GUIA DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE INMUNOLOGIA.pdf

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INMUNOLOGÍA
GUÍA DE TRABAJO DE LABORATORIO
Dr. Luis Fernando Sosa Tordoya

INMUNOLOGÍA
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS
AUTOR
Luis Fernando Sosa Tordoya
Docente titular de la Cátedra de Inmunología
Jefe del Laboratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética
Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas
Universidad Mayor de San Andrés
COLABORADORES
Carmiña Heidy García Rodríguez
Jefa del Laboratorio de Endocrinología y Biomarcadores
Edgar Teddy Quispe Soto
Investigador Asociado Unidad de Biología Celular
Faculta de Medicina
Wendy Jacqueline Cutipa Choque
Investigadora Asociada al Laboratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética

INMUNOLOGÍA
ÍNDICE
Práctica TEMA Pag.
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BIOSEGURIDAD
CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
PREPARACIÓN DE REACTIVOS DE TRABAJO PARA LAS PRACTICAS
DE INMUNOLOGÍA
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FAGOCÍTICA DE LAS CÉLULAS DEL
SISTEMA INMUNE
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE ADHERENCIA Y MIGRACION
CELULAR
ÓRGANOS LINFOIDEOS
INMUNIZACIÓN DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS
AISLAMIENTO DE LÍNEAS CELULARES: DETERMINACIÓN DE LA
VIABILIDAD Y AJUSTE DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR
Wendy Jacqueline Cutipa Choque
CITOTOXICIDAD DEPENDIENTE DE COMPLEMENTO (CDC)
REACCIONES DE AGLUTINACIÓN: AGLUTINACION ACTIVA
REACCIONES DE AGLUTINACION PASIVA Y FLOCULACION
PRUEBA DE COOMBS
Carmiña Heidy García Rodriguez
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ENSAYO INMUNOABSORBENTE LIGADO A ENZIMAS (ELISA)
INMUNOPRECIPITACIÓN
INMUNO/WESTERNBLOT
PRUEBAS INMUNOCROMATOGRAFICAS
PRUEBAS DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
QUIMIOLUMINISCENCIA
Carmiña Heidy García Rodríguez
CITOMETRIA DE FLUJO
Edgar Teddy Quispe Soto
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75
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83
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91
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INMUNOLOGÍA
PRÓLOGO
En el último trienio la inmunología se ha convertido en una de las disciplinas de mayor
desarrollo en el ámbito científico-tecnológico, este hecho puede ser constatado por la cantidad
de artículos originales que son publicados en las revistas científicas. En el campo de las ciencias
de la salud y medicina en particular es donde mayormente se ha desarrollado el crecimiento de
esta especialidad. En los procesos patológicos se estudian los diversos mecanismos en los que
la respuesta inmune está involucrada (enfermedades autoinmunes, alergias, enfermedades
infecciosas, trasplantes, inmunodeficiencias, neuro-endocrinología, etc), estos procesos en
general comprenden: los aspectos bioquímicos y moleculares de la ontogenia de las células del
sistema inmune , los cambios fenotípicos que se producen tanto en las células presentadoras de
antígeno y los linfocitos después de la interacción con el antígeno, la sinapsis inmunológica
entre estos tipos celulares, activación de los linfocitos y los cambios fisiopatológicos que se
producen en respuesta a la activación del sistema inmune. Esta compleja y gran cantidad de
información en el campo de la inmunología plantea un reto tanto para profesores como
alumnos de la Carrera de Bioquímica de la facultad de Ciencias farmacéuticas y Bioquímicas. Por
lo tanto, plantea también el desafío de desarrollar nuevas estrategias de enseñanza-
aprendizaje en las que se privilegie el aprendizaje activo, participativo, así como la capacidad de
autoaprendizaje.
El presente Manual de Practicas pretende ser una herramienta que contribuya a una mejor
integración de los conocimientos adquiridos en la parte teórica de la asignatura y que pueda
plasmarse en la adquisición de nuevas habilidades y destrezas por los estudiantes, que les
permitan desenvolverse en el campo laboral con la eficiencia y profesionalismo que se plantea
la Universidad Mayor de San Andrés.
En la presente guía se incorporan aportes propios del autor y se ha enriquecido con aportes de
autores nacionales e internacionales quienes en sus guías o trabajos de investigación,
plasmaron experiencias que contribuyen al conocimiento en las ciencias bio-médicas.
Especialista en Inmunología
Docente titular de la Cátedra de Inmunología
Jefe del Laboratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética
Correspondencia: lfsosa@umsa.bo

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INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 1
BIOSEGURIDAD
1. OBJETIVOS:
Dar a conocer las normas básicas de bioseguridad que se deben seguir para trabajar en un laboratorio de
inmuno-serología a objeto de prevenir accidentes en el laboratorio.
2. ANTECEDENTES:
Las medidas de bioseguridad son conjunto de medidas y normas preventivas destinadas a proteger tanto
la salud y seguridad del personal que trabaja en laboratorios así como del medioambiente.
Al inicio del programa de prácticas de inmunología se debe dar a conocer y analizar el contenido de la
misma con el fin de entender el ¿qué?, ¿por qué? y ¿para qué? de todo todos los experimentos a
realizar, así como el conocer los riesgos biológicos, químicos y físicos a los el personal involucrado en la
práctica está expuesto. Si el estudiante no sabe algo, no lo recuerda o tiene alguna duda, debe sentirse
en la libertad de preguntar al docente o al auxiliar de la asignatura.
2.1. Normas de trabajo en el laboratorio
En la rutina de trabajo de laboratorio el personal se expone a riesgos químicos, físicos y biológicos. Los
laboratorios que trabajan con material biológico deben asumir que todo material biológico es
potencialmente patógeno y todo producto químico es peligroso. Por lo tanto, en todo momento
debemos estar conscientes de los riesgos a los que estamos expuestos y al que se expone el personal
que trabaja con nosotros. De esta manera debemos tomar las medidas de seguridad apropiadas y asumir
las conductas idóneas para evitar exponernos a riesgos o causar accidentes de trabajo.
- Antes de comenzar a trabajar en el laboratorio debemos conocer donde se encuentran los sistemas de
lavados, la salida, los seguros de la ventanas, puertas, extintores si los hay, entre otros. Nunca deben
bloquearse las vías de acceso.
- El material biológico humano o de origen animal es potencialmente infeccioso y debe ser manipulado
como tal.
- En el laboratorio de no se debe comer, beber, fumar, ni aplicarse cosméticos.
- En el momento de trabajar, las muestras, reactivos y el resto del material deben colocarse frente al
operador y no en los laterales, de esta manera se evitan golpes fortuitos con los brazos. Siempre se debe
trabajar sobre el mesón para ofrecer un apoyo sólido al material utilizado.
- El estudiante debe protegerse con mandil preferentemente de algodón (en caso de accidente otras
telas pueden adherirse a la piel), guantes, barbijos, gorro y gafas si es necesario. La ropa de calle es un
elemento adicional de protección por lo que no es recomendable usar pantalón o falda corta, zapatos
abiertos o ropa de nylon (se quema rápidamente).
- Es vital evitar pinchazos, cortes y exposiciones de lesiones abiertas y mucosas a material biológico, para
lo cual se deben seguir las medidas aconsejadas por las normas de bioseguridad
- Los tubos de vidrio delgados y las ampollas deben sujetarse envueltas en varias capas de papel secante
doblado en el sitio de apertura u otra manipulación hay riesgo de que se rompan.
- El material que está en contacto con muestras potencialmente infecciosas debe ser preferentemente
de un solo uso o esterilizarse (hipoclorito 0,8%) antes de volver a utilizarlo.

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INMUNOLOGÍA
- Los coágulos de sangre deben depositarse sobre un frasco de boca ancha que contenga hipoclorito al
5%.
- No usar reactivos que no cuenten con etiqueta, si se alicuotan reactivos estos deben ser etiquetados
debidamente (nombre del reactivo, fecha de preparación, advertencia e seguridad, otros).
- No transportar tubos de vidrio, reactivos o muestras biológicas en los bolsillos ya que al romperse o
derramarse pueden causar accidentes (siempre usar el medio de trasporte de muestras adecuado).
- Nunca cerrar herméticamente un envase en el que los reactantes producen vapores, el aumento de la
presión podría producir una explosión, tampoco se debe calentar un recipiente con cierre hermético
- Las salpicaduras y vertidos deben recogerse primero con papel secante, tras lo cual se descontaminará
el lugar con hipoclorito al 0,8 % en agua común durante unos 20 minutos, si se contaminan los guantes
estos deberán ser cambiados.
- Antes de usar un reactivo se debe observar principalmente en la etiqueta los avisos sobre su toxicidad,
y riesgo de manejo en caso de que su manipulación sea peligrosa.
- Los productos químicos no deben pipetearse con la boca (usar propipetas), tampoco deben olerse
directamente y después de su uso cerrarlos correctamente.
- Los residuos y el material punzante o cortante deben desecharse en contenedores habilitados para ello.
- El estudiante debe lavarse las manos al finalizar la práctica. (Debemos tener un estuche de aseo).
- Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la hepatitis
B y otros virus que sean exigidos por la instancia que regula el funcionamiento del laboratorio.
- Nunca extraer la aguja de la jeringa con la mano, usar una pinza.
- El personal que va a manipular al microorganismo ya sea cultivo, material de descamación, orina o fecal
infectado, líquido biológico o sangre de individuos infectados, debe inicialmente trabajar bajo
supervisión cercana y conocer aspectos biológicos del microorganismo.
2.2. Acciones en caso de accidentes
- Las salpicaduras y derrames en la piel intacta deben lavarse inmediatamente con abundante agua y
jabón. En caso de que el derrame de un producto químico afecte un área grande del cuerpo, la zona
afectada debe estar bajo la ducha y debe quitarse la ropa lo antes posible. Cuando la zona afectada sea
los ojos, deberá lavárselos con abundante agua (usar lava ojos de preferencia). No debe usarse lentes de
contacto, en caso de vapores o salpicaduras de reactivos pueden pasar detrás de los lentes y lesionar los
ojos. Si el derrame en la piel es por ácidos, lavar la zona afectada con abundante agua y neutralizar con
bicarbonato de sodio al 1% por 15 minutos, si es por bases lavar con abundante agua y neutralizar con
una solución de ácido bórico o ácido acético al 1%. Cuando el derrame sea en la ropa las soluciones
neutralizantes deben estar al 5%.
- En caso de inhalación de productos químicos se debe salir inmediatamente del área contaminada, salir
al aire libre y hacer respiraciones con vapor de agua o alcohol, recibir asistencia médica cuando el caso lo
amerite.
- En caso de ingestión no provocar el vómito y proporcionar asistencia médica.
- En caso de corte o pinchazo con material usado o una exposición de las mucosas a material infeccioso
debe lavarse con abundante agua corriente sin frotar durante 15 min. - En caso de herida abierta dejar
fluir la sangre libremente por 3 min. Todos los accidentes deben ser comunicados al responsable de la
práctica por si fuese necesario algún tipo de profilaxis post exposición.
- En el caso de mordeduras y arañazos de animales debe consultarse con el responsable del bioterio
sobre el estado sanitario del animal, en general solo deben limpiarse con un antiséptico.
- En caso de quemaduras leves lavar la zona afectada con agua corriente por 10 a 20 minutos, en caso de
quemaduras graves se debe recurrir al médico.

