Metodos de separacion -Introducción.pdf

METODOS DE SEPARACION
Nohora Angélica Vega Casto
Edgar Antonio Reyes Montaño
Objetivo: Entender cuales son los aspectos generales
del aislamiento y la purificación de macromoléculas
de origen biológico.
• Proteínas, Polisacaridos y ácidos nucleicos entre
otros.
• lípidos : por su solubilidad tienen diferentes propiedades
con respecto a las otras macromoléculas.
INTRODUCCIÓN

EXTRACCION
Propiedades de las macromoléculas
dependen del pH (Buffer):
• Estabilidad
• Función biológica
• Hacer 3 ó 4 veces sobre el mismo
material para obtener un buen
rendimiento.
INTRODUCCIÓN

PURIFICACIÓN
- Eliminan sustancias interferentes
- Procesos de precipitación (Concentración)
- Procesos de concentración: ultrafiltración
Cromatografia : Dilución de la muestra 1:10
- Lipidos
- Sales
- Metales
- Pigmentos vegetales
- Ácidos nucleicos, carbohidratos,
proteínas
INTRODUCCIÓN

CUANTIFICACION
- En cada etapa de purificación
- Evaluación del Rendimiento
- Selección del método
INTRODUCCIÓN

PROCESOS DE TRANSPORTE
INTRODUCCIÓN
- Sedimentación
- Difusión
- Electroforesis
Hacer la determinación de parámetros moleculares
( dimensiones, formas y peso molecular) a partir de
parámetros experimentales.

Gradiente de potencial ( transporte de masa)
Químico: desplazamiento de solutos en un sistema
Difusión esta descrito por la Ley de Fick, (Coeficiente de
difusión, D). Método de diálisis.
Eléctrico: movimiento de moléculas cargadas en un
campo eléctrico. (Coeficiente fricción, ). Método
Electroforesis
Gravitacional: sedimentación por movimiento de
moléculas en un campo gravitacional . (Coeficiente de
sedimentacíon, S). Método centrifugación,
ultracentrifugación

DESCRIPCION DE LOS
Mecanicista:
- Moléculas están sujetas a fuerzas externas que actúan
sobre ellas, no se describe momento a momento la
situación de la molécula de soluto.
Termodinámica de los Procesos Irreversibles:
- Cercanos al equilibrio
- describe momento a momento la situación de la
molécula de soluto

Concepción mecánica
Fi
F= -fv
Tiempo después de aplicar la fuerza
Velocidad
de
la
partícula
0
fivi: fuerza de rozamiento
Coeficiente de fricción, depende de tamaño y forma de la molécula
fivi + Fi = 0
Campo eléctrico
Fuerza centrifuga
Molécula de soluto
Acelerada en
la dirección del campo
Por un corto periodo de tiempo
Fuerza opuesta
Resistencia por fricción
Velocidad
Fuerza total =0
Velocidad constante

fi: depende del tamaño y de la forma de la molécula
Esfera con radio Ri, el coeficiente se puede determinar mediante
La ley de Stokes :
fi: 6Ri : Depende de las dimensiones
moleculares !!
 = viscosidad del medio
Desventajas :
• No siempre se conoce cual es la fuerza aplicada a una molécula por
un campo externo conocido.
• Ecuación de Stokes se ha deducido solo para el caso de movimiento de
partículas a través de medios continuos.
• No se tienen en cuenta los choques y caminos no rectilíneos de
las moléculas

Ecuaciones análogas para partículas de otras formas

Difusión, sedimentación y electroforesis
 Gradientes de potencial
 Fuerzas externas que actúan sobre el sistema.
 Estado final depende de T, P, composición,
 Durante los procesos se produce un flujo (Ji) de materia
para llegar al equilibrio.
Ji: Número de unidades de masa ( g,
moles) de i que atraviesan 1 cm2 en 1
segundo
Ji = Vi.Ci
Vi= Velocidad de transporte

X=vt distancia de movimiento de una molécula
Teniendo en cuenta todas las moléculas de soluto :
w : C*sx
w = C*svt
J= w/st
S: superficie perpendicular al movimiento de las moléculas
de soluto en una región en que la concentración es Ci,
Vi : velocidad de las moléculas de soluto
w =Cambio neto de masa del soluto en la unidad de volumen
Generalidades
Ji = Vi.Ci

