Jornadas Biocontrol - Elena López
•Descargar como PPT, PDF•
1 recomendación•398 vistas
Estudio de las interacciones de Escherichia coli con sus fagos en estirpes autóctonas. Elena López Acedo. Área de Genética. UEx
Recomendados
Recomendados
Más contenido relacionado
Más de INTAEX - Instituto Tecnológico Agroalimentario de Extremadura
Más de INTAEX - Instituto Tecnológico Agroalimentario de Extremadura (12)
Último
Último (15)
Jornadas Biocontrol - Elena López
- 1. Uso de Bacteriófagos como Antimicrobianos en la Producción Quesera Elena López Acedo Cáceres 7 de Septiembre 2012
- 2. BACTERIAS: E. coli FAGOS: LABORATORIO: AISLADAS DE LABORATORIO: AISLADAS DE PRODUCTOS LÁCTEOS: PRODUCTOS LÁCTEOS: •K12 •8 estirpes. NATIONAL •B •>40 estirpes BIORESOURCE •>40 estirpes •W PROJET: E. coli, JAPAN obtenidas en •C (serie RT) nuestro laboratorio. •B/r INTAEX •6 estirpes. Laboratorio de COLECCIÓN MIGUEL VICENTE ESPAÑOLA DE •Nuestra propia CULTIVOS TIPO colección. UEX. GENÉTICA Nuestra propia colección. UEX. GENÉTICA Mutantes claros y virulentos de fagos atemperados.
- 3. CICLO DE UN FAGO ATEMPERAD O
- 5. ADSORCIÓN INYECCIÓN DEL DNA λ+ λvir λcI857 λc60 λi434cIh P1 T4D T6 Phi80 Phi80cI Phi80cIΔ4 MG1655 + + + + + + + + + + + K12 (W3110) + + + + + - - - + - - B - - + - - + + + - + + B/r - - + - - + + - - + + Bi - - - - - - - - - - - C + + + + + + - + + + + W - - - - - - - - - - - WP2 - - + - - + + + - + + Serie RT - - - - - - - - - - - + simboliza la existencia de lisis
- 6. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) ∗Efecto dilución (sustancia difusible) ∗Correlación con factores del ciclo DESTINO DEL DNA-fágico: ∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952) ∗Fagos con DNA modificado
- 7. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) ∗Efecto dilución (sustancia difusible) ∗Correlación con factores del ciclo DESTINO DEL DNA-fágico: mal+ ∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952) ∗Fagos con DNA modificado EMB-mal: Eosin Methylene Blue + maltosa (como fuente de C). CONTROLES: MG1655 – ROJA (control +) mal+ BW6164 – BLANCA (control -) mal-
- 8. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) T0 T5 T10 T15 T20 T30 Time (min)
- 9. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares mu estr a coli a E. ) ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) Cep lácte a (R T ∗Efecto dilución (sustancia difusible) O FAG RT + Mg+ ante Ca+ + enad Sobr diluido no 16 55 + MG ND Mg+ Ca+ + - - 6 5 T te R en adan - 50% Sobr - 6 - 5 - 6 Mg++ Ca ++ 5 - 10% - 6 - 5 - 6 + Mg+ + 5 Ca+ - 1% - 6 - + Mg+ 5 - 6 Ca+ + 5 - - 6 - 5 - 6 5
- 10. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) ∗Efecto dilución (sustancia difusible) ∗Correlación con factores del ciclo ND 50% 10% 1% TAMPÓN DESTINO DEL DNA-fágico: ∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952) ∗Fagos con DNA modificado
- 11. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) ∗Efecto dilución (sustancia difusible) ∗Correlación con factores del ciclo DESTINO DEL DNA-fágico: ∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952) ∗Fagos con DNA modificado
- 12. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares * ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) ∗Efecto dilución (sustancia difusible) ∗Correlación con factores del ciclo DESTINO DEL DNA-fágico: ∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952) ∗Fagos con DNA modificado * = 3H-TdR * * * * * * *
- 13. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) ∗Efecto dilución (sustancia difusible) ∗Correlación con factores del ciclo DESTINO DEL DNA-fágico: ∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952) ∗Fagos con DNA modificado * Fagos T4/λ (sobrenadante) Bacterias (pellet)
- 14. ADSORCIÓN: ∗Fermentación de azúcares ∗Eficiencia de adsorción (Gabig 2002) ∗Efecto dilución (sustancia difusible) ∗Correlación con factores del ciclo DESTINO DEL DNA-fágico: Bacteria m+/r+ ∗Seguimiento del DNA (Hershey & Chase 1952) ∗Fagos con DNA modificado restrictasas metiltransferasas Bacteriofago Bacteria m+/r- Fagos con DNA modificado
- 15. OBTENCIÓN DE FAGOS CAPACES DE LISAR A LAS E.COLI AISLADAS DE QUESERIAS: •Co-evolución •Obtención de derivados virulentos de los fagos aislados de E.coli de queserias. CONTINUAR EL TRABAJO CON FAGOS CUYA DIANA SEAN OTRAS BACTERIAS ALTERANTES DEL QUESO
- 16. Técnicas previstas para la identificación, cuantificación y caracterizaciónM 1bacterias y 6 7 M 1 2 3 4 M de 2 3 4 5 bacteriofagos presentes en muestras de leche y queso: •PCR-múltiple , q-PCR y Rep-PCR •PFGE •Microscopía Óptica •TEM •RFLP •Medida de la cantidad de DNA sintetizado Líneas 2-4: RT-colis (3, 12, 59); 5: Klebsiella Corte con EcoRI: • Medida de cfu relacionada con la(1ul), oxytoca (30); 6: Enterobacter intermedious 1: P1 D.O (38);7: Hafnia alvey (7) 2: aRT1 (10ul); • Clonación y Secuenciación de fragmentos de (1ul); fágico 3: 6RT144 DNA 4: 6RT144 (10ul)
- 17. Uso de Bacteriófagos como Antimicrobianos en la Producción Quesera Elena López Acedo Cáceres 7 de Septiembre 2012
Notas del editor
- Nuestro trabajo ha consistido básicamente en la obtención, el análisis y la modificación de bacteriofagos especípicos contra E.coli. Una bacterias bien conocida como alterante en la producción quesera.