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INMUNOLOGÍA
2.3. Las sustancias químicas y los símbolos de riesgos
Las sustancias químicas usadas en nuestros laboratorios se clasifican de acuerdo a sus características
químicas, físicas o tipo de riesgo que representen para el hombre o el medio ambiente.
Explosivas: se consideran las más peligrosas e incluyen no solo los explosivos sino sustancias tales como
sales metálicas que por sí mismas en ciertas mezclas o cuando se exponen al choque, fricción o al calor
pueden explotar y provocar quemaduras o incendio en los locales de trabajo.
Inflamables: líquidos con un punto de destello de 210 o más.
Tóxicas: pueden causar efectos extremadamente serios, agudos o crónicos incluyendo la muerte cuando
son inhalados, tragados, o absorbidos a través de la piel.
Dañinos: efectos limitados en la salud si son inhalados, tragados o absorbidos a través de la piel.
Oxidantes: sustancias que producen reacciones altamente exotérmicas en contacto con otras sustancias
inflamables o con materiales combustibles.
Irritantes: sustancias capaces de provocar una reacción inflamatoria local sin afectación severa de los
tejidos.
Corrosivas: sustancias que pueden destruir los tejidos vivos.
Cancerígenas: agentes químicos cuyos efectos adversos es la producción de tumores en el hombre y los
animales.
Teratogénicas: agentes que producen defectos en la natalidad (malformaciones).
Mutagénicas: compuestos o sustancias que producen cambios químicos en la composición de bases del
ADN.
Peligrosas al medio ambiente: Sustancia que tienen efectos perjudiciales sobre ecosistemas y cuyos
constituyentes pueden abarcar micro flora del suelo, micro fauna y hasta primates.
Conocer los símbolos que representan los riesgos químicos, permite tomar medidas de precaución para
evitar accidentes:

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INMUNOLOGÍA
2.4. El ambiente del laboratorio
a) Las paredes deben ser lisas, preferiblemente enchapadas con mayólica y los pisos de marmolina,
porcelanato o cemento. Esto facilitará la limpieza con soluciones desinfectantes.
b) Los pisos deben limpiarse todos los días con soluciones desinfectantes (cresol, neolisolín, etc.). No se
debe barrer en seco ni encerar.
c) En el sistema de desagüe sólo se debe eliminar los agentes biológicos o químicos, previamente
descontaminados, neutralizados o inactivados.
d) El ambiente debe estar adecuadamente ventilado e iluminado y los servicios de agua, luz y gas deben
funcionar satisfactoriamente.
e) Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material sólido, con superficies lisas,
impermeables de fácil limpieza resistentes a las sustancias corrosivas.
2.4.1. Uso de cabinas de seguridad: Clase I y II:
Cabina clase I: Son de frente abierto, presión negativa y con filtros HEPA (alta eficiencia en filtrado de
partículas). Se puede usar con ventanas a medio abrir.
Cabina clase II: Son de flujo laminar vertical, similar a la anterior, pero con aire filtrado por HEPA
circulando.
2.5. Desinfección, limpieza y esterilización.
2.5.1. Desinfección
a) Los procedimientos destinados a eliminar elementos causantes de infecciones virales, bacterianas,
micóticas y parasitarias, dependerán de la naturaleza del agente presente en el material de vidrio u otro.
b) Los más comunes son: agentes químicos en estado líquido (mezcla sulfocrómica, lavandina 0,8% al
1,5%, etc.) y los agentes físicos como el calor, hervido, autoclave, irradiación ultravioleta, etc.

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INMUNOLOGÍA
2.5.2. Lavado
Después de la eliminación de los agentes infecciosos (desinfección), el material de vidrio sucio debe ser
lavado, recomendándose el uso de detergentes apropiados.
Autoclave (vapor saturado a presión): permite controlar la temperatura (121C) y la presión (15
atmósferas). Se usa para soluciones, material de goma, plástico, vidrio o metal. Material de vidrio con
medio de cultivo. Se puede emplear también una olla a presión provista de una rejilla.
Horno Pupinel (calor seco): suele ser eléctrico y permite el control de la temperatura (180-200C). Por
este sistema no puede esterilizarse papel, material plástico, de goma, etc.).
2.5.3. Agentes físicos
Para reactivos biológicos degradables por calor seco o húmedo, se emplean membranas de filtración
(0,22 µm, 0,45µm)
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS:
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4. PROCEDIMIENTOS:
Discusión acerca de las normas básicas de bioseguridad que se deben seguir en el laboratorio.
5. CUESTIONARIO:
1.- ¿Qué conducta se debe asumir en caso de incendio?
2.- ¿Qué diferencia existe entre accidente e incidente?, mediante un ejemplo explique esta diferencia.
3.- Mencione 10 situaciones de riesgo en el laboratorio de inmunología donde actualmente realiza sus
prácticas de laboratorio.
4.- Si usted o alguna persona del laboratorio, se llega a pinchar con la aguja de la jeringa después de
realizar la toma de muestra de sangre a un paciente. ¿Qué protocolo se debería seguir?
5.- ¿Qué implementos de bioseguridad deben existir en un botiquín de laboratorio?
6.- ¿Qué medidas de seguridad debe asumir una persona resfriada en el laboratorio?

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INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 2
CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
1. OBJETIVOS:
Dar a conocer las características de los procesos de control de calidad que debe seguir un profesional
bioquímico para asegurar la calidad de los resultados de las pruebas serológicas.
2. ANTECEDENTES:
Actualmente por consenso se acepta que tanto la Garantía de Calidad, el Control y la Evaluación de la
Calidad son actividades esenciales en la ejecución de las pruebas analíticas con fines diagnósticos y de
seguimiento de enfermedades de diversa índole como ser infecciosas, metabólicas, autoinmunes,
tumorales, etc. Se entiende como control de calidad, a las actividades y técnicas operativas aplicadas
sobre cada uno de los factores que influyen en los resultados de las pruebas de tamizaje (screening) o
confirmatorias. Es importante saber que no basta ejecutar las pruebas con los “mejores reactivos” para
obtener resultados confiables, sino que esa propiedad del diagnóstico serológico se logra mediante la
implementación de sistemas de calidad que aseguren la correcta realización de todos los procedimientos
involucrados en el proceso, desde la toma de muestra hasta la emisión del informe (pre-analítica,
analítica y post-analítica). Además en el laboratorio se tiene que garantizar la competencia técnica del
personal que realiza los diferentes procesos y procedimientos. Para ello el laboratorio debe realizar un
programa de evaluación de la calidad interna, externa y si es posible un programa de control de calidad
inter-laboratorio.
2.1. Control de calidad interno
El objetivo del control de calidad interno es asegurar que los procesos se ejecutan correctamente, desde
que la muestra ingresa al laboratorio hasta la emisión de los resultados. En todo momento se debe
asegurarlos equipos e instrumentos usados tengan un desempeño óptimo.
2.1.1. Procedimientos generales
El control de calidad involucra una serie de aspectos que deben considerarse, a decir:
a) Obtención e identificación de la muestra
b) Transporte de la muestra al laboratorio.
c) Almacenamiento de la muestra.
d) Método de análisis (procedimientos y reactivos).
e) Mantenimiento y calibración de equipos.
f) Disponer de manuales de procedimientos actualizados y al alcance del personal.
g) Disponer de normas y prácticas de bioseguridad.
h) Implementación de un programa de control de calidad interno orientado al mejoramiento continuo de
la calidad.
i) Participación en un programa de control de calidad externo (evaluación externa del desempeño).
j) Asignación de un profesional supervisor de control de calidad que asegure que los procedimientos de
control en uso se apliquen adecuadamente, proporcione capacitación y asistencia al personal, examine
los datos de control y especifique cuándo y cómo deben aplicarse acciones correctivas.

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INMUNOLOGÍA
k) Programa de capacitación y educación continua del personal del laboratorio con respecto a los efectos
fundamentales del control de calidad y lo referente a la realización e interpretación de los pruebas de
laboratorio.
l) Evaluación de la competencia del personal que trabaja en el laboratorio.
2.1.2. Fuentes de Variación
Con el propósito de poder aplicar medidas preventivas en el control de la variación es necesario conocer
las posibles fuentes de variación de un proceso analítico. Las fuentes de variaciones pueden ser:
biológicas y analíticas, cada una con sus subdivisiones particulares.
2.1.3. Variación Biológica
2.1.3.1. Variación Inter-individuo:
Se refiere a las diferencias en el valor verdadero de un analito entre individuos. Como las poblaciones
son heterogéneas, en la práctica se las subdivide por: edad, sexo, raza, “competencia técnica”, etc.
2.1.3.2. Variación Intra-individuo:
Incluye todos los fenómenos regulatorios y en particular todos los ritmos biológicos, edad, estado
nutricional etc., generalmente se producen variaciones en los resultados de laboratorio en relación a
estos fenómenos. Es difícil separar las fuentes de variación por estar estrechamente relacionadas.
2.1.4. Variación Analítica
2.1.4.1 Fase pre analítica
Son la sumatoria de las fuentes de variación, desde la que damos la primera información al paciente,
obtención de la muestra hasta que se inicia el procesamiento de la muestra, incluye también los errores
administrativos y aquellos inherentes a las muestras.
2.1.4.2 Fase analítica
Se producen debido a las condiciones del ambiente del laboratorio y del método de análisis (equipos).
Las fuentes de variación analítica se deben a errores sistemáticos o determinados y a errores aleatorios o
indeterminados.
• Errores Sistemáticos:
Son errores que se hallan siempre en una dirección originados por causas identificables y corregibles.
Son generados por desempeño inapropiado del analista, uso de materiales inadecuados o defectuosos,
equipos mal calibrados, uso de protocolos de trabajo no normatizados, etc. Pueden ser detectados por
controles externos, el parámetro que los mide es la exactitud.

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INMUNOLOGÍA
• Errores aleatorios:
Error positivo o negativo cuya magnitud exacta no puede predecirse que influyen en cada medición en
forma diferente. Su mayor o menor magnitud es la precisión del método o medición, es una medida de la
repetitividad de lo mismos.
• Exactitud.
Grado de concordancia entre los resultados de una medición y un valor verdadero del mensurado.
• Precisión
Grado de concordancia entre los resultados de pruebas independientes, obtenidos en condiciones
determinadas (estipuladas)
2.1.4.3 Fase post analítica
En esta fase son importantes las evaluaciones de los resultados del ensayo, correcta transcripción,
revisión, interpretación, archivo y entrega de los resultados. La mayoría de os errores que se cometen en
el laboratorio es en esta fase del proceso analítico y son los debidos a errores de transcripción.
2.2. Evaluación de los métodos serológicos
2.2.1 Indicadores del valor diagnóstico de las pruebas de laboratorio
La inclusión de sensibilidad y especificidad como indicadores estadísticos de la eficiencia probable de una
prueba empleada para diagnóstico fue introducido por Yerushalmy en 1947:
2.2.1.1. Sensibilidad:
Es la probabilidad de que un individuo enfermo tenga un resultado positivo en de la prueba diagnóstico.
2.2.1.2. Especificidad:
Es la probabilidad que un individuo sin la enfermedad tenga resultado negativo de la prueba
diagnóstica.
Otros parámetros importantes para evaluar una prueba son los de Valores Predictivos (positivos y
negativos) que tienen en cuenta, además de la sensibilidad y especificidad de una prueba, la prevalencia
de la infección en el área donde se usará.
2.2.1.3. Valor Predictivo Positivo (VPP):
Es la probabilidad de que un individuo con resultado positivo realmente tenga la enfermedad.
2.2.1.4. Valor Predictivo Negativo (VPN):
Es la probabilidad de que un individuo con resultado positivo realmente tenga la enfermedad.
2.3. Estudio estadístico de los datos serológicos
El control estadístico es de utilidad en el laboratorio para mantener un rendimiento aceptable por medio
de la evaluación, corrección y documentación de la variabilidad del proceso analítico. Los indicadores
estadísticos más empleados son el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación.
- Media aritmética o media (x): es el valor promedio del conjunto de las mediciones.
- Desviación estándar (s): es una medida de dispersión de los datos del valor promedio.
- Coeficiente de variación (CV): es la desviación relativa de los datos respecto del valor promedio.