Proceso Potencial Flujo Estados de
Equilibrio
Conducción eléctrica Electrostático Electrones Potencial
electrostático
uniforme
Conducción de calor Temperatura Calor Temperatura
uniforme
Difusión Potencial Químico Moléculas Potencial
químico
uniforme
Sedimentación Potencial
Total=Potencial
Químico+ Energía
potencial
gravitacional
Moléculas Potencial total
uniforme
El flujo en cualquier punto del sistema y en cualquier instante es proporcional al gradiente del
potencial apropiado .
Fuerza es siempre la negativa del gradiente del potencial de energía

TEORIA DE LOS PROCESOS IRREVERSIBLES
 Sistemas no están en equilibrio pero tienden
hacia el, “ cercanos al equilibrio”
 Flujo en cualquier parte del sistema, en cualquier
instante es proporcional al gradiente de potencial
J = -Li ( Ui/x) cambio en una sola dirección
Li: coeficiente de transporte simple
Extensión en la tres dimensiones se denota en forma vectorial
Tanto para el gradiente como el flujo

La fuerza / molécula :
Fi = (-1/ N). ( Ui/x) N: Número de Avogadro
Ji = -Li ( Ui/x)
Ji = Vi.Ci
 Ui/x = Fi/N
Vi.Ci = -Li ( Ui/x)
Vi.Ci = Li.Fi.N
Vi = LiNFi/Ci
Li = Ci/N, N : coeficiente friccional por molécula
La conductividad de la masa (Li) es proporcional la concentración de la
sustancia trasportada e inversamente proporcional a la resistencia que
ofrece el medio al transporte
Concepciones
Mecánica Termodinámica
del proceso de transporte

En términos generales :
- Las dos concepciones parten de diferentes puntos de vista
así el coeficiente friccional i no es exactamente igual
- El experimentador no mide directamente flujo, lo más común
son los cambios en concentración
- Ley de conservación de la masa

Relación flujo -variación de la concentración en este elemento de volumen en
función del tiempo ?
Sección uniforme A, se produce
un flujo de soluto
Ji: diferente en puntos distintos
Incrementos
infinitesimales
Ecuación diferencial
La concentración aumentará
en una región si la velocidad
de entrada de materia es
mayor que la de salida
Cambio de masa soluto wi
At
At
Volumen
elemento
t
t
t

PROCESO DE TRANSPORTE - DIFUSIÓN
Concepción Mecanica
 Frente definido
 Concentración de soluto cambia de 0 a Co
 Por el movimiento browniano se produce la desaparición de la
frontera neta dando una mezcla completa
Termodinamicamente
 El estado inicial que no esta en equilibrio
 Energía libre y la entropía es alta
 Estado Final cuando se llega a una mezcla uniforme-Equilibrio
 Energía libre disminuye, Entropía tiende a cero,
 Potencial químico es constante en todo el sistema
disolución
disolvente
inicio Tiempo
infinito

Cambio de potencial químico en el limite, es la
Fuerza que causa el flujo hasta alcanzar el equilibrio.
L2 : coeficiente de transporte simple
2: soluto
El potencial químico depende de la
Temperatura, la presión y la concentración.
y2: coeficiente de actividad
N: número de Avogadro
2: Coeficiente de fricción
N2: coeficiente de fricción por mol
Introducción del coeficiente de fricción !!!!!
Interacciones soluto-soluto

D : Coeficiente de difusión
Primera Ley de Fick
-Medida de la energía cinética de las moléculas
-Término de corrección, potencial químico depende
de las interacciones soluto-soluto y del tamaño y forma de
las moléculas que también influyen en el coeficiente de
Fricción.
- Descripción para soluciones ideales, se desprecia el término
con el coeficiente de actividad
-D no se mide experimentalmente,
Se determina la variación de la concentración
con el tiempo en distintos puntos del frente
D: no cambia con la concentración
Segunda ley de Fick

• Ensanchamiento de la superficie estrecha inicial de un frente durante
una difusión libre.
Para Difusión libre la solución de la ecuación es:
Y : variable de integración simple
El gradiente puede medirse usando sistemas ópticos e interforemétricos
D

Gradiente de concentración
Primera derivada es análoga a
una Curva Gausssina de error
Altura de la campana H
Incremento de concentración para una partícula dx
Sumando todos los incrementos se obtiene la
diferencia total de concentración a través del frente

• Celda con un frente sintético
•Solvente (diálisis de equilibrio con la solución) es colocado sobre la solución
mientras el rotor alcanza 4000-6000 rpm.
Se evalúa el contenido de la celda a diferentes tiempos
•Medir la concentración, Cp, a diferentes tiempos
•Medir el gradiente de concentración en el frente (dc/dr)b
• Se determina la pendiente de [Cp/dc/dr)2] vs t(sg)
•La pendiente x (4π) es el coeficiente de difusión, D.
ULTRACENTRIFUGACION ANALITICA
EXPERIMENTALMENTE COEFICIENTE DE DIFUSION, D

