Bacteriófagosysus aplicaciones en seguridad alimentaria Pilar García Suarez. Dpto. de Tecnología y Biotecnología IPLA - CSIC

1. Bacteriófagos y sus aplicaciones en
seguridad alimentaria
Jornadas Técnicas Sobre Biocontrol en
Fermentación Láctea. 6 y 7 de Septiembre -
Complejo Cultural San Francisco - Cáceres
Pilar García Suárez
Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Villaviciosa,
Asturias, Spain

2. INSTITUTO DE PRODUCTOS
LÁCTEOS DE ASTURIAS
CSIC
Tecnología y Biotecnología de P.L.
Microbiología molecular
Fermentos lácticos y bioconservación
Físico-química
Microbiología y Bioquímica de P.L.
Probióticos, prebióticos y exopolisacáridos
Cultivos lácteos funcionales
Quesos WWW. IPLA.CSIC.ES
de
España

3. DairySafe Group
Ana Rodríguez
Beatriz Martínez
Pilar García
Clara Roces
Lorena Rodríguez
Diana Gutiérrez
Silvia Portilla
Ana B. Campelo
Rosana Calvo
Pablo González
Diana Lueces

4. ÍNDICE
1. SEGURIDAD ALIMENTARIA
2. BIOCONSERVACIÓN
3. LOS BACTERIÓFAGOS
4. PROTEÍNAS FÁGICAS
5. TERAPIA FÁGICA
6. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
7. PERSPECTIVAS DE FUTURO

5. SEGURIDAD ALIMENTARIA
Seguridad alimentaria en el mundo:
2.2 millones de muertes al año (OMS, 2012)
Países industrializados:
5,262 brotes en 2010 EU

6. SEGURIDAD ALIMENTARIA
CAUSAS:
- patógenos emergentes
- adaptación de patógenos conservación
- resistencia a antibióticos bacterias zoonóticas
NUEVAS TECNOLOGÍAS: - disminuir pérdidas económicas
- bajar los costes procesamiento
- cumplir las normativas legales
- impedir la trasmisión de patógenos
- satisfacer al consumidor (aditivos, poco
procesados, listos para comer, )
- sostenibilidad

7. BIOCONSERVACIÓN
La bioconservación es la utilización de
microorganismos, incluidos
bacteriofagos, sus productos
metabólicos o ambos para conservar los
alimentos (Montville & Chikindas,
2007).

8. BIOCONSERVACIÓN
* CULTIVOS INICIADORES Quesos artesanales asturianos
* BACTERIOCINAS Lactococina 972
* BACTERIOFAGOS Biocontrol de patógenos

9. LOS BACTERIÓFAGOS

10. LOS BACTERIÓFAGOS: abundancia y diversidad
- 1031 partículas (104-107 pfu/ml agua mar; 108 pfu/g suelo).
- Eliminan la mitad de la población bacteriana cada 48 h.
- Papel en la evolución de las bacterias acelerando la tasa de mutación.

11. LOS BACTERIÓFAGOS: abundancia y diversidad
- 5100 especies diferentes

12. LOS BACTERIÓFAGOS: morfología y ciclo de vida
Head
DNA
Tail
Tail fibers
Core

13. 1 Host recognition
2 Adsorption
Bacteriophage
3 Penetration
Environmental
signals Insertion
(prophage)
LYSOGENIC LYTIC 4 Replication
CYCLE CYCLE
5 Synthesis
Release 6 Assembly
7

14. LOS BACTERIÓFAGOS: morfología y ciclo de vida

15. PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
Endolisinas
PG hidrolasas asociadas a virión
1 Reconocimiento
2 Adsorción
Bacteriófago 3
Penetración
PEPTIDOGLICANO
Señales
ambientales Inserción
(profago) HIDROLASA
PEPTIDOGLICANO
CICLO CICLO
ESPACIO PERIPLASMICO LISOGÉNICO LITICO 4 Replicación
ESPACIO PERIPLASMICO
5 Síntesis MEMBRANA
HOLINA CITOPLASMA
Lisis 6 Ensamblaje
ENDOLISINA CITOPLASMA
7

16. PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
1
2
NAG
L-Ala D-Gln L-Lys D-Ala
NAG
NAM
NAM
D-Ala
D-Ala L-Lys
L-Lys D-Gln
D-Gln L-Ala
NAG
NAG
3
NAM
NAM
NAG
4
5
6 NAG
Peptidoglycan hydrolase activities and their bond substrate in the cell wall. 1: N-acetylmuramoyl-L-alanine
amidase; 2: interpeptide bridge endopeptidase; 3: N-acetyl-β-D-glucosaminidase; 4: L-alanoyl-D-glutamate
endopeptidase; 5: N-acetyl- β-D-muramidase; 6: Transglycosylase.

17. PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
Capacidad antimicrobiana: enzibióticos
S. aureus ClyS S. aureus LysH5
Daniel et al., 2010 Obeso et al., 2008

18. TERAPIA FÁGICA

19. TERAPIA FÁGICA: los primeros ensayos
COMMERCIAL PRODUCTS
Antibiotics Intestinal disorders(Phagesti)
production Bacterial infections (Phagepy,
Phage
PhageBioderm)
therapy Antibiotic therapy
Food safety (LISTEX P100,
ListShieldTM, EcoShieldTM)
1917 1920 1930 1940 Present
Crop safety (AgriPhage)
Animal health care (SPLX-1TM
Phage discovery Phage therapy in
PLSV-1TM, INT-401TM , BioTector)
former Soviet Union
and Poland Bacterial detection (FASTPlaque-
ResponseTM, FASTPlaqueTBTM,
MicroPhage MRSA/MSSA test,
MRSA screening test, MRSA/MSSA
blood culture test)
D’Herelle, 1917 G. Eliave Bacteriophage, Virology and Microbiology Institute

20. TERAPIA FÁGICA: algunos productos
Terapia humana

21. TERAPIA FÁGICA: ventajas y desventajas
Ventajas
Especificidad y capacidad de autorreplicación
Eficacia
Historia de uso seguro
No alteran las propiedades organolépticas
Las endolisinas no generan resistencia
Desventajas
Los fagos pueden llevar en su genoma genes codificantes de toxinas
Rango de huésped estrecho
Bacterias resistentes a fagos
Inactivación por las condiciones ambientales
Las endolisinas no actúan sobre gram negativos

22. TERAPIA FÁGICA: empresas
Company Country Web site Target
Gangagen USA http://www.gangagen.com/ Human infections
Intralytix USA http://www.intralytix.com/ Food safety
Omnilytics USA http://www.phage.com/home5.html Crops (Agriphage)
Phage Biotech Israel http://www.phage-biotech.com/ Human infections
Hexal Genentech Germany http://www.hexal-gentech.com/index.html Human infections
Novolytics UK http://www.novolytics.co.uk/ Human infections
Biophage Inc. Canadá http://www.biophagepharma.net/index.html Environment, human and animal
Biopharm Pharmaceuticals Georgia http://www.biopharmservices.com/Pharma.aspx Human infections
EBI Food Safety Netherlands http://www.ebifoodsafety.com Food safety.(Listex P100TM)
BigDNA UK (http://www.bigdna.com/) Animal infections
JSC Biochimpharm Georgia (http://www.biochimpharm.ge/) Human infections
Biocontrol UK (http://www.biocontrol-ltd.com/) Human infections
Innophage Portugal (http://www.innophage.com/) Human infections
Phico Therapeutics UK (http://www.phicotherapeutics.co.uk/) Human infections
Phage International USA, Georgia (http://www.phageinternational.com/) Human infections
Targanta Therapeutics USA (http://www.targanta.com/) Human infections
Viridax USA (http://www.viridax.com/) Human infections

23. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
Phage
Phage therapy Biofilms removal Biocontrol Biopreservation
Disinfection of Carcass meat
Reduction of
equipment contact raw products Final product
colonization
surfaces RTE products
Foodstuff Storage and
Animals Consumer
industry marketing
“Farm to fork”

24. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción

25. 1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN EL GANADO
E. coli O157:H7 fagos SH1 and KH1
Tratados
10E6 cfu
10E10 pfu/4 días
10E6 pfu/ml agua
control
Sheng et al. 2006

26. 1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN EL GANADO
Staphylococcus aureus
Endolisinas
12.5 µg each/gland
3.36-log decrease in CFU
Schmelcher et al., 2012

27. 1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN MANIPULADORES
Endolisina ClyS
Staphylococcus aureus
5 10E9 cfu
24h 1 mg endolisina ClyS
Daniel et al., 2010

28. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción

29. 2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
biofilm

30. 2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
Campylobacter jejuni
Fagos CP8, CP30 y PT14
Control tratados
Siringan et al., 2011

31. 2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
control endolisina
Endolisinas frente a S. aureus
Sass and Bierbaum 2007 Son et al. 2010

32. 2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
phi-IPLA5 biofilm S. epidermidis 7 días
biofilm
C PT C PT C PT
F12 CJBP1 CJBP3
Staphylococcus epidermidis S DS R
planctónico 3h
Gutiérrez et al., 2012

33. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción

34. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Leche S. aureus fagos phiH5 y phiA72
S. aureus
S. aureus + fagos
Pasteurizada Cruda semidesnatada Cruda entera
García et al., 2009

35. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
* Aplicación de la microbiología predictiva
40
35 100%
98%
95%
90%
Temperature, ºC
30
Temperatura (? C)
%Mortalidad
25
20
15
100 10
80 2 3 4 5 6 7 8 9 10
60 Log10 fagos 7,7
Log10fagos
40
Figura 12. Líneas de contorno en 2D del Modelo 4 indicando las regiones de inhibición y
20 supervivencia de bacterias. Log10 fagos que garantiza la Mortalidad 100% a 15 ?C.
Figura 11. Superficie de Respuesta del Modelo 4.
Los 3 ejes representan respectivamente el % de Mortalidad, la Temperatura, y el
log10 de la Concentración de Bacteriófagos Añadida.
Mortalidad = – 125,86 + 5,96·x + 28,76·y – 0,745·xy
X = temperatura Y = log concent fagos
Obeso et al., 2010

36. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
S. aureus fagos phiH5 y phiA72
CUAJADA ÁCIDA CUAJADA ENZIMÁTICA
10 7
10 10
9 fagos
BAL
8
8 8
7 S. aureus S. aureus
log CFU mL-1
log CFU mL-1
log PFU mL-1
log PFU mL-1
6
6 6 6
pH
fagos
5
4 4 4
5
3
2 2 2
pH S. aureus + fagos
1 S. aureus + fagos
0 0
0 4
0 50 100 150 200 250
0 5 10 15 20 25
time (min)
time (h)
Garcia et al., 2007

37. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Φ35 y Φ88 S. aureus en queso
fagos
S. aureus
Mixta Ácida
10 7 10 7
8 6 8 6
pH
6 5 6 5
pH
pH
4 4 4 4
S. aureus + fagos
2 3 2 3
0 2
0 2
d
d
es d
es d
a
cu he
h
es h
h
d
qu 15
30
ad
d
h
h
qu 5
qu o 8
e
24
qu 48
24
c
14
7
ch
o
3
6
aj
le
o
o
o
e
e
es
a
le
o
es
ch
ch
ad
es
qu
le
le
aj
qu
cu
Tiem po de m aduración
Tiem po de m aduración
Bueno et al., 2012

38. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Combinación de fagos y altas presiones
Tabla et al., 2012

39. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
L. monocytogenes phage P100 y A115 1 10E3 cfu/gr ml
3 10E8 pfu/ gr ml
6 días a 6°C
Guenther et al. 2009

40. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Endolisina LysH5 S. aureus
control
control
LysH5 (80U/ml)
LysH5 (160U/ml)
LysH5 (45U/ml)
Obeso et al., 2008

41. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
* Construcción de proteínas quimera
CHAP LYZ2
15 149 483 629
HydH5 6xHis
1 156 475 636
CHAP156 LYZ161
166 465
CHAP166 LYZ171
Endopeptidase SH3b
32 132 167
Lysostaphin
1 249
HydH5SH3b
1 156 739
CHAPSH3b
1 261
HydH5Lyso
1 884
Rodríguez-Rubio et al., 2012a

42. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Proteína CHAPSH3 S. aureus leche cruda
37 ºC RT
**
*** *** ** *** ***
*** *** ***
Time (min)
control
con proteína
Rodríguez-Rubio et al., unpublished

43. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
* Estudio de posibles sinergismos
0 0.078 Endolisina LysH5 5
(U/ml) control
0 LysH5
5 ng/ml
a
Nisin
nis
6 µg/ml
LysH5 + nis
García et al., 2010
Rodríguez-Rubio et al., 2012a

44. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
* Cultivos iniciadores con capacidad protectora
Sec LysH5
LysH5
LysH5
LysH5
nisK LysH5
nisR nisK LysH5
LysH5
nisR Pnis
LysH5
Lactococcus lactis
lysH5
SPLcn972
1 SPlcn972 lysH5 1533 nt
1
SPlcn972 LysH5 506 aa
76 108 nt
GTA GCT CAA GCT ATG CAA GCA AAA CTA ACT AAA
22 Val Ala Gln Ala Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys 32 aa
Rodríguez-Rubio et al., 2012b

45. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción

46. 4. DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN
Catalytic Binding
C N
Linker
L. monocytogenes
1-10 CFU/gr
Bacillus cereus
Kretzer et al., 2007
Clostridium perfringens

47. 4. DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN
CBD L. monocytogenes
Schmelcher et al., 2010
CFP, cyan fluorescent protein; GFP, green fluorescent protein; RS, RedStar protein

48. PERSPECTIVAS DE FUTURO
Agricultura Veterinaria
INT-401™
Clostridium perfringens
PLSV-1™
Salmonella
Acuicultura, tratamiento de aguas, desinfección de
superficies, detección de bacterias, etc.
EcoShield™ ListShield™
SALMONELEX™ LISTEX™
MICREOS MICREOS

49. Bacteriófagos y sus aplicaciones en
seguridad alimentaria
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
Pilar García Suárez
Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Villaviciosa,
Asturias, Spain