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2.3.1. Medidas de posición y variabilidad de los datos.
Si en la rutina diaria del trabajo de laboratorio un mismo operador realiza más de una vez una prueba de
laboratorio bajo las mismas condiciones, con los mismos reactivos e instrumentos de medición, los
valores obtenidos no serán idénticos.
Los valores obtenidos valores se distribuirán alrededor de uno más frecuente, que cuando el número de
medidas es suficientemente grande, la representación gráfica de estas frecuencias versus sus valores, se
acerca a la clásica campana de Gauss o de distribución normal.
En esta distribución normal, el área comprendida entre la Media (x) ± 1 desviación estándar representa
cerca del 68% del área total de la campana. Dicho de otra manera el 68% de las mediciones se estiman
comprendidas en ese rango. Si se considera el área comprendida entre (x) ± 2 desviaciones estándar, se
abarca cerca del 95% de las mediciones. Lo cual significa que existe la probabilidad de un 2,5% de error
en los valores bajos y 2,5% de error en los valores elevados.
2.4. Monitoreo de los procesos serológicos de tamizaje
Todos los procesos analíticos deben controlarse mediante la comparación con sueros de control. Existen
básicamente dos maneras de hacerlo: con los controles diarios planificados por cada laboratorio (control
interno) y con los programas inter-laboratorio (control externo) planificados y ejecutados anualmente
por el laboratorio de referencia nacional o por un laboratorio que realice control externo de calidad.
2.4.1. Control Interno
El control interno de la calidad tiene por objetivo asegurar el cumplimiento diario de todos los
procedimientos establecidos para el trabajo de laboratorio y el monitoreo de la precisión de los
resultados (construcción de gráfica de control de Levey Jennings) y que tiene el propósito de detectar y
de corregir os errores que eventualmente se produzcan.
El suero de control interno es un Suero Control Estándar, obtenido de muestras o plasma desfibrinado
de donantes con niveles altos o bajos en función al tipo de prueba que se quiere controlar, deben ser
alicuotados en volúmenes grandes y conservados de modo que asegure su calidad y sus mismas
características iníciales. No debe usarse como control interno los sueros control suministrados por el kit.
Para validar el funcionamiento de la prueba, los controles se trabajan simultáneamente y bajo las
mismas condiciones en las que se procesan que las muestras desconocidas. Luego de completado el
procedimiento de la prueba, se examinan los resultados utilizando el mismo criterio de interpretación de
resultados. Cuando se trabaja con un control externo de calidad los sueros problemas deben procesarse
bajo las condiciones descritas arriba, si se hacen estudios adicionales para “confirmar el resultado”,
estaríamos “haciendo trampa y estaríamos no evaluando la calidad de los resultados en las condiciones
verdaderas en las que trabajamos. Por lo tanto, este tipo de evaluación de la calidad no serviría para
corregir errores y aplicar medidas correctivas.
Cuando los controles conocidos producen resultados aceptables, el control de calidad indica que:
• La prueba es válida
• Todas las condiciones de la prueba han sido cumplidas
• Todos los resultados de la prueba son confiables

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INMUNOLOGÍA
2.4.2. Gráficas de Control
El monitoreo diario del proceso analítico de cada prueba se realiza a través dela evaluación de la prueba
con sueros de control interno, construyendo Gráficas de Control de Levey Jennings en base a los
resultados de la media y desviación estándar obtenida de los valores de la repetición diaria de los
resultados de estos sueros.
2.4.3. Uso del suero Control interno
Se debe mantener las alícuotas del suero control interno en viales y conservarlos a -20°C
Realizar de aproximadamente 40 determinaciones del suero control interno en diferentes días (en 4 a 6
días) para cada marcador serológico. Para la construcción de la gráfica deberá considerarse el excluir los
valores extremos (outliers). Para identificar los valores outliers se calcula el valor de Z, valores superiores
a Z son outliers.
Para cada marcador se debe calcular la relación densidad óptica/cut off o valor de corte (DO/CO) de las
determinaciones realizadas por marcador.
Se calcula la media y la desviación estándar ( ±2s y ±3s) de los datos obtenidos en el proceso y construir
la gráfica. Se debe incluir en cada corrida el suero control interno. Se calcula la relación DO/CO de las
corridas sucesivas y ubicar los puntos en la gráfica elaborada para cada marcador.
Gráfica de Control de Levey Jennings, Ejemplo:

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INMUNOLOGÍA
2.4.4. Interpretación de la Gráfica de Control de Levey Jennings
En el control de calidad interno, la aplicación diaria de la gráfica permite al laboratorio observar cuando
se producen irregularidades que se reflejan en los valores del control interno. Se puede observar:
• Que el valor obtenido está fuera del límite de ± 2s.
• Que varios valores consecutivos muestran una tendencia al alza o sea valores cercanos al límite
superior.
• Que varios valores consecutivos muestran tendencia a la baja, o sea valores cercanos al límite inferior.
Cuando los resultados de los sueros control interno caen fuera de los límites establecidos, deberán
tomarse las medidas correctivas establecidas en el sistema de calidad.
Recomendaciones generales:
• Las muestras de suero por procesar no deben presentar hemólisis, ictericia, lipemia ni contaminación
(turbidez). Deben estar debidamente etiquetadas con el nombre o rotuladas con el código, fecha de
obtención de muestra y deben ser conservadas en refrigeración (4-8°C), hasta su procesamiento. De no
ser así guardadas en congelación hasta una o dos semanas a -20°C.
• No usar reactivos o kits con fechas vencidas.
• Emplear equipos e instrumentos en óptimas condiciones, con mantenimiento y calibración (balanza,
potenciómetro, lector ELISA, lavador de placas, microscopio para inmunofluorescencia, micropipetas).
• Seguir los instructivos de uso de cada equipo. Tener en cuenta la rutina básica de mantenimiento
requerido por cada equipo. Chequear los filtros del lector ELISA antes de iniciar los ensayos y llevar el
registro de tiempo de uso de la lámpara del microscopio para inmunofluorescencia. Se debe realizar lo
mismo con otros equipos de laboratorio.
• Realizar el control diario de la temperatura ambiente del laboratorio y de los siguientes equipos:
refrigerador donde se conservan los kits, estufa empleada para los pasos de incubación 37°C,
congeladora donde se conservan los sueros controles y otros reactivos y el baño María.
• Durante en el procesamiento de las muestras se debe seguir estrictamente las instrucciones descritas
en el manual de procedimientos operativos o en los insertos proporcionados por el fabricante de
reactivos que estemos utilizando.
• Incluir en cada ensayo el control interno además de los controles positivo, negativo y blanco de
reactivos propio de cada técnica.
• Analizar la validez del ensayo considerando los parámetros establecidos en el kit y el resultado del
control interno.
2.5.Control de calidad externo o evaluación externa de la calidad (PEEC)
La participación en programas de evaluación externa, permite evaluar el desempeño del laboratorio,
esta actividad por lo general la desarrolla el Laboratorio de Referencia Nacional de cada país mediante
un convenio con un organismo internacional acreditado y certificado para este fin.
El laboratorio o institución interesada en los PEEC puede hacer compra de estos servicios de manera
directa. Los centros evaluadores remiten las muestras en paneles ciegos a los laboratorios a evaluar. El
evaluado debe procesar las muestras en las mismas condiciones de la rutina diaria. Luego se envía los
resultados obtenidos en formulario expreso remitido por el evaluador. El evaluador enviará las
inconformidades o las observaciones a los resultados con el fin de cooperar para que los laboratorios
participantes apliquen las medidas correctivas necesarias a sus procedimientos o instrumentos de
medición para garantizar la calidad de los resultados.

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INMUNOLOGÍA
2.6.Control de calidad interlaboratorio
Este tipo indirecto de control de calidad (test de pro eficiencia), permite evaluar y hacer el seguimiento
del desempeño de varios laboratorios a la vez y que nos permite evaluar una o más pruebas, identificar
problemas y mejorar los procesos que realizamos. El rol en la ejecución y programación del control
interlaboratorial es asumido generalmente por el Laboratorio de Referencia Nacional. Es importante este
tipo de evaluación de la calidad debido a que permite comparar los valores promedio y coeficientes de
variación para un determinado analito por parte de los diferentes laboratorios participantes.
Pizarra
4. CUESTIONARIO:
1.- ¿Cuáles son los factores que podrían influir para que se presenten errores de precisión y exactitud
durante el desarrollo de una prueba?
Determine:
2.-sensibilidad, 3.-especificidad, 4.- valor predictivo, positivo 5.- valor predictivo negativo, y 5.- eficiencia
aparente de una técnica, en una población de 448 animales de laboratorio donde de acuerdo con la
técnica de referencia (100%fiabilidad) existen 112 animales enfermos. Por el método que usted está
evaluando, de los 112 enfermos han sido detectados como positivos 76 y 36 como negativos, y de los
336 sanos 328 han sido detectados como tales y 8 como positivos.
6.- Se tiene un kit comercial que refiere una sensibilidad del 90,5%, este cálculo fue realizado en una
muestra de 2000 individuos y una especificidad del 92%para una muestra de 2500 individuos. Calcule los
valores predictivos positivo y negativo de la prueba.
7.- ¿Qué otras medidas de bioseguridad y que no estén sugeridas en la práctica usted plantearía?
8.- En base a los símbolos de riesgo en los reactivos, de un ejemplo de un reactivo para cada uno de los
íconos de riesgo.
9.- ¿La bibliografía corresponde al formato APA, si no es así, como debería ser referenciada.
Ayres, G.H. (1982). Análisis Químico Cuantitativo. Editorial Harla. México, D.F.
Profesores de la Academia del CECyT Miguel Othón de Mendizábal. (1990) Técnica Instrumental.
Instituto Politécnico Nacional (I.P.N.)} México, D.F.
Yaroslavtsev, A.A. (1979). Colección de Problemas y Ejercicios de Química Analítica. Editorial Mir. Moscú,
U.R.S.S. Science; 2002.