• Ecuaciones que han sido deducidas para sistemas de solo dos
Componentes (Soluto disolvente )
• El flujo en estos sistemas viene definido por un coeficiente de
transporte simple (L)
• Con mas de dos componentes hay interacción de flujos
• Un sistema de tres componentes necesita cuatro coeficientes de
Difusión
Se esperaría:
• D22 y D33 coeficientes próximos si fueran solutos individuales
• D23 y D32 Coeficientes muy pequeños
Depende de las concentraciones de cada uno de los componentes

SEDIMENTACION
• Es una de los procesos empleados para caracterizar macromoléculas; utilizando
variantes adecuadas de esta técnica se puede obtener:
•Peso molecular (M)
•Densidad
•Forma general
• Cambios en los parámetros
•Cualquiera de los parámetros se pueden aprovechar como base para la
separación de los componentes de una mezcla con propósitos analíticos
o preparativos.

Técnica versátil y rigurosa que permite determinar el peso molecular (M) y las
propiedades hidrodinámicas y termodinámicas de las proteínas y otras
Macromoléculas:
•Precisión
•Exactitud
•Ninguna otra técnica es capaz de suministrar el mismo rango de
información con el mismo nivel de precisión y exactitud
•Método de análisis de sedimentación tiene bases termodinámicas
firmes.
• Todos los términos que describen el fenómeno de sedimentación
se determinan experimentalmente.

Existen tres clases de experimentos donde se
generan gradientes de densidad continuos o
discontinuos en un tubo:
•Velocidad de sedimentación
Constante de Svedgerg (S)
• Ribosomas 30S, 50S : 70S Procariotes
40S,60S : 80S Eucariotes
•Equilibrio de sedimentación
•Gradiente de densidad

SEDIMENTACION
La velocidad de sedimentación depende del peso molecular y el fenómeno se puede
analizar :
Fc (Fs): fuerza gravitacional aplicada a la partícula
(originada por el giro de una disolución)
Fb: Fuerza de flotación, actúa sobre el fluido desplazado
por la partícula
Fd (Ff): Fuerza friccional, si la partícula se desplaza con
una velocidad, m, depende de la forma y el tamaño
m= Masa de la partícula
m: Velocidad de la partícula
mo= masa de fluido desplazada por la partícula
r: distancia radial de la partícula al eje de rotación.
ṽ: Volumen parcial especifico (ml que cada gr soluto
ocupa en solución)
ρ= densidad del solvente g/ml
ρpartícula>ρ solvente
sedimentación
MECANICISTA
w
r=0
b
a
Boundary
Frente de soluto
Limite Fondo
Fuerzas que actúan sobre una partícula en un
campo gravitacional

Como no hay aceleración (la Velocidad es constante) : la fuerza total es igual a cero
en muy corto tiempo ( menos 10-6 sg)
Ecuación de Svedberg
Parámetros
moleculares
Parámetros
experimentales
6
m Masa molar
: Volumen especifico
parcial
 : densidad de la soluciòn
m : velocidad partícula
S: Coeficiente de sedimentación
1S=10-13 sg
BSA 4.5 S
• Sedimentación depende del peso molar efectivo,
Corregido por el factor de flotación

• Alta velocidad angular produce sedimentación del soluto hacia el
bottom (pellet)
• Menisco desprovisto de soluto
•La formación de un frente ( uniforme, simétrico, alargado) entre las
dos regiones
•La velocidad individual de las partículas no es resuelta, pero la
velocidad del Frente se puede medir, para determinar el coeficiente de
sedimentación, S.
•Depende de la masa de las partículas y es inversamente del
coeficiente friccional (medida efectiva del tamaño)
ro rbnd rb
c/r
r

• Inicialmente están distribuidas uniformente
•Cuando se aplica el campo se agitan
•Región próxima al menisco se libera totalmente
de soluto: FRENTE MOVIL (LIMITE)
•A PARTIR DE ELLO SE PUEDE
CALCULAR S en una posición limite
en el tiempo (t)
m
Pendiente
• La velocidad de sedimentación se incrementa con r y la velocidad
del frente se incrementa con el movimiento hacia el bottom
•La velocidad puede ser expresada como una diferencial

rm: posición radial del menisco
rbnd : posición radial del frente en el punto medio
ro rbnd rb
m= W2S

