escala de Mc. Farland (por lo general de 2 a 6 horas).
- Ajustar la turbidez del inóculo con solución salina o caldo apropiado hasta el tubo 0.5 de la escalade Mc.
Farland, por comparación visual con el estándar. Para realizar este paso correctamente

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
usar una luz apropiada y mirar los tubos contra un fondo blanco con líneas negras comocontraste.
- La suspensión preparada contendrá aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL
- Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inóculo, sumergir un hisopo estérilen la
suspensión, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima
del nivel del líquido para remover el exceso de inóculo.
- Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tresdirecciones para
asegurar una distribución uniforme del inóculo. Antes de colocar los discos dejar secar la placa a
temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea
absorbido.
- Incubar lar placas en posición invertida a 35°C dentro de los 15 minutos posteriores a laaplicación de los
discos.
- Las placas de Haemophilus spp y Streptococcus spp, deben ser incubadas en atmósfera del 5% de CO2.
- Después del tiempo recomendado de incubación examinar cada placa y medir los diámetros de los halos de
inhibición alrededor de cada disco. En los casos de Staphylococcus spp y Enterococcus spp el tiempo de
incubación debe prolongarse por 24 horas para una mejor detección de la resistencia a Oxacilina y
Vancomicina, respectivamente (Sacsaquispe Contreras & Velazques Pomar, 2002).

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
RESULTADOS
Las medidas de la zona de inhibición alrededor de un disco determinado en el cultivo analizado, secompara con los
diámetros estandarizados por cada laboratorio productor de ellos. Ejemplo
Área de inhibición Microorganismos
De más de 25 mm Muy sensible
De 15 a 25mm Moderadamente resistente o intermedio
Menos de 10 mm Resistente
Adaptado de Luna Fontalvo (2012) Diámetros estandarizados para la lectura de antibiograma.
Imagen tomada de Luna Fontalvo (2012) Prueba de antibiograma por el método del disco en medio sólido.
Resultado: Realizar el trabajo en equipo sobre los casos clínicos

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
Guía de Orientación
1) Conocimientos previos (Vocabulario)
1 Técnicas de cultivo PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA, TIPOS
 Método del antibiograma disco-placa
El antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de
agar de una placa de petri previamente inoculada con el
microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes
antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en
contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el
antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través
del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de
concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos
aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración de
antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias
inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la
concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de
dilución1
.
 Método del Epsilon test
El principio de este método es una expansión de la técnica de difusión
en disco. En el método E-test podemos, mediante lectura directa,
determinar la concentración inhibitoria mínima (CMI). Consiste en una
tira de plástico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que
incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15
diluciones. El protocolo para preparar el inóculo es el mismo que para la
difusión en disco. Siguiendo el método de difusión, una vez inoculado la
placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira de Etest sobre su
superficie, produciéndose de forma inmediata una difusión del
antibiótico desde el soporte hasta el agar, creándose de este modo a lo
largo de la tira un gradiente exponencial de las concentraciones del
antimicrobiano. Tras la incubación de las placas, se puede observar una
zona de inhibición elipsoidal y simétrica. Después de la incubación la
CMI será el valor obtenido en el punto en el que el extremo de
inhibición intersecciona con la tira1
.
 Dilución en agar
En estos métodos se incorpora el antimicrobiano a evaluar a un medio
con agar. El antimicrobiano se añade cuando el medio aún está fundido.
Para lograr el rango de dilución deseado se prepara una serie de placas,
cada una con una determinada concentración de antimicrobiano. Las
placas se inoculan con un replicador una vez que se haya solidificado el
medio de cultivo. El número de placas de cada concentración a preparar
vendrá dado por el número de microorganismos que se vaya a estudiar,
teniendo en cuenta que la mayoría de los replicadores permiten inocular
entre 32 y 36 organismos1
.
2 Antibiograma Mide la sensibilidad de una bacteria frente a diferentes antimicrobianos
in vitro y a partir de estos resultados predice la eficacia in vivo. Con un
antibiograma se pueden obtener resultados cualitativos que indican si la
bacteria es sensible o resistente a un antibiótico, o cuantitativos que
determinan la concentración mínima (CMI) de antimicrobiano que