14
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 3
PREPARACIÓN DE REACTIVOS DE TRABAJO PARA LAS PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA
1. OBJETIVO:
Realizar los cálculos de preparación de los reactivos que se emplearán durante las prácticas de la
asignatura.
2. ANTECEDENTES:
Esta práctica de laboratorio está diseñada con el propósito de reforzar los conceptos referentes a la
preparación de soluciones, diluciones y de que el estudiante adquiera la habilidad y destreza en los
cálculos de concentración de las soluciones que resultan a partir de mezclas y diluciones de otras
soluciones. Además, el estudiante aprenderá a determinar si los métodos de diagnóstico por laboratorio
que emplearan en la rutina diaria realmente son eficientes en relación al diagnóstico o descarte de una
determinada enfermedad.
2.1. Soluciones
Las soluciones son mezclas homogéneas de dos o más substancias, que pueden separarse por métodos
físicos en sus diversas substancias componentes. En una solución, aquella substancia que se encuentra
en mayor proporción se conoce como “solvente” y las demás como “solutos”. Las soluciones verdaderas
difieren de las suspensiones y de los sistemas coloidales, fundamentalmente en el tamaño de partícula
del soluto o de la fase dispersa y en las propiedades que derivan de dicha diferencia. En general, las
soluciones verdaderas en fase líquida cuando son decantadas no desprenden soluto ni tienen la
propiedad de dispersar la luz. No se debe olvidar que existen soluciones sólidas como las amalgamas y
las aleaciones o soluciones gaseosas como el aire. En lo que respecta al medio ambiente y a la vida
diaria, las soluciones más frecuentes son las soluciones en fase líquida, y dentro de ellas, las soluciones
acuosas. Algunos ejemplos de soluciones acuosas pueden encontrarse en las aguas de consumo, las
aguas residuales domésticas, los vertimientos líquidos industriales vertidos y en general, en las aguas
residuales procedentes de cualquier actividad antrópica.
La solubilidad de los solutos gaseosos en el agua, (oxígeno, nitrógeno, bióxido de carbono, metano,
sulfuro de hidrógeno, etc.), es directamente proporcional a la presión e inversamente proporcional a la
temperatura. A diferencia de esta ley general, la solubilidad de los solutos sólidos en el agua no puede
describirse con tanta rigurosidad como en el caso de los gases; sin embargo, en la mayoría de los casos
se observa que la solubilidad de un sólido en el agua aumenta con la temperatura; La solubilidad del
sólido también suele ser mayor, cuanto menor es el pH del medio.
Las propiedades de las soluciones pueden clasificarse en dos categorías: Aquellas que dependen
exclusivamente de la concentración de partículas en solución, independientemente de su naturaleza,
(Propiedades Coligativas o Colectivas) y aquellas que dependen fundamentalmente de la naturaleza de
las partículas del soluto, más que de la cantidad, (Propiedades No-Colectivas).

15
INMUNOLOGÍA
Las propiedades No-Coligativas de las soluciones permiten clasificar los diferentes solutos y sus
soluciones, como substancias o soluciones electrolíticas y no electrolíticas. Las propiedades coligativas de
las soluciones dan origen a fenómenos como la ósmosis y la reducción de la presión de vapor del agua.
2.1.1. El Proceso de Disolución
Cuando un cubo de azúcar o de cualquier substancia hidrosoluble se introduce en un vaso lleno de agua,
se observa que al cabo de un corto tiempo este se desvanece sin dejar rastro alguno de su presencia en
el fondo del vaso. Esta aparente desaparición del soluto indica que la disolución es un proceso
espontáneo de dispersión molecular del soluto en el solvente o en todo caso, a una escala muy pequeña.
Asumiendo la disolución como un proceso de dispersión molecular, es claro que esta implica entonces la
ruptura de los enlaces intermoleculares presentes en el soluto y la generación de enlaces entre las
moléculas del solvente y las moléculas del soluto. Este proceso se conoce como “solvatación”. De forma
general, la ruptura de los enlaces intermoleculares en el soluto es un proceso que consume energía
mientras que la formación de nuevos enlaces Soluto--Solvente, es un proceso que libera energía.
Cuando una substancia hidrosoluble se sumerge en el agua la disolución se da espontáneamente, debido
a que el proceso de disolución conduce a un aumento en la entropía del sistema. Cuando la energía
requerida para romper los enlaces intermoleculares del soluto es mayor que la energía liberada en la
solvatación, el sistema en su conjunto absorbe el excedente energético de los alrededores, hecho que se
manifiesta mediante una reducción de la temperatura. Cuando la energía requerida para romper los
enlaces intermoleculares del soluto es menor que la energía liberada en la solvatación, el sistema en su
conjunto cede el excedente energético a los alrededores y este hecho se manifiesta mediante un
aumento en la temperatura del sistema.
Adicionalmente, para que se produzca el proceso de disolución, es necesario que exista afinidad o
semejanza entre las moléculas del solvente y las moléculas del soluto. Esta condición se resume en el
adagio químico de que “lo semejante disuelve a lo semejante”. Así, las substancias fuertemente polares
como el agua, disuelven solutos polares como el alcohol, las sales, los ácidos y las bases. A su vez, los
solventes no polares como el hexano, disuelven solutos no polares como las grasas.
2.1.2. La Solubilidad
Todas las substancias difieren ampliamente en el grado de solubilidad frente a un solvente específico.
Con el fin de poder comparar la capacidad que tiene un determinado solvente para disolver una
determinada cantidad de soluto, se emplea la propiedad fisicoquímica llamada Solubilidad. Esta, se
define como la concentración de saturación de un soluto en un solvente, a una temperatura dada. Los
valores de solubilidad en agua para diferentes solutos inorgánicos, se expresan generalmente en tablas,
en términos de constantes conocidas como “Constantes del Producto de Solubilidad, KPS.

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INMUNOLOGÍA
2.2. Expresión de la Concentración de una Solución
Existen varias formas de expresar la concentración de una solución, esto es, la proporción de soluto a
solvente. Para efectos cualitativos, frecuentemente se habla de “soluciones diluidas, concentradas,
saturadas o sobresaturadas” para referirse a soluciones que contienen “poco, mucho, el máximo o más
del máximo” de la cantidad máxima de soluto que el agua puede contener a una determinada
temperatura. Así por ejemplo, una solución de ácido clorhídrico cuya concentración sea de
aproximadamente el 1 %, podría ser una solución diluida. Una solución al 10 % podría ser una solución
concentrada. Una solución al 35 % podría ser una solución saturada y una solución al 38 % una solución
sobresaturada. Téngase en cuenta que la cantidad máxima de HCl que puede disolver a 20°C es del
orden del 35,5%. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las descripciones cualitativas de la proporción
de soluto a solvente en una solución, no son suficientes y es necesario entonces, precisar
matemáticamente esta proporción. Aunque existen diversas formas de expresar matemáticamente la
proporción de soluto a solvente dentro de una solución, las de uso más extendido suelen ser Molaridad,
el Porcentaje Peso a Volumen, el Porcentaje Peso a Peso y las Partes por Millón.
2.2.1. Molaridad
La molaridad es por excelencia, la mejor forma de expresar la concentración de una solución en trabajos
de química, física, biología o ingeniería. La Molaridad es por definición, el número de moles de soluto
que se hallan contenidos en un litro de solución y se representa por M. Así, por ejemplo, una solución
0,01 M es una solución que contiene 0,01 moles de soluto en cada litro de solución. Una solución 2,0
molar es una solución que contiene 2,0 moles de soluto por cada litro de solución. La molaridad, además
de ser una forma de expresión de la concentración de amplia aceptación, también es una forma práctica
para referirse a ella, cuando se trata de prepararla en el laboratorio. Así por ejemplo, se pueden pesar
fácilmente 0,01 moles de CaCO3 y disolverlos después en un matraz de un litro, para preparar una
solución 0,01 M de CaCO3.
2.2.2. Porcentaje Peso a Peso
El porcentaje Peso a Peso es una relación que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos en
cada 100 gramos de solución. Esta forma de expresar la concentración implica al momento de preparar
la solución, pesar separadamente el soluto y el solvente; aunque este procedimiento facilita la
comprensión de la concentración y hasta cierto punto su preparación, la aplicación de estas soluciones
en el laboratorio se dificulta debido a que obliga a conocer también, la densidad de la solución. Si a esto
se le suma el hecho de que los volúmenes de soluto y solvente, generalmente no son aditivos en las
soluciones, las dificultades empeoran.
La expresión porcentual peso a peso en las soluciones se conserva particularmente, para las soluciones
acuosas de los ácidos y de las bases cuya presentación como reactivo, viene disuelta en agua: el HCl, el
HF, el HBr, el HNO3, el H2SO4, el H3PO4, el CH3COOH y el NH3. Para facilitar el manejo de estas
soluciones, la concentración peso a peso de la solución se acompaña con su densidad a 20°C.

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INMUNOLOGÍA
2.2.3. Porcentaje Peso a Volumen
El porcentaje Peso a Volumen es una relación que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos
en cada 100 mililitros de solución. Esta forma de expresar la concentración de una solución facilita
enormemente su preparación y aplicación. Desafortunadamente, el porcentaje peso a volumen suele ser
una unidad muy grande para muchos fines analíticos. Generalmente cuando se expresa la concentración
de una solución en términos porcentuales, casi siempre la expresión se refiere al porcentaje peso a
volumen.
2.2.4. Partes por Millón
La expresión porcentual o molar para referirse a la concentración de una solución, se aplica
generalmente a las soluciones en las cuales la proporción de soluto a solvente es relativamente alta,
proporción que generalmente se halla en la escala de las “Partes por Mil”. Sin embargo, existen muchas
substancias cuya concentración normal en el agua es mucho menor que las partes por mil. Es en estos
casos cuando la expresión en términos de las Partes por Millón o ppm, se hace necesaria.
Las Partes por Millón son una relación que expresa las partes de soluto que se hallan contenidas en un
millón de partes de solución. Así, las partes por millón son equivalentes a los gramos de soluto por metro
cúbico de solución, a los gramos de soluto por tonelada de solución o a los miligramos de soluto por
kilogramo de solución. Esta forma de expresar la concentración de una solución se utiliza
particularmente para soluciones diluidas, Ejemplo: un kilogramo de agua equivale a un litro en términos
de volumen, entonces, las partes por millón se aproximan a los miligramos por litro. Las partes por
millón son la forma como se expresa normalmente la concentración de substancias como hierro,
manganeso, sulfatos, nitratos, grasas y aceites y metales pesados en el agua. Para algunas substancias
aún menos frecuentes en el agua, tales como los hidrocarburos aromáticos, los fenoles los pesticidas, el
mercurio, el plomo, etc., las ppm resultan ser una unidad aún muy grande. En estos casos se emplean las
partes por billón y de ser necesario, las partes por trillón.
2.3. Preparación de Soluciones
Uno de los problemas que con mayor frecuencia se deben resolver en un laboratorio, lo constituye el
acondicionamiento de la concentración de las soluciones a las necesidades específicas de los diferentes
usos; con frecuencia, la concentración de las soluciones de partida dista mucho de ser la requerida en las
soluciones de trabajo.
Así por ejemplo, las soluciones de trabajo de los ácidos clorhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico y acético,
se preparan normalmente por dilución de soluciones concentradas. Por otra parte, en trabajos
ambientales por ejemplo, el análisis de una muestra puede requerir de un proceso de dilución, como
parte de la preparación de la muestra. Todos estos procesos de dilución emplean cálculos que es preciso
conocer para poder realizar.