Para tener en cuenta las diferencias en densidad y viscosidad entre los diferentes solventes, es
conveniente calcular S y D, en términos de un solvente estándar, usualmente AGUA
• Las medidas se realizan en buffer a una temperatura dada y se expresan como si fueran en
agua a 20 oC:
Conociendo So y Do se hace la relación S/D y se determina M
ESTA ES UNA DE LAS FORMAS MAS COMUNES DE DETERMINAR
Peso Molecular DE LAS MACROMOLECULAS
S
del solvente
estándar
S, determinada
a T (0C )Exp
ɳ: agua a 20,
Solvente T(0C)
ρ: agua a 20,
Solvente T(0C)

• La muestra es homogénea ó heterogénea?
• Cual es el peso molecular del soluto, hay un único componente?
• Hay más de un tipo molecular ? se puede obtener la distribución molecular?
• Se puede estimar el tamaño y la forma?
• Se pueden detectar cambios de conformación?
• Se pueden diferenciar los componentes moleculares por densidad?
• Se pueden detectar interacciones moleculares ?
1. Agregación?
2. Cual es el tipo de reacción?
3. Cual es la estequiometría?
4. Se puede medir la Fuerza de interacción, constantes de
afinidad?
SEDIMENTACION

METODOS DE DETECCION
•Estudio cuantitativo de los procesos de transporte, cambios en la
forma y/o posición de un frente sin perturbar el sistema.
•La medida de la distribución de concentración en las diferentes
posiciones en función de el tiempo.
Métodos ópticos (Absorbancia)
• Medidas de absorbancia a diferentes l en diferentes posiciones de la
celda.
• Para solutos que siguen la ley de Beer-Lambert , la absorbancia es
proporcional a la concentración.
• Más sensibles mg/ml
Métodos Refractométricos
Diferencia del índice de refracción de la muestra con respecto al
Solvente Puro .

- Se determina la cantidad de Luz que absorbe
una sustancia
- Radiación UV (190 nm-400 nm)
- Luz monocromática permite medir la concentración de
dos o mas solutos independientemente variando la
longitud de onda (l)
Abs
r
Densitometría
radiografía
a
b
FUENTE
ABSORBANCIA

Para estudiar Velocidad de sedimentación
Luz paralela que pasa a través de medio (m) que varia en el índice
de refracción, es retarda en la zona de mayor
Gradiente dɳ/dx; distorsión del frente de onda
emergente.
Hay deflexión = a (dɳ/dx)
(dɳ/dx) : gradiente del índice de refracción
a: espesor de la celda
SISTEMAS DE DETECCIÓN-INDICE DE REFRACCION


•Los primeros rayos interceptados serán los más deflectados (desviados radialmente) , es decir los que
pasan por un gradiente de mayor concentración.
•La desviación radial de la luz se convierte en un desplazamiento vertical de la imagen en la cámara,
proporcional al gradiente de concentración.
•La luz que No es desviada cuando pasa a través del solvente puro o de una región de concentración
uniforme.
•Localiza el limite (frente) pero es muy difícil estudiar la forma.
•Se obtiene el índice de refracción en función de x ƒ(X)=ɳ
SISTEMA SCHLIEREN

SISTEMA INTERFERENCIA RAYLEIGH
•La velocidad de la luz que pasa por una zona de alto índice de
refracción disminuye.
•Cuando el índice de refracción de la muestra es mayor que el índice
de la referencia, la onda que emerge de la muestra se retarda con
respecto a la onda de la referencia; dando como resultado un patrón
de huellas verticales (desplazamiento).
•Luz monocromática pasa a través de dos ranuras paralelas , las cuales
están debajo de cada sector donde están la muestra y el solvente
(referencia); la luz que emerge de las ranuras padece interferencia
dando como resultado un patrón de bandas oscuras y claras “huellas”
•0.1-5 g/L

ELECTROFORESIS
Una molécula puede responder de dos formas a la acción de un campo eléctrico:
•Si tiene carga neta: migrará en un campo eléctrico
•Si la distribución de carga es asimétrica (polarizada): se orientará en el campo
Para analizar el comportamiento de una macromolécula en un campo eléctrico ,
(E) se puede hacer un tratamiento termodinámico para procesos
Irreversibles, pero se presentan complicaciones debido a la presencia de
iones (sales y buffers) que influencian el campo eléctrico local e
interaccionan con la Macromolécula.