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
inhibe el crecimiento bacteriano (en μg/ml o en mg/l)2
.
¿Qué tipos de hemólisis pueden formarse en el agar sangre por acción de las bacterias delgénero
Estreptococos?, indique su respuesta mediante referencia(s) bibliográfica(s) Joselin)
ESTREPTOCOCOS BETA HEMOLITICOS
Los grupos más importantes son aquellos que se mencionan en la tabla 2, junto a las pruebas
bioquímicas que se utilizan para su identificación presuntiva.
Sensibilidad a la bacitracina
Objetivo: Separar el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos beta hemolíticos. Fundamento:
El 99% de las cepas de Streptococcus pyogenes son sensible a bajas concentraciones de bacitracina
(discos con 0,04 U). Un 5% de las cepas de Streptococcus agalactiae son sensibles a la bacitracina3
.
Procedimiento: se realiza sembrando 3-4 colonias, tomadas con asa bacteriológica de un cultivo puro,
que se estrían sobre una placa de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo
confluente. Luego se coloca el disco de bacitracina y se incuba 18-24 horas a 35-37ºC.
Interpretación de los resultados: La aparición de cualquier halo de inhibición del crecimiento alrededor
del disco se considera una prueba positiva (no importa el diámetro del halo)3
.
Hidrolisis del PYR
Objetivo: separar Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los demás estreptococos. S. pyogenes y
Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida) debido a que
poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa. Existen varias configuraciones comerciales de este test
por eso no detallaremos ninguna en particular. En general siempre se revelan por un cambio de color.
Este test es más específico y menos laborioso que realizar el test de sensibilidad a la bacitracina, la bilis
esculina y caldo salado (se verán más adelante).
Prueba de CAMP
Objetivo: separar Streptococcus agalactiae de los demás estreptococos ß-hemolíticos. Fundamento: los
estreptococos del grupo B producen una proteína extracelular difusible llamada “factor CAMP” (iniciales
de los autores que lo describieron) que actúa sinérgicamente con la ß-lisina de S. aureus, potenciando la
lisis de los eritrocitos. Procedimiento: se realiza estriando un cultivo del estreptococo ß-hemolítico en
estudio en forma perpendicular a una estría de un estafilococo productor de ß-lisina, en placas de agar
sangre. Se incuban 18-24 horas a 37ºC. Interpretación de los resultados: la prueba positiva se evidencia
por la presencia de una zona de potenciación de la hemólisis en forma de punta de flecha en el lugar
donde se contactan las dos estrías3
.
ESTREPTOCOCOS ALFA Y GAMMA HEMOLITICOS
Dentro de este grupo se incluyen Streptococcus penumoniae, Streptococcus del grupo viridans y
Enterococcus (algunas cepas pueden presentar beta-hemólisis). Describiremos los ensayos bioquímicos
utilizados para su identificación3.

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
Menciona qué características tiene un medio de transporte. Indique dos ejemplos para cadagrupo
bacteriano (Gram positivas y Gram negativas). sustente su respuesta mediante referencia(s)
bibliográfica(s). (Edwar)
Los medios de transporte para microbiología, son un medio de cultivo para microbiología, capaz de
mantener viva una muestra o cepa de microorganismos por un periodo de tiempo prolongado,
manteniendo a los microorganismos vivos y sobre todo sin alterar su concentración y composición4
.
Presentan las siguientes características:
 Almacenan temporalmente los especímenes que se transportan al laboratorio para su cultivo.
 Mantienen la viabilidad de todos los organismos presentes en la muestra sin alterar su
composición.
 Mantienen regulada la falta de carbono, nitrógeno, y factores de crecimiento orgánico con el fin
de evitar la multiplicación microbiana.
 Se mantiene libre de oxígeno molecular para el mantenimiento4
.
Medio de cultivo para GRAM NEGATIVA
1. Agar MacConkey: El agar MacConkey es un medio de cultivo que inhibe el crecimiento de las
bacterias gram positivas y estimula la reproducción de los bacilos gram negativos5
.
2. Agar Vogel Johnson: medio de cultivo sólido diseñado para el aislamiento de Staphylococcus
aureus, inhibe el crecimiento de todas las GRAM negativas y el de algunas Gram positvas5
.
Medio de cultivo para GRAM POSITIVA
1. Agar Tinsdale: Es un medio que lleva como inhibidor el suplemento tinsdale (con telurito
potásico). Es específico para bacilos Gram positivos, por tanto, Actinomyces pyogenes
(antiguamente Corynebacterium pyogenes) y Corynebacterium bovis crecen sin problemas6
.
2. Agar Sangre: El medio de cultivo agar sangre ovina proporciona el crecimiento de la gran
mayoría de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como de hongos (mohos y
levaduras), a partir de una base rica y complementada, ofreciendo óptimas condiciones de
desarrollo para microorganismos no fastidiosos7
.
¿Qué el que medios de cultivos se utiliza para aislar Staphylococcus aureus y de qué lugares del
cuerpo humano se toma la muestra? sustente su respuesta mediante referenciabibliográfica(s). (Edwar)
 Medios de cultivo para aislar Staphylococcus aureus
 Agar salino manitol (SM, MS “mannitol saline”, Medio de Chapman): Es un medio
selectivo para estafilococos debido a la alta concentración de cloruro sódico (75 g/L). La
mayoría de los microorganismos no crecen a esta concentración de sal, mientras que los
estafilococos, entre los que se encuentran los del género Staphylococcus, sí lo hacen.