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INMUNOLOGÍA
2.4. Análisis Volumétrico
En el análisis volumétrico se determina la concentración de una solución cuya concentración se
desconoce, midiendo el volumen que se requiere de ella para reaccionar con un volumen fijo de una
solución cuya concentración es perfectamente conocida. El proceso de adición de un volumen medido
de la solución de concentración conocida para que reaccione con el soluto contenido en un volumen fijo
de la solución de concentración desconocida se conoce como “Valoración Volumétrica”. La solución de
concentración conocida se conoce como Solución Patrón y la de concentración desconocida como
Solución Problema. El punto en el cual la cantidad del soluto contenido en un volumen fijo de Solución
Patrón, equivale químicamente a la cantidad de soluto contenido en un volumen fijo de la Solución
Problema, se conoce como Punto de Equivalencia o Punto Estequiométrico. Las valoraciones
volumétricas se realizan en montajes como el indicado en la figura y los puntos de equivalencia se
determinan mediante el uso de indicadores.
El reactivo que se adiciona desde la bureta se conoce como “Agente Titulante” y la substancia que
reacciona con él y que se halla presente en la solución problema se conoce como “Agente Titulado”. De
esta forma, un “Indicador” es una substancia que reacciona con el agente titulante pero cuya constante
deformación es menor que la correspondiente al producto de la reacción entre el agente titulante y el
agente titulado.
Como ya se dijo antes, en el punto final de una valoración volumétrica la cantidad del agente titulado
debe ser igual a la cantidad del agente titulante o lo que es lo mismo, en el punto final de una valoración,
las concentraciones de los solutos reaccionantes deben ser equivalentes. Por tal razón: Hecho este que
se resume generalmente mediante la ecuación, V1 x C1 = V2 x C2. Y puesto que la concentración puede
expresarse en términos de Molaridad o Normalidad, entonces se particulariza a V1 x M1 = V2 x M2 o V1
x N1 = V2 x N2.
2.5. Diluciones
Considérese el caso de una muestra de agua de mar a la que se le desea medir su concentración de
cloruro, calcio y magnesio. Ya que la concentración de estos iones en el agua de mar es demasiado alta
como para poder realizar la medición directamente, normalmente se procede a diluir la muestra, antes
de realizar la medición propiamente dicha.
Supóngase entonces que se toman 25 ml de la muestra original en un matraz aforado, y se diluyen a 250
ml con agua destilada, (Solución A). Luego de homogenizar la solución recién preparada, se toman ahora
10 ml de esta solución en un matraz aforado y se diluyen nuevamente con agua destilada hasta 250 ml,
(Solución B). Si posteriormente se realizan las determinaciones sobre la solución B y se encuentra que en
ella las concentraciones para calcio, magnesio y cloruro son respectivamente 15, 45 y 85 ppm, ¿cuál será
entonces la concentración de estos elementos en la muestra original?
Si se toman 10 ml de la solución A y se diluyen a un volumen de 250 ml con agua destilada, todas las
substancias que se hallaban disueltas en A, estarán ahora en la solución B, 25 veces más diluidas. En

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INMUNOLOGÍA
general, en las operaciones de dilución, el volumen final al cual se lleva una dilución, dividido por el
tamaño de la alícuota, se conoce como el “Factor de Dilución”.
El factor de dilución es entonces, el número por el cual se debe multiplicar la concentración de un soluto
en una Dilución, para reproducir la concentración de la muestra original. Así, el factor de dilución para
pasar de la muestra original a la Solución A, será igual a 250 ml/25 ml = 10.
A su vez, el factor de dilución para pasar de la Solución A hacia la Solución B, sería igual a 250 ml/10 ml =
25. Por lo tanto, el factor de dilución para pasar de la muestra original a la Solución B, será igual a 10 X
25 = 250. Esto significa que la concentración en la muestra original es 250 veces mayor que la
concentración en la solución B, donde se realizaron las mediciones.
Si bien las diluciones de las soluciones son operaciones muy comunes en los laboratorios, en algunas
ocasiones se hace necesario realizar el proceso inverso, es decir las concentraciones. Así, por ejemplo, el
análisis de una muestra de agua lluvia exige concentrar la muestra, por cuanto las concentraciones de las
substancias de interés son tan bajas que escapan de los métodos convencionales de análisis. El
procedimiento para realizar los cálculos es similar pero contrario al de las diluciones.
2.6. Mezclas de Soluciones
Otra de las operaciones frecuentes en un laboratorio es la determinación de la concentración de una
solución que ha sido preparada por mezcla de diferentes volúmenes de diversas soluciones.
Considérese por ejemplo que se desea conocer la concentración de azúcar y cloruro de sodio de un
coctel que ha sido preparado por combinación de 100 ml de gaseosa, 200 ml de cerveza y 700 ml de
agua, sabiendo que la gaseosa contiene 2 g/l de cloruro de sodio y 10 g/l azúcar, (C6H12O6), mientras
que la cerveza contiene 1 gramo de cloruro de sodio por litro y 2 g/l de azúcar.
La concentración de una mezcla de soluciones se puede calcular fácilmente a partir de las cantidades de
soluto contenidas en cada una de las alícuotas, sumándolas y refiriéndolas al volumen total de la mezcla
o nueva solución, es decir, a la suma de los volúmenes de cada una de las soluciones que componen la
mezcla.
Como puede verse, resulta muy práctico realizar este tipo de tablas para calcular la concentración de una
mezcla de soluciones. Es evidente entonces que la composición de la mezcla será, de 1,4 g/L en azúcar y
0,4 g/L en cloruro de sodio.
2.7. Pruebas (test) diagnósticas
Como personal de salud no tardamos en reconocer que nuestras pruebas y procedimientos no son
perfectos y tratamos de hacer lo posible para que nos brinden la máxima probabilidad de identificar
quienes son sanos y quienes son enfermos. Las pruebas de diagnóstico nos permiten interrelacionar la
probabilidad de cuatro resultados posibles, dos correctos (VP y VN) y dos incorrectos (VN y FN).

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INMUNOLOGÍA
2.7.1. Pruebas discriminatorias
Son aquellas cuyo objetivo es la detección temprana en el curso de la enfermedad posibilitando el
tratamiento más eficaz y una mejor sobrevida de un determinado paciente.
Reglas para la selección de las pruebas: que la morbilidad y la mortalidad sea de tal importancia que
justifique el esfuerzo, conocer que la intervención temprana reduce su repercusión, que sean dirigidas a
la población de alto riesgo, que sean de la máxima sensibilidad y especificidad analítica, que no
impliquen riesgos o que ellos sean mínimos, que los estudios posteriores sean aceptables, que exista y
sea posible un tratamiento eficaz o un resultado de laboratorio de alta eficacia
2.7.2. Relación entre sensibilidad y especificidad
Existe una relación que debemos conocer entre la sensibilidad y especificidad. Muy pocas pruebas nos
brindan al mismo tiempo altos valores de sensibilidad y especificidad, el hecho habitual es que la
sensibilidad y la especificidad se modifiquen en relación inversa. Esto es más evidente cuando la
probabilidad de enfermedad depende del nivel de variables fisiológicas y del punto de corte (cut off) es
decir aquel que se toma en consideración para que la prueba cambie de negativa a positiva.
Como profesionales tenemos que elegir aquellas pruebas que nos brinden la mínima posibilidad de
falsos positivos y falsos negativos, ellas se expresan dos maneras, como la razón de máxima verosimilitud
(RMV) o como las curvas de características operador receptor (ROC).
La RMV nos ofrece dos posibilidades:
RMV Positiva = sensibilidad /1-especificidad.
(Se aceptan valores elevados como confiables).
RMV Negativa= 1-sensibilidad /especificidad.
(Se aceptan valores menores como confiables)
Existe un listado de RVM de las pruebas clínicas.
Las curvas ROC: para construir una curva ROC se traza un sistema de coordenadas cartesianas, en la
ordenada la sensibilidad (tasa de verdaderos positivos) y en la abscisa 1- especificidad (tasa de falsos
positivos). Se representa así gráficamente el valor diagnóstico de las pruebas. Fijamos un punto en una
variable y decidimos que a partir del mismo existe una determinada patología, ese punto denominado de
corte y se lo puede obtener a través de estudios descriptivos o prospectivos.
Una prueba perfecta sería aquella que se eleva verticalmente hacia el ángulo superior izquierdo y la que
tiene un trayecto diagonal es considerada como inútil.
Es un método valioso para comparar pruebas alternativas de un mismo diagnóstico, a mayor área bajo la
curva podemos decir que mejor es la prueba.

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INMUNOLOGÍA
Se debe tener siempre en cuenta las diferencias que establecidas en los pacientes en los cuales se
aplican las pruebas, ya que no todos están en las mismas etapas evolutivas de la enfermedad y las
diferencias individuales.
¿Qué pruebas usar?
Para una determinada enfermedad que tipo de prueba debemos usar? pruebas de alta especificidad o
alta sensibilidad?
¿Qué nos permiten las pruebas sensibles y qué las especificas? Preferir determinadas características de
las pruebas tienen que ver con los propósitos que cada uno considere como los más adecuados, si se
pretende "detectar" enfermedad se utilizaran pruebas de alta sensibilidad, de bajo costo, rápidas
incruentas y baratas, si se quiere confirmar enfermedad usaremos pruebas de alta especificidad y
sensibilidad.
La seriedad del pronóstico necesita pruebas de alta especificidad, es decir aquellas que tengan muy
pocos falsos positivos, esto se hace más notorio cuando un falso positivo puede traer importantes
perjuicios a los pacientes. Las enfermedades de gravedad implícita que puedan ser tratadas
exitosamente, aun cuando sean de baja prevalencia deberán recibir nuestra máxima de atención.
PATOLOGIA
ENFEMOS SANOS
PRUEBA
POSITIVA (+) VP FP Total positivos = VP+FP
NEGATIVA (-) FN VN Total negativos = FN+VP
Total enfermos = VP+FN Total sanos = FP+VN TOTAL = VP+FP+FN+VN
VP = Verdaderos positivos
VN = Verdaderos negativos
FP = Falsos positivos
FN = Falsos negativos
En este contexto se utilizan dos índices para evaluar la calidad de la prueba diagnóstica:
Aunque la sensibilidad y especificidad diagnóstica son dos índices de calidad de la prueba, en la práctica
clínica las preguntas a las que interesa responder son: si un sujeto ha resultado positivo, ¿cuál es la
probabilidad de que esté verdaderamente enfermo? P(E+/T+), o por el contrario, si el sujeto resultó
negativo en la prueba ¿cuál es la probabilidad de que realmente esté sano? P(E-/T-). Estas dos

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INMUNOLOGÍA
probabilidades se pueden calcular aplicando el teorema de Bayes, siempre que sepamos la probabilidad
de que el sujeto esté enfermo antes de realizar la prueba, que se conoce como probabilidad pre-prueba.
Si no tenemos ninguna información adicional sobre el sujeto, dicha probabilidad será la prevalencia de la
patología en la población, aplicable sólo en el caso de programas de cribado o "screening" sobre la
población general, ya que en la práctica habitual los sujetos candidatos a una prueba diagnóstica lo son
por las sospechas deducidas de la anamnesis o por una sintomatología previa, y por tanto la probabilidad
de que padezcan la enfermedad bajo sospecha será superior a la prevalencia de ésta en la población
general.
Si llamamos P a la probabilidad pre-prueba de padecer la enfermedad, S a la sensibilidad de la prueba y E
a su especificidad, tenemos las siguientes fórmulas para calcular la probabilidad post-prueba de que el
sujeto esté enfermo cuando resultó positivo o de que esté sano cuando resultó negativo:
Donde la probabilidad condicional la hemos representado de la forma habitual con el símbolo /. Así
Pr(E+/T+) significa suceso E+ (enfermo) condicionado a que haya ocurrido el suceso T+ (resultado + en la
prueba).
Si calculamos estas probabilidades únicamente con los datos de nuestra tabla, la primera de ellas
P(E+/T+) corresponde a la proporción de sujetos que verdaderamente tienen la enfermedad, de entre los
que dieron positivo, y se conoce como valor predictivo positivo VP+
Igualmente podemos calcular en la tabla la proporción de sujetos verdaderamente sanos sobre el total
de los que dieron negativo, valor predictivo negativo VP-
3. MATERIALES:
• Pizarra
4. CUESTIONARIO:
Determinar:
1.- Sensibilidad, 2.-Especificidad, 3.- Valor predictivo, positivo 4.- Valor predictivo -negativo, y 5.-
Eficiencia aparente de una técnica, en una población de 4500 animales de experimentación donde de
acuerdo con la técnica de referencia (100% fiabilidad), donde de los 2500 verdaderos enfermos han sido
detectados como positivos 1750 y el resto como sanos, y de los 2000 verdaderos sanos 1800 han sido
detectados como tales y el resto como enfermos.