Un tratamiento de la mecánica clásica da una mejor idea de lo que sucede
y presenta muchas analogías con el realizado para la ultracentrifugación
(U.C). “aplicación de una fuerza externa” y el movimiento de La
molécula, “flujo de materia ( carga) – potencial electrico ”.
Un tratamiento Termodinámico para procesos irreversibles involucra
las características intrínsecas de la molécula en un gradiente de potencial
eléctrico.
ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS
Molécula en una solución No
conductora “caso irreal” no hay
migración.
Fc= ZeE : fuerza ejercida por el
potencial eléctrico
F =-ƒv : Fuerza friccional
“gradiente de potencial”
ZeE
-ƒv
-ƒv
ZeE
-ƒv
-ƒv
E: potencial eléctrico
Campo en unidades electrostáticas
de potencial/cm
Z: unidades eléctricas
de carga

FC+F=0
ZeE -ƒv = 0
ZeE = ƒv
V/E =Ze/ ƒ=m : Movilidad
electroforetica
m = Ze/6πr Partícula esférica
ELECTROFORESIS
1voltio= 1/300 ues
ues: Unidad electrostática
de carga
e: 4.8x10-10 ues
1 coul=3x109 ues
E: potencial eléctrico
Campo en unidades electrostáticas
de potencial/cm
Z: unidades eléctricas
de carga
Aparece momentáneamente una aceleración y por fuerza friccional
se alcanza una velocidad constante, por lo tanto :

TECNICAS DE PURIFICACION
GF Hidrofóbica Intercambio Afinidad Fase reversa

Cromatografía
 Reparto de solutos entre:
 Fase móvil
 Fase estacionaria
 Cromatografía de Intercambio Iónico
 Gradientes de Fuerza Iónica
 pH, polaridad
 Filtración en gel
 Peso molecular, coeficiente de fricción y difusión
 Separa desde iones hasta ácido nucleicos (soporte)

 Cromatografía de Afinidad:
 Interacciones reversibles
 Diferentes sistemas
biológicos
 HPLC-RP
 CL
Cromatografía
Interacción
especifica
Proteínas que
no interactúan
Elución de proteínas
Que interactúan

ESPECTROMERIA DE MASAS
FUE una herramienta analítica para el estudio de moléculas pequeñas;
hoy es una técnica indispensable para el estudio de biomoléculas.
• Desarrollo de nuevos métodos de ionización “suave” en conjunto
con avances en instrumentación, tecnología computarizada y algoritmos
para procesar datos :
•Determinación PM biomoléculas
•Secuenciación de péptidos, proteínas y oligosacáridos.
• Determinar modificaciones postraduccionales
• Sitios de glicosilación en glicoproteínas
•Estudios de plegamiento en proteínas (Denaturación)
• Interacciones intra e intermoleculares – Formación de complejos
118

Con respecto a otras técnicas espectroscópicas:
• No requiere analitos que posean características
físicas especiales: carga, momento magnético o
eléctrico, radioactividad etc
• Sus tiempos de análisis son cortos!!!!!!!
• Es de gran Utilidad en Proteomica (2D-PAGE )
•Separación por carga y Punto isoeléctrico
119
ESPECTROMERIA DE MASAS

METODOS DE SEPARACION
Consideraciones generales

ESQUEMA GENERAL
Purificación de macromolécula
Material de partida
Extracción
Purificación
Identificación, caracterización-estudios de
secuenciación y de estructura secundaria y
terciaria
Estudios de función biológica y de los
mecanismos moleculares

 Cual es el propósito de purificar ? Para que ha sido diseñado el
proyecto?
 Aislar una nueva proteína o una ya estudiada ?
 Se conocen sus características moleculares ?
 Crear o ajustar procesos ?
 Sistema de detección permanente :
 Ensayos de actividad biológica
 Asegurar una fuente de obtención continua
 Material Vegetal
 Material Animal
EXTRACCION

Cantidad de material que se necesita para cumplir con el
objetivo del proyecto:
Extracción a partir de un gel : Cantidades muy pequeñas para estudios
de identificación y secuenciación de una proteína
Métodos cromatográficos: Cantidades mayores para hacer estudios
estructurales ( primaria, secundaria y terciaria proteína).
Métodos de Cuantificación : diferentes sensibilidades
 Colorimétricos
 Coeficiente de Extinción
ADN: A260/A280
 Cuantificación de proteínas basada en marcaje y compatibles con la técnica
espectrometría de masas **
EXTRACCION