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
Incorpora manitol como fuente de carbono y rojo fenol como indicador, lo que permite
aprovechar la correlación que existe entre la patogenia y la capacidad fermentadora del
manitol de los estafilococos para establecer un diagnóstico presuntivo y sirve, por lo tanto,
como indicativo de la presencia de Staphylococcus aureus. Los estafilococos patógenos
fermentan el manitol y producen colonias amarillas. Los estafilococos no patógenos no lo
fermentan y producen colonias de color rosa8
.
 Agar sangre y agar chocolate a una temperatura de 37 grados9
.
 Medio selectivos: agar manitol sal, medio Staphylococcus No. 110 y agar Chapman-
Stone10
.
 Lugares del cuerpo humano donde se obtiene la muestra de Staphylococcus aureus
 Muestra de sangre: Otra prueba importante es la coagulasa, la cual permite la
transformación de fibrinógeno a fibrina permitiendo observar la coagulación del plasma9
.
 Exudado nasal: toma mediante torunda. Es la localización más adecuada, aunque puede
sustituirse por exudado faríngeo, donde la toma de muestras resulta más incómoda para
el paciente. Con mayor sensibilidad está la triple muestra de exudados nasal, faríngeo y
perirrectal o perineal.
 Exudado de piel de la zona perineal-peri rectal: tiene alta sensibilidad, pero no se
aconseja como muestra única.
 Muestras de secreciones respiratorias en pacientes con ventilación mecánica o
traqueotomía.
 Exudado de úlceras o heridas en pacientes con solución de continuidad de piel.
 Urocultivo en pacientes con sonda vesical11
.
¿Cuál es la utilidad de la escala de MC Farland y cómo se realiza su preparación? Sustente,mediante
referencia(s) bibliográfica(s)
Las técnicas turbidimétricas son métodos rápidos y eficaces para estimar el crecimiento celular en
múltiples bioprocesos. La medición de turbidez se basa en los fenómenos ópticos que se originan al
incidir un haz de luz a través de un medio; la presencia de partículas suspendidas produce una dispersión
de la luz, lo que interfiere en el haz de luz resultante. Un método tradicional para las mediciones de
turbidez es la escala McFarland, que consiste en la preparación de estándares a partir de Cloruro de
Bario y Ácido sulfúrico dando como producto partículas suspendidas de Sulfato de Bario; químicamente
la formación de sulfato de bario depende de los iones xvi sulfato y bario, partiendo de esto se puede
utilizar los reactivos que se disponga en el laboratorio y que su uso represente menor riesgo12
.
La turbidez se mide utilizando las técnicas de turbidimetría o nefelometría13
.
MATERIALES
11 tubos de ensayo para escala de McFarland
Matraz de 500ml
Matraz de 50 ml
Vaso de precipitado
Papel de filtro
Embudo
Pipeta pasteur
Varilla
Vidrio de reloj
Espátula
Balanza
Pipeta de cristal y cremallera
Micropipeta
Frasco lavador
REACTIVOS

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
Ácido Sulfúrico (1%)
Cloruro de Bario (1,175%)
CÁLCULOS
Cálculos de la escala de McFarland para tubos de 25 ml.
La escala que nos proporcionan es para tubos de 10 ml por lo que, con una regla de tres, calculamos la
cantidad necesaria de Ácido Sulfúrico (1%) y Cloruro de Bario (1,175%) para tubos de 25 ml.
- Tubo 0,5 para Ácido Sulfúrico (1%)
10ml..........9,95ml
25ml.......... x
x= 24,875ml de Ácido Sulfúrico (1%)
- Tubo 0,5 para Cloruro de Bario (1,175%)
10ml..........9,95ml
25ml.......... x
x= 24,875ml de Cloruro de Bario (1,175%)
Realizamos la misma operación para todos los tubos de la escala de McFarland y obtenemos la siguiente
tabla:
Tabla 1. Estándares de McFarland en cantidades de Ácido Sulfúrico (1%) y Cloruro de Bario
(1,175%)
Estándar McFarland H2SO4 (1%) ml BaCl2 (1,175%) ml
0,5 24,875 0,125
1 24,75 0,25
2 24,5 0,5
3 24,25 0,75
4 24 1
5 23,75 1,25
6 23,5 1,5
7 23,25 1,75
8 23 2
9 22,75 2,25
10 22,5 2,5
Adaptado de Laboratorio Clínico y Biomédico. Curso 2017-2018
 Cálculos para las diluciones de Ácido Sulfúrico, que se encuentra al 98% y lo queremos al 1%,
y Cloruro de Bario, que está al 100% y lo queremos al 1,175%.
- Ácido Sulfúrico (1%)
VixCi=VfxCf
Vix98=500x1
Vi= 5,102ml de Ácido Sulfúrico.
- Cloruro de Bario (1,175%)
VixCi=VfxCf
Vix100=50x1,175