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INMUNOLOGÍA
6.- ¿Que indicadores estadísticos se podrían utilizar para evaluar datos apareados?
7.- Defina las fórmulas de molaridad, molalidad, normalidad, densidad, concentración peso/peso y
concentración peso/volumen.
8. Considérese el caso de una muestra de agua rica en iones a la que se le desea medir su concentración
de Aluminio, Hierro y Cloro. Ya que se tiene antecedentes de que la concentración de estos iones en la
muestra es muy alta como para realizar la medición directamente, debemos diluir la muestra, antes de
realizar la medición propiamente dicha.
Supóngase entonces que se toman 25 ml de la muestra original en un matraz aforado y se diluyen a 250
ml con agua destilada, (Solución A). Luego de homogenizar la solución recién preparada, se toman ahora
10 ml de esta solución en un matraz aforado y se diluyen nuevamente con agua destilada a 250 ml,
(Solución B). Si posteriormente se realizan las determinaciones sobre la solución B y se encuentra que en
ella las concentraciones para aluminio, hierro y cloro son respectivamente 15, 45 y 85 ppm, ¿Cuál será
entonces la concentración de estos elementos en la muestra original?
9. Usted ha estandarizado una prueba de ELISA, está trabajando con 96 micropozos y estos deben ser
lavados con 250 µl del Tampón de lavados. ¿Qué cantidad de tampón necesitaría para realizar 6 lavados
a cada uno de los pocillos? Al volumen final obtenido añada otros 6 ml de tampón para que este esté en
exceso.
10. Usted estandarizó su prueba de ELISA tiene alícuotas del tampón de lavados diluidas a un título
(1/100), pero para realizar sus lavados usted necesita que este a un (1/320). ¿Qué volumen de la dilución
(1/100) debe tomar para preparar en volumen final “X” que halló en la pregunta 9) y que este tenga a su
vez una dilución final de (1/320).
11. Prepare un litro una solución de PBS a pH 7,0 que contenga: (137 mM de NaCl; 2 mM de KCl; 10 mM
de Na2HPO4; 10 mM de KH2PO4).
12. A partir de los datos de la pregunta (11). Prepare una solución de PBS 10X
13.- Prepare 100 ml de una solución de Versene (PBS + 5 nM de EDTA.2Na).
14. Usted ha estandarizado una prueba de ELISA, y en sus experimentos ha determinado que la reacción
debe ser detenida con una solución de HCl 1N. Prepare 100 ml de esta solución a partir del reactivo
químicamente puro.
15. El azul de Evans al 0,4% es el colorante de contraste para las pruebas de IFI. Prepare 200 ml de esta
solución (diluyente =PBS)

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INMUNOLOGÍA
16. Para determinar anticuerpos anti-mitocondriales por ELISA se requiere hacer la dilución de la
muestra 1/21 para un volumen de 200 µl.
17 Para determinar anticuerpos anti-nucleares por inmunofluorescencia indirecta se requiere hacer
diluciones seriadas de la muestra problema 1/40, 1/80 y 1/160, realice estas diluciones para un volumen
final de 300 µl por tubo.
18. Prepare 500 ml una solución 0,3 molar de ácido sulfúrico a partir del reactivo químicamente puro.
19. A partir de una alícuota de glóbulos rojos de carneros lavada y concentrada, prepare una suspensión
de glóbulos rojos de carnero con un hematocrito del 5%.
20. Para determinar anticuerpos anti-papiloma virus se requiere utilizar el conjugado fluorescente (IgG
anti humana-FITC) a titulo final 1/120 (solución de trabajo). A partir de una solución stock 1/10, preparar
el volumen necesario de la solución de trabajo para 30 µl por pozo en una placa de 10 pozos.
21. Usted debe preparar un litro una solución de PBS que contenga: (137 mM de NaCl; 2 mM de KCl; 10
mM de Na2HPO4; 10 mM de KH2PO4), en el laboratorio usted no cuenta con Na2HPO4 ni cuenta con
KH2PO4, solo cuenta con Na2HPO4.7H2O; 10 mM de KH2PO4.2H20. Tome en cuenta esta consideración
para preparar su buffer.
22. Usted está haciendo un ensayo para ver la toxicidad de un alcaloide antimicrobiano sobre células
humanas. La solución stock de alcaloide esta la concentración de 1 mg/ml. Usted debe evaluar su
citotoxicidad a las concentraciones de 50 µg/ml, 25 µg/ml y 10 µg/ml. Las células mononucleares
humanas fueron obtenidas por gradiente de densidad con una viabilidad de 99%, en un volumen de 1 ml
y a una concentración de 25x106
células/ml. Usted debe realizar el experimento en una placa de cultivo
celular de 24 alveolos en un volumen final de 1 ml. En cada alveolo debe haber la concentración de
1x106
cel/ml Debe realizar el ensayo por triplicado.
23.- A partir de una sustancia X de concentración 25 mg/ml, realice 9 nueve diluciones seriadas en la que
el noveno tuvo se tenga un volumen final de 1,5 ml y una 5 concentración de 5 ng/ml.

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INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 4
CAPACIDAD FAGOCÍTICA DE LAS CÉLULAS DEL SITEMA INMUNE
1. OBJETIVOS:
Conocer las células que intervienen en el proceso de fagocitosis
Comprender el mecanismo y los pasos que se dan durante el proceso de la fagocitosis
Observar células fagocíticas y relacione el protocolo práctico con los conocimientos teóricos
2. ANTECEDENTES:
A finales del siglo XIX existían dos teorías opuestas sobre los fundamentos biológicos de las respuestas
inmunes. Una de ellas era la teoría humoral de la respuesta inmune por Emil von Behring y Paul Ehrlich y
por otra parte la del zoólogo ruso Ilya Mechnikov (1845-1916) que había realizado observaciones sobre
la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua, estableció, a partir de 1883, su "Teoría de los
fagocitos", tras estudiar fenómenos de englobamiento de partículas extrañas por los leucocitos de
conejo y de humanos, informó que existían fenómenos de eliminación de agentes patógenos por medio
de "células devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y explicó
la inmunización como una "habituación" del hospedador a la fagocitosis. Más tarde, ya integrado en el
Instituto Pasteur, propugnó la idea de que los fagocitos segregan enzimas específicas, análogas a los
"fermentos" digestivos (1900). Esta teoría de los fagocitos constituyó el núcleo de la teoría de la
inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de
defensa inmune del organismo contra microorganismos. En 1903 un médico inglés Almoth Wrigth
demostró que ciertos factores circulantes de la inmunidad humoral “opsoninas (derivado de palabra
griega que significa preparado para comerse)” recubrían bacterias haciéndolas las susceptibles a la
ingestión por células fagocíticas. Otros factores que estimulan la fagocitosis en las células son: la
sustancia P (macrófagos peritoneales), la neurotensina (SNC), tupsina (macrófagos esplénicos). Las
sustancias opsonizantes con C3b, C3bi, C4b, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, PCR, MBL, etc. Los receptores
celulares presentes en los fagocitos que reconocen estas opsoninas son FcR, CR1y CR3. No se debe
olvidar que la fagocitosis también se puede dar en ausencia de complemento o anticuerpos
opsonizantes, ya que los fagocitos poseen PRRs que reconocen una gran cantidad de PAMPs (Ejm: LPS).
La fagocitosis se puede definir como el proceso por el cual células especializadas buscan, localizan,
identifican e introducen en su citoplasma partículas o gérmenes extraños para destruirlos, digerirlos y
presentar los antígenos derivados vía moléculas MHC o CD1. Esta unión del antígeno a la superficie de
una célula fagocítica especializada (PMN, eosinófilo, células dendríticas, monocito-macrófago, NK), se
produce por un mecanismo inespecífico, de tipo primitivo (ameboide): emisión de pseudópodos y
englobamiento, para crear un fagosoma (10-20 veces mayor que el endosoma) al que se unen lisosomas.
La fusión del fagosoma-lisosoma origina la destrucción de la partícula fagocitada en unos pocos minutos.
La expansión de la membrana en la fagocitosis (emisión de pseudópodos) requiere la participación de los
microfilamentos, cosa que no ocurre en la pinocitosis-endocitosis.
La destrucción del microorganismo en los lisosomas secundarios de los fagocitos se produce por dos
tipos de mecanismos:

26
INMUNOLOGÍA
2.1. Mecanismos dependientes de oxígeno
Se activa una ruta metabólica (hexosa monofosfato) que consume grandes cantidades de oxígeno, lo
que a su vez produce grandes cantidades de radicales tóxicos antimicrobianos (como el O2
-
, H2O2, OH-
,
O2
1
), que a su vez pueden reaccionar para dar otras sustancias tóxicas, como hipocloritos y cloruros.
Estas sustancias provocan una intensa halogenación que afecta a muchas bacterias y virus
.
2.2. Mecanismos dependientes de óxido nítrico (NO)
Las células fagocíticas activadas activan a la enzima óxido nítrico sintetasa inducible quien genera NO a
partir de la arginina y el oxígeno molecular. El NO en un radical libre de corta vida que es altamente
tóxico para los microorganismos.
2.3. Mecanismos independientes de oxígeno
Liberación de enzimas hidrolíticas: lisozima, proteínas catiónicas, proteasas, etc., que ejecutan un efecto
bactericida o bacteriostático.
2.4. Macrófagos
La denominación de macrófagos engloba, en realidad, a una serie de células con características
ligeramente distintas y con funciones similares, distribuidas en varios lugares del organismo. Así, los
macrófagos van a recibir diferentes denominaciones según los diferentes tejidos donde se encuentren. A
este conjunto de células hísticas, se le da la denominación genérica de sistema retículo endotelial o
sistema mononuclear fagocítico. Los macrófagos son células grandes con un solo núcleo, un aparato de
Golgi muy desarrollado, gran cantidad de lisosomas y muy ricos en diferentes tipos de enzimas, entre los
que destacan proteasas, peroxidasas y lipasas. Estas células poseen, además de la capacidad fagocítica ya
indicada, capacidad de adherencia a los tejidos, al vidrio y al plástico, así como una gran movilidad en
estas superficies (quimiotaxis). Los macrófagos tienen una vida media de varios meses. Poseen también
gran actividad metabólica, sobre todo en lo que se refiere a síntesis de proteínas, incluso cuando se
encuentran en reposo. Los macrófagos poseen en su membrana una serie de receptores de gran
importancia funcional, como son los receptores para la fracción Fc de la IgG, receptores para las
fracciones C3bi y C3b del complemento que se conocen como CD11b y CD35 y los receptores para
interleucinas e interferones, todos ellos, de gran interés en la iniciación de la respuesta inmune.
El otro grupo de células, los granulocitos neutrófilos que se caracterizan por poseer una vida muy corta
(vida media de menos de 48 horas antes de entrar en apoptosis) por lo que se encuentran en continua
renovación, para mantener los niveles sanguíneos (la MO produce 1011
/día). Son células de gran tamaño
cuya característica más llamativa es la segmentación del núcleo en varios lóbulos. Se les denomina
también polimorfonucleares neutrófilos. En la sangre estas células se encuentran en período de tránsito
hacia los tejidos, donde esencialmente ejercen sus funciones, al igual que ocurre con los otros tipos de
polimorfonucleares: eosinófilos y basófilos
A las levaduras se unen a las Proteínas Fijadoras de Manosa presentes en la superficie del fagocito
(monocitos, neutrófilo y eosinófilo de sangre periférica), también se pueden unir a los CR1 y CR3 que son
receptores en las células fagocíticas para la opsonina C3b