Purificación
Proteína1,2
Total
(mg)
Actividad
Total 3
(Unidades)
Actividad
especifica
Unidades/mg
Grado de
purificación
Extracto crudo
Lisado
1000 110 0.11 1
Precipitación
Sulfato de
Amonio
45-55%
180 75 0.42 3,8
DEAE Sephacel
Fracción I -pool
24 60 2.5 22,7
Sephacryl
Fracción I-pool
3.6 46 12.5 113
1.De 10g de pellet de E.Coli ( 4 litros de cultivo)
2.Bradford- Patron BSA
3. Descrito en sección de métodos

Bioinformática en la planeación
de la purificación
 Secuencia:
 Determinar el peso molecular
 pI, carga proteína a diferentes pH
 Coeficiente de extinción molar (contenido de aromáticos)
 Contenido de cisteína
 Aproximación a la estructura secundaria y terciaria
 Estabilidad
 Proteínas de membrana (Hidrofobicidad )y segmentos transmembranales
 Modificaciones postraduccionales
 Solubilidad y posible sobreexpresión en E. Coli

Bioinformática: Qué información no
nos puede aún aportar?
 Forma, densidad, rasgos estructurales
 Estructura cuaternaria:
 Estequiometria, homo o heteromultímeros
 Propiedades de precipitación

“
”
BUFFERS
IMPORTANCIA DE LOS BUFFERS FISIOLOGICOS

BUFFERS
Objetivo :
Mantener estable el pH durante estudios de purificación y actividad
Biológica de las proteínas
• El desarrollo de sustancias N-sustituidas de Taurina y glicina han suministrado
Buffers en un rango (6.1-10.4) (Good et al., 1966)
• Se emplean en un rango cercano al pH fisiológico
• (50 mM) No tóxicos células

ECUACION
Hederson -Hasselbalch
3-11
<3 >11

Capacidad buffer
A mayor concentración mayor capacidad buffer
Si pH = pKa (máximo), entonces:
Hepes
pKa
Calidad depende de su capacidad buffer ( adición de ácidos o bases) y su
habilidad para mantener estable pH sobre dilución y adición de Sales neutras

Selección BUFFERS
Actividad
Se debe considerar el pH óptimo, en el caso de las Enzimas. Evaluar buffers
relacionados que cubran un amplio rango de pH.
Interferencias inespecíficas: componentes del buffer que interaccionan con
el substrato o metales. Ensayar diferentes buffers dentro del mismo rango pH
para evaluar los efectos del buffer.
• pH cercano al pKa
Ejemplos:
- Fosfato: inhibe carboxipeptidasa, ureasas, kinasas, deshidrogenasas
Borato: forman complejos covalentes con carbohidratos
- Tris y aminas primarias forman bases de Schiff con aldehídos y cetonas.
- Complejos con metales (Fosfatos de calcio), difícil remoción y que son
esenciales en la actividad enzimática ( Mg++, Ca++, para kinasas)

Selección BUFFERS
Concentración : Altas fuerzas iónicas pueden disminuir la actividad de las
enzimas. Tan baja como sea posible ( evaluar la estabilidad y actividad):
• 10 mM-50 mM*
• Adición de la proteína no debe variar el pH ± 0.05, si cambia se
debe aumentar la concentración.
• Stock
• pH debe ser evaluado cuando se diluye o se adicionan sales
u otros componentes.
• Temperatura
Aminas primarias pKa muy sensible (Tris pKa=8,06 a 0ºC; pka =
8,85 a 25ºC).Carboxílicos poco sensibles
• Costo : Tris y buffers inorgánicos son baratos y ampliamente
usados.
• Tris baja capacidad buffer <7,5, dependiente de la
temperatura.
• Interfieren con Ensayo de Bradford ( Cuantificación)
• Absorben en la región UV

BUFFERS
Buffer volátiles se remueven rápidamente para que no interfieran en
los siguientes pasos de purificación o caracterización:
• Electroforesis, Cromatografía de intercambio iónico, digestión de
Proteínas para análisis de aminoácidos o péptidos
• No absorben UV (-piridina)
• Interfieren con ninhidrina (>0,1M): grupos a-amino

BUFFERS BIOLOGICOS
Good et al., 1966
Ventajas
- Pkas en un amplio rango de pH 6.15 -8.35, cercano al pH fisiológico
- Sustancias estructuralmente relacionadas y tienen un amplio rango de pKas
- Son solubles en agua en altas concentraciones y poco solubles en solventes
apolares
- No se presentan reacciones laterales con otros componentes de la solución
buffer
- El pH del buffer no es influenciado por temperatura o composición iónica
- No forman Complejos con iones divalentes- (caso del buffer fosfato)
- Fácil obtención ( síntesis)
- Son sustancias estables
- No absorben la Luz UV