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
Vi= 0,587 gr. de Cloruro de Bario14
NOTA
La turbidez se define por la Organización Internacional de Normalización (ISO), como la reducción de la
transparencia de un líquido causada por la presencia de partículas no disueltas de material distinto al
propio líquido. Al ser un indicador de apariencia óptica, ocasionado por la dispersión y absorción de la
energía lumínica a través del líquido, la turbidez solo puede ser medida usando técnicas ópticas13
.
Explique el significado de los rangos de Sensible, Intermedio y Resiste en los resultados de
antibiograma. Sustente, mediante referencia(s) bibliográfica(s)
La finalidad primordial de una prueba de sensibilidad a los antimicrobianos (PSA), es la de predecir
cómo se comportará una cepa bacteriana al ser confrontada a un antibiótico en el paciente. Desde este
punto de vista, un resultado de "sensible", se interpreta como que es altamente probable que la bacteria
sea eliminada y que el paciente respondió en forma adecuada a la terapia con ese antibiótico.
Un resultado "resistente" nos indica que el tratamiento de un proceso infeccioso con un antibiótico en
especial, fallará y que la bacteria no será eliminada por dicha terapia antimicrobiana15
.
El antibiograma, que mide la sensibilidad de una bacteria frente a diferentes antimicrobianos in vitro y a
partir de estos resultados predice la eficacia in vivo. Con un antibiograma se pueden obtener resultados
cualitativos que indican si la bacteria es sensible o resistente a un antibiótico, o cuantitativos que
determinan la concentración mínima (CMI) de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano (en
μg/ ml o en mg/l). La interpretación de los resultados del antibiograma (sensible, intermedio o resistente)
se realiza en función de los valores establecidos por diferentes comités, como el Clinical and Laboratory
Standards Institute en Estados Unidos, el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
en Europa y la Mesa Española de Normalización de la Sensibilidad y Resistencia a los Antimicrobianos.
Estos comités determinan y establecen puntos de corte basados en propiedades microbiológicas,
farmacocinéticas y de eficacia clínica, para definir la sensibilidad (éxito terapéutico) o resistencia de las
diferentes especies bacterianas a cada antimicrobiano.
Requisitos para realizar una adecuada interpretación:
 Conocer la identidad del microorganismo estudiado, tanto el género como la especie.
 Conocer el fenotipo de sensibilidad de un microorganismo2
.
2) Preguntas de reflexión
Explique en 10 líneas sobre el problema actual de la resistencia de microorganismos a los
antibióticos.

GUÍA DE PRÁCTICAS
VERSIÓN 02
La resistencia actual de los gérmenes a los antimicrobianos constituye un serio problema de salud en todo
el orbe y un reto aún mayor para el futuro.
La utilización de antibióticos a gran escala incremento de la resistencia microbiana ha permitido cepas
con mecanismos de resistencia que, en muchas ocasiones, nos dejan prácticamente sin alternativas para el
tratamiento de las infecciones. Es más, en la actualidad existe multirresistencia en gran número de
gérmenes.
La resistencia a los antimicrobianos reduce las posibilidades de realizar tratamientos eficaces de
enfermedades, de esta manera conduce a ciertos riegos como: prolongar el tiempo de agonía de los
enfermos y los obliga a utilizar medicamentos costosos, además de alargar el tiempo de hospitalización y
aumentar el riesgo de mortalidad.

Guia de prácticas de infección e inmunidad_P6 (1) (1).pdf

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

Similar a Guia de prácticas de infección e inmunidad_P6 (1) (1).pdf

Similar a Guia de prácticas de infección e inmunidad_P6 (1) (1).pdf (20)

Más de LEONELTACURIYUPANQUI1

Más de LEONELTACURIYUPANQUI1 (13)

Último

Último (20)

Guia de prácticas de infección e inmunidad_P6 (1) (1).pdf