27
INMUNOLOGÍA
En las fotografías se muestra monocitos de sangre periférica que han fagocitado levadura de cerveza.
2.5. La fagocitosis y la clínica
Los defectos en la capacidad fagocítica de las células se manifiesta en inmunodeficiencias y como efectos
secundarios por quimioterapia. Ejm: en la agranulocitosis por anti-carcerígenos, en deficiencias de la
integrina 2 “deficiencia de la adherencia leucocitaria”. La evaluación de la deficiencia de la capacidad
fagocítica en el laboratorio puede ser medida mediante:
- Conteo de neutrófilos, (neutropenias (< 1000/µl)
- Adherencia
- Quimiotaxis y migración
- Ingestión de partículas o levaduras
- Degranulación
- Estallido respiratorio (indirect killing assay)
- Evaluación de la capacidad microbicida (direct killing assay)
Como ejemplo en la enfermedad ganulomatosa crónica existe un problema en la destrucción intracelular
del agente fagocitado (no genera estallido respiratorio). En la hemoglobinuria paroxística nocturna se
carece de la expresión del FcgRIII por lo cual existe un defecto en la capacidad fagocítica de partículas
opsonizadas por IgG.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
- Material para venopunción
- Perlas de vidrio
- Levadura de pan
- Portaobjetos
- Cajas Petri
- Pipetas Pasteur
- Pipetas de vidrio de 1 y 2 ml
- Tubos de hemólisis

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INMUNOLOGÍA
- Jarra Koplin
- Pizetas
- Estufa de CO2
- Centrifugadora de mesa
- Microscopio óptico
- Vórtex
- RPMI 1640
- SSF 0,9%
- Reactivo de tinción panóptica rápida
- Aceite de inmersión
4. PROCEDIMIENTO
Preparar dos cámaras húmedas en 2 cajas Petri, luego colocar en cada una de ellas un porta objetos
esmerilado desengrasado con la marca “opsonizado, sin opsonizar).
Tomar 3 ml de sangre venosa, transferirla a un tubo de hemolisis que contiene perlas de vidrio y por
inversión suave desfibrinar la sangre. Luego, depositar 1,5 ml de sangre desfibrinada en cada uno de los
portaobjetos que están en las cámaras húmedas e incubar las muestras por 30 minutos a 37ºC.
Preparar 3 ml una suspensión de levaduras al 0,1% en SSF, mezclar bien y llevarlas a incubación a 30ºC
por 30 minutos.
Pasado los 30 minutos de incubación al tubo que contiene las levaduras enrasar hasta 4,5 ml con SSF,
tapar con parafilm, mezclar por inversión y centrifugar por 3 minutos 1500 rpm. Eliminar el
sobrenadante y lavar dos veces más las levaduras con 4,5 ml de SSF. Después del último lavado
resuspender el pellet con 4 ml de medio de cultivo RPMI 1640.
Pasados 30 minutos de incubación con ayuda de una pizeta con SSF, retirar el coagulo del porta objetos.
Luego colocar el portaobjetos sobre cámara húmeda y añadirle 2 ml de la solución de levaduras. Llevar a
incubación por 30 a 45 minutos.
Lavar los portaobjetos con SSF.
Teñir el experimento con tinción panóptica rápida.
Observar al microscopio (aumento 100X) y contar 100 células. En las células contadas determinar
promedio de las células que alcanzó a fagocitar y el promedio de levaduras fagocitadas por célula.
5. CUESTIONARIO:
1.- ¿Qué papel juegan los componentes C3b y C4b en el proceso de fagocitosis?
2.- ¿Qué defectos se pueden presentar en los fagocitos y qué consecuencias para la salud traen consigo
estos defectos en los fagocitos?
3.- Mencione cinco reactantes de fase aguda que tengan propiedad de opsoninas
4.- ¿Qué diferencia existe entre el contenido de los gránulos primarios, secundarios y terciarios de los
neutrófilos?
5.- ¿Cuál es el mecanismo por el cual la lisozima destruye a las bacterias?
6.- Mencione dos PRRs presentes en los macrófagos que puedan reconocer los PAMPs característicos de
los siguientes microorganismos: a) Gram (-), b) Gram (+), levaduras, Virus.

29
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 5
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE ADHERENCIA Y MIGRACION CELULAR
1. OBJETIVO:
Comprender los mecanismos relacionados a los procesos de la adhesión celular y migración celular
2. ANTECEDENTES:
Los antígenos pueden introducirse al organismo prácticamente por cualquier superficie que este
expuesta al medioambiente (superficies en la piel, intestino y pulmones es alrededor de 500 m2
y la
superficie del árbol vascular representa más de 100000 km), los neutrófilos y los monocitos resultan
atraídos desde la sangre hacia los focos infecciosos por su capacidad de unión a las moléculas de
adhesión situadas sobre las células endoteliales y por los factores quimiotácticos producidos en
respuesta al proceso infeccioso. Si no hay una infección u otro tipo de agresión, estos leucocitos circulan
por la sangre y no emigran hacia los tejidos. Su atracción por el estímulo inflamatorio es un proceso
complejo que incluye la adhesión de los leucocitos circulantes a la superficie luminal de las células
endoteliales, el” rolling” que es el rodamiento sobre la superficie del endotelio, la migración tisular a
través de la pared vascular, la quimiotaxis Intra-vascular y posterior migración tisular, cada paso
mediado por selectinas, integrinas y quimioquinas.
Atracción leucocitaria hacia el foco infeccioso. Fuente: Fagocitosis Marcelo Castillo N. y colaboradores.
2006.
2.1.La adherencia
En condiciones normales la interacción entre los leucocitos y las células endoteliales es casi nula.

30
INMUNOLOGÍA
Las moléculas de adhesión celular tienen un papel muy importante en la fisiología de las células
inmunes: linfocitos, monocitos/macrófagos y granulocitos. Asimismo, estas moléculas son las
responsables de la interacción que se establece entre las células del torrente sanguíneo y las células
endoteliales y por lo tanto ejercen un papel clave tanto en fenómenos normales (el tráfico de células
linfoides y la hemostasia), como patológicos (la inflamación, trombosis, metástasis de células tumorales).
Las moléculas de adhesión celular revisten gran importancia en el sistema inmune ya que permitirán la
interacción entre leucocitos y el endotelio vascular, fenómeno indispensable en la generación de la
respuesta inmune. Asimismo, los fenómenos de citotoxicidad y migración de leucocitos hacia sitios de
inflamación dependen de interacciones celulares mediadas primariamente por selectinas y sus
correceptores tipo mucina. La interacción entre estas moléculas condiciona al rolling de los leucocitos
sobre la superficie del endotelio vascular. A decir los neutrófilos que reciben el estímulo quimiotáctico,
experimentan un marcado incremento en la capacidad de adherencia celular incrementando la
expresión de integrinas del complejo CD11/CD18. CD11a/CD18a se expresan en monocitos y PMNs,
CD11b principalmente en PMNs y CD11c principalmente en monocitos. Por ejemplo CD11a (LFA-1) y
CD11b (Mac-1) interactúan con ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 expresadas sobre las células endoteliales. Estas
últimas son expresadas sobre el endotelio por acción de citoquinas proinflamatorias. Luego de la
adhesión viene el proceso de extravasación en la cual participa la molécula PECAM-1 que es expresada
en los sitios de unión intercelular de las células endoteliales.
Las principales familias de moléculas de adhesión se muestran en el siguiente cuadro:
FAMILIA MIEMBROS REPRESENTATIVOS LOCALIZACION
Integrinas β2
LFA-1 LT, NK, PMN, LB-EBV
Mac-1 o Mo-1 PMN, MN
Gp 150/95 PMN, MN, Lc
“De las Igs”
(IgCAM)
ICAM-1 Endotelios
ICAM-2 Endotelios
VCAM-1 Endotelios
Selectinas
Selectina-E Endotelios, plaquetas
Selectina-P Endotelios, plaquetas
Selectina-L Leucocitos
In vitro la capacidad de adhesión celular puede estar influenciada por la temperatura, requerimiento de
cationes divalentes (Mg, Ca) e inhibida por factores presentes en el suero o plasma y por reactivos
sulfhidrilos o por citocalasinas,
2.2.La quimiotaxis
Una gran variedad de estímulos quimiotácticos están involucrados en el reclutamiento de los leucocitos
al espacio extravascular. Estos factores quimiotácticos pueden ser de origen bacteriano (péptidos
LIGANDOS
De las integrinas β2: Adhesinas ICAMs
De las ICAMs: Integrinas β2
De las selectinas: Algunos polisacáridos sulfatados (heparina)
Algunos polisacáridos fosforilados

31
INMUNOLOGÍA
conjugados a la formil metionina), o producto de la necrosis tisular, o por resultados de la activación de
células mononucleares (liberan citoquinas, quimioquinas, activan al complemento o liberan leucotrieno
B4) o finalmente como consecuencia de la activación del sistema del complemento.
Toda reacción inflamatoria en un sitio de lesión tisular, promueve la acumulación de células fagocíticas
en ese sitio (tras el daño tisular se activa el sistema de la plasmina que a su vez activa al sistema del
complemento liberándose los componentes quimioatractantes C3a, C4a y C5a). En lesiones de tipo
agudo, las células predominantes son los polimorfonucleares; en lesiones crónicas, sobre todo en
aquéllas en donde operan los mecanismos de la inmunidad celular, las células predominantes son los
fagocitos mononucleares (monocitos-macrófagos). Los PMN llegan al sitio de la inflamación en las
primeras 4 horas. La migración y activación de los neutrófilos es mediada por la quimioquina IL8 y TNF-.
Una vez que capturan al antígeno los neutrófilos migran hacia los órganos linfoideos secundarios gracias
a las quimioquinas CCL19 y CCL21, allí los neutrófilos realizarán la presentación de antígenos. Se sabe
que cada día en una persona adulta 1011
neutrófilos transitan a través de la circulación sanguínea.
La quimiotaxis es un proceso mediante el cual el leucocito se desplaza orientadamente hacia los agentes
patógenos para fagocitarlos, para llevar a cabo este proceso el leucocito debe cumplir con 6 fases,
marginación, rolling, adhesión, extravasación, diapédesis y fagocitosis. En la fase de la marginación el
leucocito se desplaza hacia la pared del capilar describiendo un movimiento pseudopódico (ameboide)
orientándose por medio de un gradiente de concentración de moléculas de adhesión y quimioquinas en
un flujo sanguíneo turbulento debido al estímulo inflamatorio, una vez próximos a esta pared capilar se
adhieren, finalizando la fase de marginación e iniciando la fase de adherencia. La interacción entre los
factores quimiotácticos y sus receptores sobre las células fagocíticas no solo se inicia la migración
dirigida de estas células, sino que también induce la liberación de enzimas y metabolitos del oxígeno. La
activación del aparato locomotor de los leucocitos involucra la activación del sistema contráctil de la
actina-miosina la cual a su vez es estabilizada por los microtúbulos polimerizados (aquí también juegan
un rol importante la CD11b). La quimiotaxis requiere de energía (ATP) y de la presencia de calcio y
magnesio, lo cual indica que se trata de un proceso metabólicamente activo. Las estructuras
constitutivas del citoesqueleto son los microtúbulos, los microfilamentos y los filamentos intermedios. El
agente que destruye los microtúbulos es la colchicina, por lo cual inhibe la quimiotaxis.
Tanto los polimorfonucleares como los monocitos responden a moléculas que se forman en el tejido
agredido y que los atraen al lugar de agresión. Dos quimioquinas los atraen, la MCP-1 para los
macrófagos y la IL-8 para los polimorfonucleares, los fagocitos poseen en su membrana receptores para
otras sustancias quimiotácticas derivadas de productos bacterianos, del sistema de quininas, del sistema
de fibrinólisis y para productos de la activación del sistema del complemento, C5a, C3a y C4a.
La migración celular es esencial para el desarrollo embriológico y un gran número de procesos biológicos
en el adulto, ejemplo homing de células, angiogénesis, reparación de heridas, metástasis de cáncer.
Existen muchas condiciones en las cuales la capacidad de adhesión al endotelio y la migración celular se
ve afectadas, hecho que predispone a que el paciente sufra infecciones recurrentes o que estas revistan
más gravedad de lo normal que en determinadas circunstancias es incompatible con la vida.
2.3.Deficiencias por defecto en la adhesión leucocitaria (LAD-I, LAD-II y LAD III)
2.3.1. LAD-I.- Se caracteriza por defectos en la síntesis, expresión de las integrinas 2 (LFA-1, Mac-1).
Tienen neutrofília, infecciones bacterianas recurrentes y defectos en la extravasación de leucocitos en
los sitios de infección. Dependiendo de la gravedad del defecto mueren jóvenes o pueden alcanzar la