MES (ÁCIDO 2-(N-MORFOLINO)-
ETANOSULFÒNICO)
ADA (ÁCIDO N-(2-ACETAMIDO)-IMINO-
DIACÉTICO)
PIPES (PIPERAZINA-N-N`-BIS-
(ÁCIDO-2-ETANOSULFÓNICO))
COLAMINA
BES (ÁCIDO-N,N-BIS-(2-HIDROXIETIL-
2-AMINOETANOSULFÓNICO)
TES (ÁCIDO-N-TRIS-(HIDROXIMETIL)-
METIL -2-AMINOETANOSULFÓNICO)
HEPES (ÁCIDO-N-2-HIDROXIETILPIPERAZINA
-N`2-ETANOSULFÓNICO) TRICINA
BICINA
ACETAMIDOGLICINA GLICINAMIDA
ACES (ÁCIDO-N(2-ACETAMIDO-ETANOSULFÓNICO)

Criterios para sintetizar nuevas
sustancias para buffer
• - pKa en un rango 6 -8
• -Máxima solubilidad en agua y mínima en otros solventes
• -Importante la relación solubilidad H2O /solv apolares porque determina la
distribución en medio acuoso y la fase biológica en sistemas particulados
(organelos)
• No difusible en membranas biológicas
• No debe producir efectos salinos considerables
• No forman complejos con cationes
• Son sustancias estables y No absorben la Luz UV-ViS
• Facilidad de preparación y purificación

Inhibidores de proteasas
Proteólisis : inhibir la degradación de proteínas

Viscosidad y Pigmentación en extractos derivados de material
vegetal
- Tiourea 5 mM en los buffers (Van Driessche et al,1983)
- PBS-DDCA(ditiocarbamato dietil de sodio) ( 0.5% ) en atmósfera de
nitrógeno
- Ácido ascórbico 0.1M
- Metabisulfito de sodio 0.1 M
Posterior a la extracción para disminuir la oxidación:
- DEAD celulosa en batch
- PVPP (polivinilpirrolidona) 1% insoluble
- Carbón activado
Reducir la viscosidad:
- Pectinex : mezcla de poligalacturonasas ocasiona una reducción
importante de su viscosidad, hidroliza los ácidos poligalacturonicos
Deutscher, 1990
Inhibidores de polifenoloxidasas

Preparación del extracto
Ruptura celular
Dependiendo de la fuente se selecciona el método:
• Tejido animal o vegetal
• Homogenización
• Maceración
• Otros
• Fijar las condiciones de T (0C), proporción de
buffer/material.
• Fraccionamiento celular
• Extracto soluble con actividad
• Métodos analíticos y preparativos : purificación
previos.

CUANTIFICACION
Selección :
1. Volumen de muestra o cantidad de material disponible
2. Recuperación de la muestra : si la muestra es limitada no es adecuado un
método destructivo
3. Rendimiento : numero de muestras analizadas (micrométodos)
4. Robustez del método : que sea repetible.
5. Modificaciones postraduccionales pueden interferir en el método:
• Glicosilación
6. Agregación de proteínas: proteínas de membrana o las que se agregan
Pueden alterar la respuesta del método.
• Detergentes que no interfieran con el método seleccionado

CUANTIFICACION
1. Absorción de Luz ultravioleta
220 nm, 230 nm : Detección del enlace peptídico (estructura de
resonancia)
260 nm : Absorción de las purinas y pirimidinas (estructuras resonantes )
Detección de ácidos nucleicos.
Relación de absorbancias:
c (mg/ml)= (183*A230)-(75.8*A260) ( Kalb, Bernlohr, 1977)
c (mg/ml)= (1.55* A280nm)-(0.76* A260 nm) (Groves et al., 1968),
Absorbancia de los aminoácidos aromáticos.
Desventaja : solo para proteínas puras que no presenten ninguna
pigmentación
Para ácidos nucleicos se evalúa la relación (260/280)

ESPECTRO DE
ABSORCION
Io= Luz incidente (Absorbe)
I= Luz transmitida (No absorbe)
 = Coeficiente molar de extinción (L/mol.cm)
L= longitud de la celda
C= concentración sustancia (mol/L)
Absorbancia (A)= Log I/Io = 0-3.5 (Detector)
Ley Beer Lambert