- El trabajo en el laboratorio ha requerido reunir una amplia colección de microorganismos. Las cepas de E.coli de laboratorio las hemos seleccionado de la colección española de cultivos tipo. Las silvestres se han aislado de muestras de leche y queso de distintas queserias. Y los fagos provienen de varias colecciones. Además de las 21 estirpes de fagos que hemos obtenido por inducción de profagos presentes en las E.coli de queserias con mitomicina C. En el caso de fagos atemperados hemos obtenido mutantes claros y virulentos tanto de las cepas de laboratorio como de las cepas aisladas de muestras lácteas
- C uando un fago encuentra a su bacteria diana, éste se adhiere a su membrana ‘ adsorción ’ . La adsorción puede estar mediada por receptores específicos de la membrana de la bacteria o por diversas estructuras de su pared celular. Seguidamente el fago inyecta su material genético en el citoplasma bacteriano. Una vez dentro pueden suceder dos cosas: 1.-Que el DNA-fágico se replique y de lugar a más fagos. En este caso tiene lugar el ciclo lítico, que finaliza con la lisis de la bacteria y la liberación de los nuevos fagos. 2.-Que el DNA del fago se integre en el cromosoma bacteriano y se quede ahí como profago, dividiéndose únicamente cuando lo haga la bacteria. A este ciclo se le denomina lisogénico y no solo no finaliza con la rotura de la bacteria, sino que además le confiere a ésta protección contra la infección por esos mismos fagos.
- En el genoma del fago lambda existe una región llamada de control, que incluye los genes cI, cII y cIII. Todos ellos son necesarios para establecer la lisogenia. cI codifica un represor, responsable de mantener el estado lisogenico por unión a operadores específicos. Se pueden obtener derivados llamados ’ claros ’ generando mutaciónes en cI, cII o cIII y derivados llamados ‘ virulentos ’ por mutaciones en los operadores. Estos mutantes son incapaces de seguir el ciclo lisogénico por lo que siempre lisan a las bacterias sensibles.
- Para observar el espectro de lisis de los fagos realizamos cruces de estrias de fagos y bacterias, como se muestra en la fotografia. En el caso de lisis se observa la ausencia de crecimiento tras el punto de cruce. Hemos realizado esta prueba cruzando todas las bacterias aisladas de queserias con todos nuestros fagos y en ningún caso se observa zona de lisis. Decidimos, pues, estudiar cual es el motivo por el que fagos específicos contra E. coli no son capaces de lisarlas. Con objeto de identificar qué etapa de la infección se encuentra afectada, hemos realizado distintos experimentos.
- El fago lambda necesita de la permeasa de la maltosa para inyectar su DNA. Las bacterias mal+ codifican una permeasa activa y deben ser sensibles a lambda. Una forma sencilla de verificar el caracter mal+ es el uso de medios de coloración sensible al cambio de pH que produce la fermentación del azúcar. En la fotografía se puede ver un resultado estandar. Todas la serie de RT aisladas de muestras lácteas resultó ser mal+.
- Para medir la eficiencia de adsorción de los fagos realizamos un experimento que consiste en inocular con el fago un cultivo bacteriano y tomar muestras a distintos tiempos. Estas muestras se centrifugan para separar el sobrenadante y medir las unidades formadoras de halos de lisis. Si la adsorción tiene lugar se observa una disminución del número de fagos libres en el sobrenadante al transcurrir unos minutos (como podemos ver en el control MG1655) y cuando no se produce, se mantiene el número de fagos libres en el sobrenadante. Hemos realizado este experimento con fagos lambda a todas las cepas de E. coli procedentes de muestras lácteas y el resultado es la no adsorción. Tenemos previsto realizar este experimento con el resto de fagos (T4, P1, phi80, …..) y verificar si el proceso de infección se interrumpe en esta misma fase.