32
INMUNOLOGÍA
edad adulta. Los que alcanzan la edad adulta lo hacen porque la interacción VLA-4-VCAM-1 compensa el
defecto en las integrinas β2.
2.3.2. LAD II.- Se caracteriza por alteraciones en el transporte de GDP-fucosa desde el citoplasma hasta
el lumen del aparato de Golgi, por lo tanto existe un defecto en la fucosilación de las lectinas, por lo
tanto existe un defecto en el rolling. Los pacientes tienen neutrofília, producción de pus alterado,
infecciones recurrentes, retraso mental, defectos en el crecimiento y deficiencia en el grupo sanguíneo
H.
2.3.3. LAD III.- Se caracteriza por defectos en las vías de señalización por lo tanto la activación de las
integrinas 2 (LFA-1, Mac-1) por las quimioquinas es defectuosa. Se caracteriza por una falla en el
arresto sobre las células endoteliales.
Las terapias pro y anti adhesión en el campo del trafico leucocitario es un campo en constante avance,
tanto en el tratamiento de inmunodeficiencias, infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer.
También, ha servido para el desarrollo de tratamientos para controlar las enfermedades antes
mencionadas. Ejemplo, el uso de anticuerpos monoclonales como Efalizumab (anti integrina CD11a) se
usa en pacientes con psoriasis, las inyecciones subcutáneas de este anticuerpo mejora la sobrevida de
los pacientes en más del 75%.El natalizumab (anti α4 integrina) se usa en el tratamiento de pacientes
con esclerosis múltiple reduciendo los daños en más de un 40%.
Medio de cultivo RPMI 1640 MEDIUM (SIGMA)
Medio de cultivo RPMI 1640 MEDIUM (SIGMA) al 2X
Ficoll-Urografina 1.090 (SIGMA-aldrich)
Buffer fosfato salino (PBS celular) pH 7.4 al 1X
Azul Tripán 0,4% (SIGMA)
Kit de tinción panóptica rápida (LABORCLIN)
Metanol p.a.
Agarosa (SIGMA)
Gelatina sin sabor
Lipopolisacarido (LPS 1 µg) (SIGMA)
Colchicina (COL 1 µg) (SIGMA)
Incubadora ajustada a 37°C
Centrifugadora
Microscopio óptico
Pipetas Pasteur de goma
Jeringas 10 ml con aguja N° 21, Jeringa de insulina con aguja desmontable
Equipo de venopunción
Micropipeta de 10 y 100 µl
Cubreobjetos y portaobjetos (4 unidades)
Gradillas para tubos de 15 y 50 ml.
Pinzas con extremos planos
Marcador para vidrio
Frascos tipo Gerber o cubetas para tinción de portaobjetos
Gotero con Aceite de Inmersión

33
INMUNOLOGÍA
4. PROCEDIMIENTO
4.1. Aislamiento de células polimorfonucleares por el método de Ficoll-Urografina
La función más relevante en los polimorfonucleares (neutrófilos), es sin duda el control y eliminación de
los microorganismos patógenos, que atentan contra nuestro organismo, ya que constituyen la primera
línea de defensa, después de que el agente agresor sobrepasa las barreras naturales constituidas por la
piel y las mucosas.
Obtener 10 ml de sangre periférica anticoagulada con heparina o ACD, colocar la interface plasma
paquete globular pre-diluido con dos volúmenes de PBS celular, mezclar bien y cargar sobre 3 ml del
Ficoll-Urografina (densidad 1.090), colocar toda la sangre diluida con mucho cuidado para evitar que
ambas soluciones se mezclen, centrifugar a 1550 rpm durante 20 min. Recuperar de 2,0 a 2,5 ml del
anillo de polimorfonucleares con ayuda de una pipeta Pasteur y lavar tres veces con PBS celular 1X por
centrifugación a 1100 rpm por 10 min cada vez. El pellet obtenido se resuspende con PBS estéril al 1X.
Hacer un ajuste celular a la concentración de 2,5x106
células/ml.
4.2. Quimiotaxis de polimorfonucleares
Preparar gel agarosa-gelatina, posteriormente vaciar el gel en placas de portaobjetos, una vez
gelificadas, fabricar los pozos alineados en tres filas, en los cuales se sembrarán 10µL de
polimorfonucleares a una concentración de 2,5x106
células/pozo, en los pozos centrales, posteriormente
sembrar 10µL de Lipopolisacarido como control positivo de quimiotaxis a una concentración de 1 µg/ml,
10µL de Colchicina como control negativo de quimiotaxis a una concentración de 1 µg/ml y 10 µL de
medio RPMI 1640 en los pozos periféricos (Figura N° 2), incubar a 37C, 5% de CO2 y 99% de humedad
relativa, por 2 horas. Pasado este tiempo fijar las células con metanol p.a. durante media hora, luego de
este periodo cambiar el metanol, por otro metanol fresco dejando en incubación durante 18 horas.
Cumplida la incubación, lavar los portaobjetos con solución salina fisiológica y realizar la tinción
panóptica (MG - G) de las placas, luego se observar en el microscopio óptico con aumento 10X y
determinar las distancias de migración de los polimorfonucleares.
Preparación de los geles gelatina-agarosa

34
INMUNOLOGÍA
10 µL Quimioatractante Agarosa-gelatina
10µL medio RPMI 1640 (Control) 2.5x106 PMNs/10µL
4.3. Adherencia de los monocitos y polimorfonucleares
La determinación del efecto del Lipopolisacarido sobre la capacidad de adherencia de monocitos y
polimorfonucleares será determinada mediante el método propuesto por Christou N. y cols., que se basa
en la capacidad de adherencia de células a la fibra de nylon.

35
INMUNOLOGÍA
Después del aislamiento de PMN colocarlos en tubos Eppendorf de 1,5 ml, usar como control positivo de
adherencia al Lipopolisacarido (1 µg/ml), como control negativo células sin tratar (solo expuestas al
medio RPMI 1640), dejar incubar en medio RPMI 1640 a37°C y 5 % de CO2 por 2 horas.
Para la realización de esta prueba se utiliza jeringas de tuberculina con aguja 25G colocada sobre un tubo
de ensayo de 10 cm de longitud y 2 cm de ancho. La jeringa debe ser previamente empaquetada con 5
mg de fibra de nailon pre-humedecida con 1 ml de medio RPMI 1640 (ver figura página anterior). El
sistema debe ser calentado a 37ºC en estufa por 30 min. Posteriormente, depositar 1 ml de células en
medio RPMI 1640, previamente y tratadas con y sin LPS, a la parte superior de la fibra de nailon, con una
jeringa de tuberculina aguja 16G, dejando atravesar el espesor de la fibra, a 37°C, las lecturas deben
realizarse mediante el conteo de células que pasaron a través de la fibra en cámara de Neubauer. Para
obtener el resultado del porcentaje de células adheridas deberá usarse la siguiente fórmula:
5. CUESTIONARIO:
1.- ¿Cuál es el mecanismo por el cual la Colchicina y el LPS inhibe o estimula la adherencia celular y la
quimiotaxis respectivamente?
2.- Indique si existe algún tipo de enfermedad en la cual la capacidad de adherencia celular se vea
afectada.
3.- Las integrinas y moléculas de adhesión son responsables de la adhesión celular a los tejidos o
endotelio vascular, de ejemplos de integrinas y moléculas de adhesión que participen en este proceso
4.- ¿Mencione tres quimioquinas que favorezcan la quimiotaxis de neutrófilos y tres quimioquinas que
favorezcan la quimiotaxis de monocitos?
5.- ¿Cuáles son los componentes del sistema del complemento que favorecen la quimiotaxis?, mencione
además sus receptores celulares.
6.- Se sabe que las plaquetas favorecen la adhesión de polimorfonucleares y monocitos. ¿Qué
componentes de las plaquetas son los que están relacionados con este aspecto?
7.- ¿En qué consiste el síndrome de agregación leucocitaria?
8.- ¿En qué consiste el síndrome de leucocitos perezosos?
9.- ¿En qué consiste el síndrome de Cartagener?
Células iniciales – Células efluidas X 100 %
Células iniciales

36
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 6
ÓRGANOS LINFOIDEOS
1. OBJETIVOS:
Identificar y establecer las características anatómicas histológicas y celulares de los órganos linfoideos
primarios y secundarios que forman parte del sistema inmune.
2. ANTECEDENTES
Las células madre se originan en el saco uterino del embrión en desarrollo, luego esta función la ejercen
el bazo e hígado fetal y al final de la gestación la médula ósea. Todas las expresiones de la respuesta
inmune dependen de la existencia y correcto funcionamiento del sistema inmunológico. Los órganos
linfoideos se dividen en:
a) Primarios o centrales: son el lugar donde se desarrollan y maduran las células del sistema
inmune que participan en la inmunidad innata y adaptativa, Ej., médula ósea y timo. En el timo
los timocitos alcanzan la maduración después de pasar por los procesos de selección positiva y
negativa. Las células estromales de médula ósea y las del epitelio tímico son las que favorecen
los procesos de desarrollo y maduración en médula y timo respectivamente.
b) Secundarios o periféricos: son el sitio anatómico donde se encuentran los linfocitos maduros
“vírgenes” y es el sitio en el que se filtran los antígenos que llegan a la circulación sanguínea, es
el lugar anatómico donde se las células presentadoras de antígenos realizan el procesamiento y
presentación de los antígenos. Son el lugar anatómico donde las células T Y B se diferencian
activan y diferencian en células de memoria y efectoras. En los órganos linfoideos secundarios
las APCs profesionales juegan un rol fundamental en el procesamiento y presentación de
antígenos.
2.1.Nódulos linfáticos
Las venas linfáticas son venas en las cuales se drenan los fluidos provenientes de los tejidos, estos fluidos
se conocen como linfa. Los nódulos linfáticos son los filtros del sistema de circulación linfático, filtran los
fluidos que pueden contener antígenos patogénicos provenientes de la linfa que llegan por los linfáticos
aferentes. Es importante filtrar los fluidos de la linfa puesto que este pasará luego a circulación
sanguínea a través del ducto torácico. Los nódulos pueden ser superficiales, están situados en el área
subcutánea cerca de las masas musculares y esqueléticas. Los nódulos profundos están situados dentro
de la cavidad torácica y abdominal o cercano a los órganos.
2.2.Bazo
Está constituido por la pulpa blanca y roja, en la pulpa roja se destruyen los glóbulos rojos viejos (pulpa
roja) y en la pulpa blanca se filtran y depuran los antígenos que llegan por circulación sanguínea.
2.3.Tejido linfoide asociado a las mucosas (MALT)
Incluye las placas de Peyer, los tejidos linfoides asociados al árbol bronquial (BALT), amígdalas,
adenoides y el tejido linfoide hepático. Es importante hacer notar que los linfocitos pueden pasar de la

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