COEFICIENTE DE EXTINCION MOLAR
- Absorbancia a 280 nm de una muestra que tiene una concentración
de 10 mg/ml para proteínas puras.
Cuantificación por MicroKjeldahl.
• Una solución de BSA de 10 mg/ml absorbe a 280 nm 6.6
• Una solución de Inmunoglobulinas G absorbe a 280 nm 13.6
• Coeficiente de extinción molar “ Handbook of Biochemistry and
molecular biology”
Determinación experimental vs Teórica ( composición o secuencia de
aminoácidos), empleando una formula estándar (Pace et al., 1995)
Ventaja:
• Se puede recuperar la muestra
Desventajas:
• No debe haber ninguna interferencia que absorba a 280 nm
• El % de aminoácidos aromáticos en algunas proteínas es bajo
así que la determinación presenta desviaciones.
1% = Una solución de proteína 1%

CUANTIFICACION
- 2. microKjeldahl : Determinación total de nitrógeno (Steyermark, 1961)
- Desventaja : una mayor cantidad de proteína (1 mg)

PATRON
• Ideal : la misma proteína
• Comercialmente disponibles : BSA (albumina bovina de suero), g-globulinas,
inmunoglobulinas (cuantificar anticuerpos).
• Malos resultados, especialmente con métodos que son sensibles
a la secuencia de proteína ( señal generada por aminoácidos
específicos)
CUANTIFICACION –Formación de complejos
Absorción de la Luz visible
Formación de complejos con las proteínas
- Se presentan Interferencias
- Son más sensibles

CUANTIFICACION
Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.
Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins.
Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957.

Método de Lowry
Reducción con el reactivo de Folin-Cicalteu (Fosfomolibdato y fosfotungsteno)
Importante la tirosina, triptófano y en menor extensión cisteína, cistina e histidina.
Modificado para reducir su sensibilidad hacia interferentes e incrementar la
Estabilidad del complejo coloreado. (50-500 mg/ml ).
Formación de precipitados con detergentes, lípidos, iones potasio y fosfato
Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A.L. Farr and R. J. Randall, 1951. Protein measurement with the Folin-Phenol reagents. J. Biol. Chem. 193: 265-275.
l=750 nm Azul

BRADFORD “A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding”. Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976).
Coomassie G a pH acido interactúa con Arginina, histidina, fenilalanina, triptófano y
tirosina. También se presentan interacciones hidrofobicas. Sensible a interferentes
como detergentes y proteínas glicosiladas. Respuesta es variable con las diferentes
Preparaciones del rectivo.

ACIDO BICINCONINICO
P. K. Smith, R. I. Krohn, G. T. Hermanson, A. K. Mallia, F. H. Gartner, M. D. Provenzano, E. K.
Fujimoto, N. M. Goeke, B. J. Olson and D. C. Klenk. Measurement of protein using
bicinchoninic acid . Analytical Biochemistry. Volume 150, Issue 1, October 1985, Pages 76-85
Los residuos que participan en la reducción son los residuos de Cisteína, cistina,
triptófano, tirosina y los enlaces peptídicos.
• La reacción es dependiente de la temperatura mostrando una mayor
reactividad a temperaturas altas.
• Los principales Interferentes son sustancias reductoras.
l= 596 nm purpura
0.2-50 mg

Proteína Abs 230/260 BCA * MicroKjeldahl
A.Salvia rubescens
Zona 4
0,136 0,626 0,594
B. Salvia rubescens
Zona 1
0,760 0,729 0,734
C. Salvia rubescens
Zona 2
0,603 0,477 0,458
• Método del ácido bicinconinico*
• Presencia de pigmentos
• Mejor correlación entre BCA y MicroKjeldahl
CUANTIFICACION
Aldana, 2000

- Formación de derivados fluorescentes por derivatización de los grupos
amino en las proteínas ( lisina y N-terminal). Generan una respuesta
lineal con el incremento de la concentración.
- No son métodos muy reproducibles
- Son mas sensibles
- Reproducibilidad es dependiente del pH
- O-phthalaldehido (OPA), más soluble y estable en buffers
- Fluroescamina
- 3-(4-carboxybenzoil)quinolina-2-carboxyaldehido( CBQCA)
- Quant-It, Nano Orange : une proteínas-Detergente.
Cuantificación en geles o en solución.
CUANTIFICACION
Interferencia con glicina y buffer con grupos
Amino como iones amonio
b-mercaptoetanol

CUANTIFICACION
Sustancias reductores

METODO SENSIBILIDAD
(mg)
Absorbancia
280 nm
20-3000
Lowry 2-100
BCA 0.2-50
Bradford 0.2-50
Fluorescencia picogramos
CUANTIFICACION

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