- Resultados preliminares en los que a mayor dilución del lisado de fagos daban mayor número de halos de lisis, nos hicieron pensar que quizás hubiera una sustancia que impidiera la adsorción de los fagos. Para verificar nuestra hipotesis diseñamos este experimento en el que utilizamos el sobrenadante que resulta de centrifugar cultivos de bacterias de quesería. Con el se diluyen fagos lambda y se titulan sobre una cepa de laboratorio.
- La serie de valores de la izquierda se obtienen usando como cepa indicadora un cultivo de E. coli estandar. En la serie de la derecha se utiliza la misma cepa resuspendida en el mismo sobrenadante. En profundidad se muestran los resultado de diluir los fagos con concentraciones decrecientes del mismo medio. Los resultados muestran claramente que a menor concentración del sobrenadante se obtiene mayor número de halos de lisis y viceversa. Parece haber alguna sustancia difusible que impide o dificulta la lisis bacteriana por bacteriofagos.
- Pudiera ser que la adsorción tambien estuviera influenciada por la sintesis o desaparición de alguna proteina u otra estructura molecular en fases específicas del ciclo celular bacteriano. Para estudiar este fenómeno debemos sincronizar el cultivo bacteriano antes de su infección con los fagos. Un procedimiento de sincronización bien conocido se basa en el uso de bacterias auxótrofas para detener el ciclo en el inicio de la replicación cromosómica. Por ello debemos seleccionar bacterias con auxotrofias a partir de las obtenidas en queserias.
- Para estudiar si el DNA del fago se ha inyectado en la bacteria con éxito. Una técnica, basada en los experimentos de Hershey & Chase, consiste en marcar radiactivamente el DNA del fago. Para lo cual utilizamos timidina tritiada. Una vez obtenido el lisado de fagos marcados los utilizamos para infectar un cultivo bacteriano, del cual tomamos muestras a distintos tiempos, que centrifugamos para quedarnos con la fracción bacteriana.
- La radiactividad incorporada en las bacterias es una medida de la entrada del DNA fágico. Este experimento lo hemos realizado con los fagos T4 y lambda usando como control positivo una E.coli de laboratorio (MG1655) y una bacteria inespecifica de estos fagos como control negativo (Hafnia alvey). Como podemos observar, la gráfica muestra un numero elevado de cuentas para MG1655, mientras que son muy bajas en el control negativo, correspondiendo los valores observados prácticamente al ruido de fondo.
- Una posibilidad que puede quedar descartada con los experimentos descritos, es la existencia de sistemas de restricción que ataquen el DNA infectante. Una aproximación sencilla al estudio de esta posibilidad consiste en usar fagos con el DNA modificado, por el procedimiento de obtenerlos sobre bacterias m+/r-. Los virus así obtenidos los utilizamos para infectar a las cepas aisladas de las queserias. En los experimentos que hemos realizado hasta ahora no hemos observamos diferencias con fagos no modificados. No obstante hay que precisar que existen distintos sistemas de modificación-restricción y debe coincidir el de la bacteria m+/r- con el de la bacteria a la que queremos lisar.
- Una vez tengamos los resultados de estos experimentos con todos nuestros fagos podremos diseñar un método para obtener fagos capaces de lisar eficientemente a E. coli. Estamos realizando experimentos con los que obtener los fagos objetivo de forma directa, consistentes en mantener en contacto continuo las bacterias diana con nuestros fagos para favorecer la co-evolución con ayuda de mutágenos químicos. Otra linea experimental consiste en construir bacterias de laboratorio lisogénicas con los fagos atemperados aislados de las bacterias de las queserias, inducir mutaciones en los mismos fagos e infectar a las bacterias lisogenicas para seleccionar posteriormente los mutantes virulentos capaces de lisarlas. Probablemente, más adelante se extenderá esta búsqueda de fagos a cepas que lisen otras bacterias alterantes del queso.
- Estamos usando o proyectamos usar técnicas como la PCR, la electroforesis de campo pulsante, la microscopía óptica y electrónica de transmisión, la sintesis de DNA, etc, … (lo leo todo) Tenemos ya muchos resultados. Hemos avanzado bastante en el diseño de oligos que permiten detectar por PCR la presencia de E. coli o enterobacterias de manera específica y estamos avanzando en la caracterización molecular de los nuevos bacteriófagos aislados a partir de muestras de queserias.
- Nuestro trabajo ha consistido básicamente en la obtención, el análisis y la modificación de bacteriofagos especípicos contra E.coli. Una de las bacterias más perjudiciales en la producción quesera.